RICERCA ITALIANA     

Strategie di sopravvivenza dei batteri patogeni in risposta alle condizioni di stress nei siti anatomici dell'ospite: aspetti biologici, patogenetici e diagnostici

Università degli Studi di Verona

Abstract

Nel processo infettivo i microrganismi patogeni si confrontano con ambienti spesso ostili per la presenza di sostanze che ne ostacolano lo sviluppo prodotte dall’ospite e dall’eventuale microbiota indigeno o assunte a fini terapeutici. Come risultato di queste interazioni, la crescita microbica è inibita e il processo infettivo è di norma arrestato. E' stato proposto da diversi Autori che, come dimostrato nell’ambiente, anche nell’ospite infettato le condizioni di stress possano indurre l’attivazione da parte dei microrganismi di forme particolari di resistenza non rilevabili con i saggi colturali tradizionali, come lo stato vitale ma non coltivabile (VBNC) dei batteri. Questi microrganismi quiescienti, permanendo nell’organismo ospite, potrebbero “riattivarsi” ed essere coinvolti nella recrudescenza della patologia e nelle cosiddette forme ricorrenti. In questo progetto si intende analizzare questa possibilità e mettere a punto saggi non colturali che permettano di rilevare la presenza di forme resistenti allo stress di batteri patogeni. Durante la prima parte del progetto verranno studiate in vitro le risposte di alcuni patogeni batterici Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis a condizioni di stress che mimano quelle presenti in vivo in diversi siti infetti, e la capacità dei microrganismi in esame di mantenere ed esprimere, in tali condizioni, le caratteristiche di virulenza. A questo scopo, per riprodurre gli ambienti nei quali le cellule microbiche analizzate si vengono a trovare durante il processo infettivo, saranno allestite colture in diversi liquidi biologici quali urine, sangue, liquido peritoneale e liquido ascitico. Alle colture verranno aggiunte concentrazioni sub-inibenti degli antibiotici più utilizzati nei confronti dei patogeni in esame, per valutarne l’attività come agenti in grado di indurre lo stato VBNC. Inoltre verranno prese in considerazione altre molecole presenti nel sito d'infezione o derivanti dalle difesa immunitaria dell'ospite che potrebbero indurre nei batteri lo stato di non coltivabilità.Altri esperimenti saranno eseguiti in modelli sperimentali che simulano la formazione di biofilm batterici su cateteri venosi centrali (CVC) e in modelli clinici riferiti a pazienti con gravi patologie epatiche e con alterazioni intestinali che portano ad un maggior rischio di infezione. Nella seconda fase del progetto si intende valutare il ruolo di forme microbiche di resistenza allo stress nella genesi di diversi tipi di patologie infettive andandone a ricercare l’eventuale presenza e stato di attività nei vari materiali patologici mediante saggi molecolari. Per le indagini batteriche (che complessivamente riguarderanno la ricerca di E. coli ed altre enterobatteriacee, E faecalis, S. epidermidis e S. aureus), saranno analizzati campioni liquidi (urine, liquido pleurico, liquido articolare, liquido ascitico, peritoneale, e sangue) prelevati da diverse tipologie di pazienti, e frammenti di CVC. I vari campioni saranno raccolti dalle tre Unità di ricerca coinvolte nel progetto e successivamente inviati alle diverse unità competenti. La storia clinica di ciascun paziente sarà registrata, con particolare attenzione alla terapia antibiotica. Per ogni tipo di campione saranno approntati protocolli specifici di estrazione del DNA e/o RNA e verranno eseguiti saggi di PCR, multiplex PCR ed RT-PCR per l’amplificazione di sequenze specie-specifiche; nella ricerca dei patogeni batterici, verranno anche eseguiti esperimenti di amplificazione “broad range” (16S rDNA e 16S rRNA). A seconda del materiale e dei microrganismi in esame, le Unità metteranno a punto diversi protocolli di PCR quantitativa (real time PCR o cPCR).Complessivamente, i risultati ottenuti consentiranno di valutare il rischio che forme batteriche vitali di resistenza allo stress rappresentano per la salute dell’uomo. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Maria Del Mar LLEO' FERNANDEZ Università degli Studi di VERONA

Obiettivo del Programma di Ricerca

I principali obiettivi di questo progetto di ricerca sono:
1- Analisi della risposta di batteri patogeni per l'uomo a condizioni di stress indotte in vitro in modo da mimare quelle presenti in vivo, nei vari siti anatomici infettati.
2- Valutazione del mantenimento e dell'espressione di caratteristiche di virulenza in batteri patogeni che abbiano attivato diverse risposte allo stress (e.g. lo stato vitale ma non coltivabile).
3- Messa a punto di saggi non colturali (PCR, "broad-range" PCR, RT-PCR, multiplex PCR, PCR quantitativa) per la valutazione della presenza, della concentrazione e dello stato di attività di batteri patogeni in vari campioni clinici
4- Valutazione del ruolo di batteri non coltivabili nella patogenesi di malattie da infezione mediante analisi, con i saggi molecolari sviluppati, della loro presenza, concentrazione e stato di attività in campioni clinici negativi al colturale, derivanti da pazienti sintomatici e/o affetti da infezioni ricorrenti <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I microrganismi patogeni, sia di tipo procariotico che eucariotico, infettano l'uomo instaurando con esso una stretta relazione, che evolve determinando un danno a carico dell'ospite. L'ospite offre spesso un ambiente ottimale per lo sviluppo microbico, con ampia disponibilità di nutrienti e giusto grado di umidità e temperatura; tuttavia ciascuna nicchia ecologica, costituita dai singoli distretti anatomici, determina una serie di stress ambientali ai quali solo pochi microrganismi sono in grado di adattarsi. In queste situazioni stressanti, i batteri hanno evoluto specifici meccanismi che non consentono loro di dividersi ma bensì di conservare la propria vitalità. La mancanza di uno o più nutrienti induce nei batteri la fase di starvation o affamamento associata allo sviluppo nei microrganismi di uno stato di multiresistenza agli stress. Lo stato vitale ma non coltivabile(VBNC) è definito come quella condizione in cui le cellule sono vive, ma non vanno incontro ad una divisione sufficiente a dar luogo ad una crescita visibile nei terreni colturali tradizionali (4, 5). Questa condizione è stata descritta per molti batteri sia Gram-negativi che Gram-positivi, patogeni umani compresi (12). Alcuni studi hanno mostrato che queste cellule dormienti mantengono i propri fattori di patogenicità (24, 25) e li possono esprimere nuovamente in seguito al recupero della capacità divisionale (17, 23). Anche i batteri sottoposti ad un determinato tipo di stress specifico vengono temporaneamente danneggiati (injured bacteria) e non crescono in terreni selettivi ma sono in grado di rispondere attivando strategie diverse quali heat-shock response,SOS response, stringent response che mirano a riparare il danno. I diversi meccanismi di risposta allo stress sono stati descritti nella maggior parte dei batteri di interesse medico quali Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium, Legionella pneumophila, Listeria e molti altri (12).
Lo studio dei meccanismi molecolari alla base della risposta allo stress ha consentito di stabilire che esistono collegamenti tra tali meccanismi e quelli patogenetici che consentono ai batteri di causare infezione. Ad esempio, è stato dimostrato che alcuni geni di virulenza della Salmonella sono sotto il controllo del regulone rpoS che regola la produzione di proteine tipiche della fase stazionaria e di quelle coinvolte nella risposta ai singoli stress (22). Inoltre, i geni spv, associati a plasmidi di virulenza e necessari perché la Salmonella possa indurre una malattia sistemica, sono indotti durante la starvation da carbonio e fosforo (32).

In una significativa percentuale di infezioni nell'uomo non viene isolato l'agente eziologico; anche se in alcuni dei casi l'agente infettivo è di natura virale, non si può escludere il coinvolgimento di forme batteriche non recuperabili con i metodi microbiologici basati sull'esame colturale. Numerosi casi di infezione quali endocardite, infezioni dell'occhio e del sistema nervoso centrale, artriti infettive e varie altre dimostrano la presenza di molecole batteriche, soprattutto DNA specifico, nonostante l'esame colturale risulti negativo suggerendo la presenza di microrganismi non coltivabili ma possibilmente ancora vitali e capaci d'iniziare un processo infettivo. Il coinvolgimento di queste forme batteriche non coltivabili è stato preso in considerazione in modo particolare in alcune patologie quali le infezioni urinarie ricorrenti, endocarditi con referto colturale negativo e le infezioni propiziate dalla presenza di protesi e altri dispositivi medici. Tyttavia sono ancora necessari studi approfonditi per stabilire in modo definitivo il ruolo che queste forme batteriche possono avere nella patologia infettiva.

Le infezioni batteriche sono comuni nel paziente cirrotico. Nella cirrosi infatti vi é una predisposizione alla sovracrescita batterica, alla dismotilitá intestinale e a un'aumentata permeabilitá intestinale (34). Tutti questi fattori portano a un aumento della traslocazione batterica definita come passaggio di batteri vitali o loro prodotti dal lume intestinale ai linfonodi mesenterici, e che rappresenta il verosimile meccanismo alla base delle piú comuni infezioni nel paziente cirrotico, come la peritonite batterica spontanea, ma é anche la fonte di prodotti batterici come la endotossina che possono portare a un aumento della pressione portale, a una compromissione della funzione epatica e a un peggioramento della funzione emocoagulativa.
Mentre uno studio recente ha documentato che la presenza di DNA batterico (un indice surrogato della traslocazione batterica) in sangue e liquido ascitico è un evento frequente e dinamico in pazienti cirrotici (33), resta ancora per la maggior parte ignoto il ruolo nel processo della traslocazione batterica della rallentata motilità intestinale, del grado di permeabilità intestinale e della sovracrescita batterica presenti nel paziente cirrotico.

Le infezioni del tratto urinario rappresentano una delle più comuni affezioni (14) ed una significativa percentuale di casi può andare incontro a recidive (2, 11, 29). Il principale microrganismo uropatogeno responsabile di tali quadri è Escherichia coli che migrando dal tratto gastrointestinale all'area periuretrale può tramite l'uretra raggiungere la vescica e le alte vie urinarie. Molte infezioni ricorrenti del tratto urinario sono il risultato di re-infezioni con un microrganismo diverso (2), tuttavia una percentuale significativa di queste infezioni sono causate dallo stesso stipite di E.coli isolato durante l'affezione originaria (15,21, 28). Generalmente il tratto gastro-intestinale e la zona vaginale/periuretrale rappresentano la riserva di E. coli uropatogeni; recentemente un ruolo simile è stato suggerito anche per la vescica urinaria (30). Questi autori hanno dimostrato che il risultato dell'esame colturale delle urine non riflette necessariamente lo stato batteriologico della mucosa vescicale che può rappresentare, successivamente ad infezione urinaria acuta, il sito per una colonizzazione batterica cronica. L'epitelio della vescica può funzionare come una riserva persistente di batteri quiescenti in grado di ritornare a replicarsi attivamente e in grado di provocare infezione. Precedentemente, inoltre, è stato dimostrato utilizzando un modello murino, che gli stipiti uropatogeni di E.coli possono invadere l'epitelio della vescica e sono in grado di sopravvivere per mesi dopo l'infezione acuta nonostante l'assenza di batteriuria (21). Per studiare il ruolo di ceppi di E.coli vitali ma non coltivabili con metodi classici, nel caso di infezioni urinarie ricorrenti, Rivers e Steck (27) hanno analizzato campioni di urine e campioni bioptici di vescica e rene prelevati da topi inoculati con ceppi uropatogeni e trattati con antibiotici. La messa in evidenza mediante PCR del gene gfp in almeno un campione bioptico per il quale non erano stati identificati germi coltivabili ha suggerito che il trattamento antibiotico può non eliminare completamente le cellule di E.coli, le quali possono sopravvivere nello stato VBNC. Anderson e colleghi (1) hanno ritrovato batteri vitali nei campioni di urina che risultavano negativi all'esame colturale. Ciò ha suggerito la possibile localizzazione di cellule nello stato VBNC in aree del tratto urinario considerate sterili e che potrebbero sfuggire all'identificazione con l'impiego di tecniche standard.
Inoltre, infezioni di incerta eziologia sono state associate a batteri nello stato VBNC da Domingue et al. (8) che ha studiato la cistite interstiziale, una malattia di natura infiammatoria della vescica urinaria a eziologia non nota. Essi hanno dimostrato la presenza di geni batterici di Gram-negativi per l'rRNA 16S in campioni bioptici di vescica nel 29% dei pazienti affetti da cistite interstiziale. Inoltre forme filtrabili di dimensioni inferiori a 0.22 micron sono state isolate in colture ottenute da tessuti bioptici di tutti i pazienti con cistite interstiziale ed in un solo caso dai controlli. Queste forme contenevano acidi nucleici e assomigliavano per morfologia a batteri nello stato VBNC.
Al fine di sviluppare nuove e migliori terapie sia per le infezioni urinarie ricorrenti sia per quelle ad eziologia sconosciuta, la patogenesi delle infezioni del tratto urinario deve essere completamente conosciuta incluso il ruolo dei batteri difficilmente coltivabili o dormienti.

Malgrado i grandi progressi della terapia infusiva intravenosa nel corso degli ultimi anni, il rischio di infezione rimane un problema di primaria importanza (7, 26). La difficoltà a debellare le infezioni associate alla presenza di cateteri venosi centrali (CVC) è in gran parte dovuta alla rapida formazione di biofilm sulla superficie del materiale plastico di cui sono costituiti (9).
Un biofilm è un insieme di cellule microbiche associate ad una superficie ed inglobate in una matrice polimerica extracellulare secreta dalle cellule stesse. E'noto che lo stato sessile conferisce un vantaggio rispetto a quello planctonico.
I meccanismi con i quali i batteri possono aderire a superfici inerti sono ormai noti da tempo (16, 19). Presupposto allo sviluppo di biofilm è la formazione di una pellicola di molecole organiche, chiamata conditioning film (CF). La rapida moltiplicazione delle varie specie di batteri adesi insieme alla produzione di notevoli quantità di polimeri extracellulari e a un'ulteriore colonizzazione da parte di altre specie microbiche, portano ad un rapido sviluppo del biofilm (6, 31). I biofilm rappresentano riserve ambientali di patogeni e l'ambiente che si viene a creare al loro interno contribuisce alla selezione di microrganismi particolarmente virulenti e adatti a sopravvivere a condizioni di stress. Lo sviluppo di biofilm sulla superficie di un ampia gamma di dispositivi medici, tra cui protesi di varia natura e CVC, costituisce il maggior impedimento al loro uso prolungato.
In particolare le infezioni ematogene correlate all'uso di cateteri intravascolari sono conseguenti allo sfaldamento di parti di biofilm sviluppatisi sulla superficie dei biomateriali di cui sono costituiti (9). La formazione di biofilm sugli impianti medici ha portato alla caratterizzazione di una nuova malattia infettiva definita chronic polymer-associated infection (13). I CVC sono, tra i dispositivi medici a permanenza, quelli che determinano il maggior rischio di infezioni, con un tasso del 3-5% (18). Studi al microscopio elettronico hanno dimostrato che i biofilm sono universalmente presenti sui CVC e possono essere associati sia con la parte esterna che con il lume interno (26).
Gli organismi che colonizzano i CVC originano prevalentemente dalla cute. Poiché il dispositivo è in diretto contatto con il circolo sanguigno la sua superficie viene rapidamente ricoperta di piastrine, plasma e proteine come albumina, fibrinogeno, fibronectina e laminina che vengono a costituire un CF che favorisce la colonizzazione batterica. L'inglobamento all'interno dei biofilm conferisce ai batteri una particolare refrattarietà alla terapia antibiotica per la stentata diffusione del farmaco, per la particolare facilità dei microrganismi inglobati ad acquisire determinanti di resistenza, e per la trasformazione in forme inusuali di sopravvivenza come le forme batteriche vitali ma non coltivabili (VBNC) (20).
I patogeni predominanti nelle infezioni correlate alla presenza di CVC sono soprattutto i componenti della normale flora cutanea, con particolare riguardo agli stafilococchi soprattutto coagulasi-negativi, ma anche S. aureus. E' stato dimostrato che S. aureus aderisce a fibrinogeno, fibronectina e laminina e S. epidermidis alla fibronectina. Inoltre, questi microrganismi possono anche produrre adesine (9).
E' noto che le cellule che fanno parte di un biofilm trascrivono geni diversi e hanno diversi attributi fisiologici (tasso di crescita, resistenza agli agenti fisico-chimici) rispetto agli stessi organismi allo stato planctonico. D'altra parte, le situazioni di stress all'interno del biofilm riproducono per molti aspetti le condizioni di stress ambientale (carenza di nutrienti, variazioni di parametri fisico-chimici, come temperatura e pH) che favoriscono in natura lo sviluppo di queste forme. Per questa ragione non desta sorpresa il fatto che le infezioni croniche in cui sono coinvolti biofilm siano resistenti alla terapia antibiotica e ai meccanismi di difesa dell'ospite. Le infezioni ricorrenti associate alla presenza di cateteri potrebbero quindi essere dovute alla elusione della terapia e alla impossibilità di essere rilevati con le tecniche convenzionali, nei periodi di apparente remissione, da parte di batteri che entrano in uno stato VBNC. Per mettere a punto corrette strategie per prevenire e contrastare le infezioni correlate all'uso di CVC risulta quindi importante definire il ruolo svolto dalle forme batteriche VBNC. <<<