RICERCA ITALIANA     

EFFETTI NON EMOSTATICI DELLA TROMBINA: INTERAZIONE CON FATTORI DI CRESCITA, E SUO RUOLO NELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE, IN PROCESSI NEURODEGENERATIVI E IN CONDIZONI DI ALTERATA PERMEABILITA' VASALE

Università Cattolica del Sacro Cuore

Abstract

Il progetto si propone di studiare il ruolo non emostatico svolto dalla trombina in processi di attivazione endoteliale, angiogenetici, di aumentata permeabilità vasale e in fenomeni patologici neurodegenerativi, in particolare nel Morbo di Alzheimer.
Gli obiettivi specifici del presente studio saranno:
1) studio sugli effetti angiogenici e proliferativi della trombina su linee cellulari in coltura (cellule endoteliali [HUVEC] e
cellule di melanoma) in presenza ed assenza sia dei fattori di crescita che della trombina stessa;
2) identificazione di nuovi substrati della trombina fra i fattori di crescita più comuni: FGF-2, PDGF-BB, VEGF, e NGF, per mezzo di
tecniche di western-blot e HPLC;
3) studio sull'effetto proteolitico della trombina su FGF-2, PDGF-BB, PDGF-AA e NGF per determinare i parametri cinetici di
stato-stazionario relativi alla loro idrolisi. I siti potenziali di proteolisi saranno identificati mediante analisi della sequenza N-terminale e mediante spettrometria di massa;
4) sviluppo di modelli molecolari di interazioni fra trombina e FGF-2, mediante approcci computazionali di modelling molecolare;
5) sintesi di peptidi, che, sulla base dei risultati delle simulazioni di molecular modeling, possono inibire l'interazione
trombina-FGF-2. Il legame di questi peptidi (oltre FGF-2, da cui i peptidi sono derivati) con la trombina sarebbe allora studiato
tramite la tecnica della "surface plasmon resonance" (SPR).
6) dosare in maniera comparativa markers coagulativi, nelle urine e nel liquido cefalo-rachidiano di pazienti con MCI, Malattia di Alzheimer e individui senza patologia neurodegenerativa;
7) dosare in maniera comparativa i livelli di amiloide nel plasma e nel liquido cefalo-rachidiano, oltre al dosaggio della proteina precursore (APP) nelle piastrine, le sue isoforme e le variazioni nucleotidiche del gene APP;
8) correlare i livelli dei prodotti di attivazione della trombina con i livelli di amiloide e di gravità del deterioramento cognitivo;
9) correlare i livelli di markers trombinici con parametri neuroanatomici di danno alla risonanza magnetica nucleare e alla PET;
10) testare l'ipotesi che l'enoxaparina possa ridurre l'accumulo di sostanza amiloide come già documentato in un modello murino e ridurre progressione e severità del deterioramento cognitivo;
11) testare l'ipotesi che un inibitore della trombina in grado di attraversare la barriera emato-encefalica sia in grado di ridurre accumulo di sostanza amiloide e ridurre progressione e gravità del deterioramento cognitivo;
12) valutare gli effetti della presenza di C1-inattivatore, rC1-inattivatore e dell'eparina sulla membrana di cellule endoteliali in
coltura per definire il ruolo di tali inibitori della trombina nella regolazione della sua attività biologica inclusa la capacita di
aumentare la permeabilità dell'endotelio alle macromolecole.
13) valutare la possibilità di ottenere C1-inattivatore ricombinante recante una mutazione nel sito reattivo con aumentata attività
antitrombinica, conservando la capacità di fissarsi all'endotelio e le altre attività anti-inmfiammatorie. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Raffaele LANDOLFI Università Cattolica del Sacro Cuore

Obiettivo del Programma di Ricerca

I risultati che lo studio presente si prefigge di ottenere possono offrire nuove chiavi di comprensione degli effetti non emostatici della trombina in vivo. Particolare interesse sarà rivolto agli effetti trombinici sulla proliferazione cellulare, l'angiogenesi, al controllo della permeabilità vasale, ed all'interazione con proteine coinvolte nella patogenesi di patologie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer. Osservazioni cliniche molto comuni indicano che la trombina è coinvolta in funzioni cellulari quali l'angiogenesi e la proliferazione. Per esempio, si osserva comunemente che dopo trombosi di una grande vena, l'embolo si ricanalizza con nuovi vasi evidenziabili angiograficamente. Inoltre è riconosciuto che mentre la trombina nel plasma è inattivata velocemente dall'antitrombina, le molecole dell'enzima bloccate all'interno dei trombi sono protette e lentamente vengono rilasciate durante la trombolisi. Questa trombina bloccata fungerebbe da fattore di controllo angiogenetico di concerto con i fattori di crescita, tramite la chemiotassi di cellule endoteliali, mediando il loro fenotipo angiogenico. Inoltre, è riconosciuto il fatto che la trombina interagisce con vari costituenti della matrice endoteliale (ECM). La trombina immobilizzata su ECM è protetta dall'inattivazione dei suoi inibitori circolanti ed induce molte risposte cellulari.
Il legame della trombina all'ECM subendoteliale, mediante un corto sito di ancoraggio, lascia la maggior parte della molecola funzionale e disponibile per interazioni cellulari.
Infine, è ormai un dato consolidato che all'interno del sistema nervoso centrale esista tutta la machinery biochimico-molecolare della trombina senza bisogno di evocare una provenienza dalla circolazione sanguigna. D'altra parte, la trombina si accumula sia nelle placche che nei gomitoli neurofibrillari nel cervello di pazienti affetti da Malattia di Alzheimer. Infine, esperimenti in vitro hanno dimostrato che la trombina sottopone a proteolisi la proteina precursore dell'amiloide.
In conclusione, l'indagine sui meccanismi molecolari e cellulari collegati all'attività trombinica, proposta nel presente studio può contribuire a delucidare i seguenti punti:
1) il ruolo potenziale della trombina nel processamento idrolitico post-trascrizionale dei fattori di crescita. In particolare, lo studio cinetico di queste interazioni catalitiche si occuperà
dell'interazione trombina-FGF2. Il chiarimento della cinetica di questa interazione può aiutare a comprenderne l'eventuale ruolo
fisiologico nell'angiogenesi;
2) le condizioni sperimentali in cui la trombina, di concerto con l'azione di fattori di crescita, esercita una funzione pro- o
anti-angiogenica sulle cellule endoteliali normali o in una
linea cellulare neoplastica di melanoma in coltura;
3) i risultati possono fornire una base e una spiegazione razionale
per gli effetti non canonici della terapia antitrombinica (63-64). Ciò
apre la possibilità di sviluppare agenti che interferiscono con
l'azione angiogenica della trombina senza effetti sulla coagulazione del sangue. Tali agenti sarebbero più facili da usare
dell'eparina e di altri anticoagulanti nella pratica clinica e soprattutto sarebbero più specifici per i risultati desiderati.
4) valutare gli effetti della presenza di C1-inattivatore, rC1-inattivatore e dell'eparina sulla membrana di cellule endoteliali in
coltura per definire il ruolo di tali inibitori della trombina nella regolazione della sua attività biologica inclusa la capacita di
aumentare la permeabilità dell'endotelio alle macromolecole.
5) valutare la possibilità di ottenere C1-inattivatore ricombinate recante una mutazione nel sito reattivo con aumentata attività
antitrombinica, conservando la capacità di fissarsi all'endotelio e le altre attività anti-infiammatorie;
6) dosare in maniera comparativa markers coagulativi, trombina, frammento protrombinico, ed il complesso trombina-antitrombina nel plasma, nelle urine e nel liquido cefalo-rachidiano di pazienti con MCI, Malattia di Alzheimer e individui senza patologia neurodegenerativa;
7) dosare in maniera comparativa i livelli di amiloide nel plasma e nel liquido cefalo-rachidiano, oltre al dosaggio della proteina precursore (APP) nelle piastrine, le sue isoforme e le variazioni nucleotidiche del gene APP;
8) correlare i livelli di markers coagulativi e della trombina con i livelli di amiloide e di gravità del deterioramento cognitivo;
9) correlare i livelli di markers coagulativi e della trombina con parametri neuroanatomici di danno alla risonanza magnetica nucleare ed alla PET;
10) testare l'ipotesi che inibitori trombinici diretti (ximelagatran) o indiretti (enoxaparina) possano ridurre l'accumulo di sostanza amiloide come già documentato in un modello murino e ridurre progressione e gravità del deterioramento cognitivo.
11) testare l'ipotesi che fattori di crescita possano contrastare l'azione neurodegenerativa mediata dalla trombina;
12) studi di proteomica e di molecular modeling mirati alla caratterizzazione dell'interazione tra trombina e fattori di crescita, segnatamente l'FGF-2. Tali studi sono finallizati alla mappatura molecolare dei siti proteici coinvolti e al controllo biochimico-farmacologioco di tali interazioni. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

EFFETTI CELLULARI INDOTTI DALLA TROMBINA: CELLULE ENDOTELIALI.
A lungo riconosciuta per il suo ruolo nella cascata coagulativa, la trombina è ora riconosciuta regolare le sue cellule bersaglio,
quali le piastrine e le cellule endoteliali, in parte tramite l'attivazione di recettori correlati a G-Proteins (GPCR) (1-3). Il nuovo meccanismo tramite il quale la trombina attiva i relativi recettori coinvolge lo smascheramento di una sequenza criptica NH2-terminale del recettore che, rimanendo ancorata, si lega al recettore stesso e ne innesca la funzione (1). Inoltre, piccoli peptidi sintetici (5 - 6 amino acidi), basati sulla sequenza smascherata dalla proteolisi, possono attivare il recettore della trombina senza smascherare il ligando ancorato al recettore stesso (1). Dalla clonazione del primo recettore della trombina (ora chiamato
"recettore-1 proteasi-attivato", o PAR-1), sono stati clonati due nuovi membri della famiglia clivati dalla trombina (PAR-3 e -4)
(4-6), insieme ad un PAR aggiuntivo attivato dalla tripsina, ma non dalla trombina (ora chiamato PAR-2) (7). Le caratteristiche
chiave di distinzione della famiglia dei PAR sono 1) la loro sensibilità selettiva alle proteasi a serina (per esempio, PAR-1 e -4
possono essere attivati sia da trombina che da tripsina, mentre PAR-2 è attivato da tripsina e da altre proteasi a serina, ma non dalla trombina); e 2) le loro sequenze d'attivazione distinte [TRAP] (per esempio, SFFLRN per il PAR-1 del ratto, SLIGRL per il PAR-2 del ratto e GFPGKP per il PAR-4 del ratto). La trombina può inoltre generare segnali cellulari in conseguenza di meccanismi indipendenti dall'attivazione dei PARs: 1) formazione di fibrina e segnali cellulari regolati dal coagulo e mediati dalla matrice extracellulare, 2) attivazione di metalloproteasi (8), 3) sequenze peptidiche ad attività mitogenica/chemiotattica presenti nei dominii non catalitici della trombina (9-10) e 4) generazione di segnali innescati dall'interazione trombina-glicoproteina Ib (11-12).
Malgrado i molteplici substrati solubili ed i PARs che la trombina attiva, l'enzima mostra una rimarchevole specificità per il
limitato numero di legami peptidici che può idrolizzare efficientemente. I subsiti catalitici S1-S4 della trombina giocano un ruolo fondamentale nella specificità della trombina (13-14). La trombina ha una marcata preferenza per Arg nella posizione P1 (15).
Residui differenti possono essere accomodati nella posizione P2 (P, V, A, I, L), anche se è preferito il residuo Pro (14-18). Il residuo
P3 ha una particolare rilevanza per la trombina, poiché, a differenza di altre proteasi a serina prototipiche, i residui acidi in posizione P3 riducono drammaticamente la competenza catalitica dell'enzima, probabilmente a causa di un'interazione negativa con il residuo acido Glu192 dell'enzima (19-20). L'enzima può mostrare differenti effetti cellulari. Evidenza di ciò è data dal fatto che i segnali indotti dalla trombina nell' endotelio possono provocare un gran numero di
cambiamenti fenotipici, comprese alterazioni morfologiche cellulari, modificazioni della permeabilità, del tono vasomotorio, dei movimenti leucocitari, dell'espansione, della sintesi di DNA, dell'angiogenesi e dell'emostasi. Molti studi hanno suggerito che sia le interazioni sito attivo-indipendenti che sito attivo-dipendenti della trombina con il compartimento vascolare caratterizzano le molteplici attività nell' emostasi e nell'attivazione cellulare (21-22). La trombina in certe condizioni presenta una potente attività mitogenica sulle cellule endoteliali e sulle cellule muscolari lisce. Queste attività sono mediate da vie di segnali che sono innescate dai PARs (3). Tuttavia, altri studi hanno evidenziato un ruolo paradosso anti-angiogenico in vitro della trombina (23). In questi studi la trombina ha inibito nel topo l'angiogenesi FGF-2-indotta. Il nostro gruppo, nell'ambito di un PRIN finanziato nel 2003, ha recentemente confermato in uno studio preliminare la capacità della trombina di inibire la proliferazione cellulare in HUVEC stimolate da FGF-2 (24). L'attività proteolitica della trombina è risultata critica per questo effetto (24). L'FGF-2 è uno dei fattori più potenti che regolano la proliferazione e la chemiotassi, lo sviluppo degli organi e dei tessuti e il processo di riparazione tissutale (25-27). L'FGF-2 sembra svolgere un ruolo chiave nell' eziologia e la progressione di parecchi processi patologici quali il morbo di Alzheimer e di Parkinson (28-29), lo sviluppo e la progressione di tumori (30-33), l'aterosclerosi e la ristenosi dopo angioplastica (34). Un ruolo specifico è stato indicato per FGF-2 nell'angiogenesi tumorale (35-36) e nella differenziazione neuronale (37-38). La dimerizzazione dell'FGF-2 ed il legame ai recettori ad alta affinità sono considerati come punti necessari per indurre la fosforilazione del recettore dell' FGF e l'attivazione dei segnali. Gli studi basati su simulazioni molecolari in silico hanno indicato differenti regioni potenzialmente coinvolte nella dimerizzazione dell'FGF-2 (39-41), mentre la cristallizzazione (42-44) ha identificato i residui cruciali per attività dell'FGF-2 e l'interazione con l'eparina e i recettori ad alta affinità.
D'altro canto l'attivazione proteolitica della cascata coagulativa svolge un ruolo rilevante nella fisiologia dei tessuti, sia nel
compartimento extracellulare o a livello intracellulare tramite l'attivazione proteolitica del processo apoptotico da caspasi. Il ruolo di proteasi a serina come il fattore Xa, il fattore VIIa e la trombina è documentato bene all'interno della cascata coagulativa ed il rilascio di frammenti proteolitici da substrati come il fibrinogeno ed altre proteine extracellulari della matrice è riconosciuto avere un forte effetto sia sui fenomeni coagulativi che sulla proliferazione cellulare, l'adesione e l'angiogenesi (45-48) e sul controllo dei progenitori delle cellule endoteliali (46). Inoltre, l'attivazione/degranulazione piastrinica, che è uno dei punti iniziali nella emostasi primaria, è accompagnata da un rilascio massivo di fattori di crescita nella circolazione sanguigna e numerose evidenze collegano da un punto di vista funzionale la trombina con i fattori di crescita fibroblastici (49-52).

EFFETTI CELLULARI INDOTTI DALLA TROMBINA: CELLULE NEURONALI.
Durante gli ultimi 15 anni, la trombina, il suo precursore e i suoi recettori sono stati localizzati nel sistema nervoso in via di
sviluppo e in età adulta di diverse specie vertebrate. Inoltre, la trombina sembra mediare, attraverso l'attivazione di recettori
cellulari di superficie, uno spettro di riposte cellulari. Tali risposte influenzano la crescita delle cellule nervose (53-58), la morfologia (57,59), l'estensione delle fibre (60), e variazioni di secondi messaggeri intracellulari (61-65). Per lungo tempo si è pensato che la protrombina venisse sintetizzata esclusivamente nel fegato, ma studi recenti hanno dimostrato che mRNA per la protrombina è presente nel cervello (66-69). Frammenti di mRNA trascritto sono stati localizzati in diverse regioni del sistema nervoso neonatale e adulto del ratto inclusi il bulbo olfattorio, la corteccia, il talamo, l'ipotalamo, i gangli basali, l'ippocampo e il cervelletto (64). L'espressione dell'mRNA della protrombina è stata anche osservata in culture astrogliali umane (69). Queste osservazioni suggeriscono che la protrombina potrebbe attivarsi nel sistema nervoso centrale (SNC). Il ruolo principale della protrombina sembra essere quello di precursore della trombina. Ulteriori studi hanno fornito dati in supporto di una compresenza di trascritti del recettore di protrombina e trombina nel SNC (67-68), rinforzando l'ipotesi secondo cui la trombina e i suoi recettori avrebbero ruoli funzionali nel sistema nervoso. Diversi tipi cellulari nel sistema nervoso esprimono recettori per la trombina in condizioni normali. Inoltre, il recettore per la trombina è stato identificato in cellule di meningioma umano il che indicherebbe un ruolo di tali recettori nel tessuto patologico (70). Analisi con Northern blot hanno dimostrato l'espressione della trombina in colture di cellule neuronali di cervello di ratto (70-72). Inoltre, studi di ibridizzazione in situ hanno localizzato mRNA del recettore per la trombina sia nei neuroni che nella glia di specifiche aree del cervello e del midollo spinale (73). Variazioni intracellulari che possono portare ad alterazioni del calcio citosolico e probabilmente a morte neuronale coinvolgono cascate di secondi messaggeri. Diversi possibili meccanismi sono stati proposti in base alla scoperta che gli effetti dell'attivazione del recettore della trombina dipenderebbero dal tipo cellulare e dallo stress applicato (70-71,74-78). Il pre- trattamento del recettore della trombina con la tossina della pertosse sembra prevenire la fosforilazione della proteinchinasi attivata da mitogeni (MAPK), noto regolatore di eventi nucleari (79). Alte concentrazioni di trombina inducono anche morte cellulare in vitro attraverso meccanismi di apoptosi, come dimostrato dal clivaggio del DNA, frammentazione nucleare, e prevenzione dopo inibizione della sintesi proteica. E'stato documentato che l'espressione di specifici geni di morte cellulare è richiesta perché una cellula vada incontro a morte programmata. Studi più recenti mostrano che, dopo trattamento con trombina, la caspasi-3 viene attivata in colonie murine e colture di motoneuroni primitivi (80), e che gli inibitori della caspasi-1 e della caspasi-3 prevengono gli effetti deleteri della trombina (56,80). Nel loro insieme, queste osservazioni suggeriscono che la morte di cellule neuronali indotta dall'attivazione del recettore per la trombina è mediata dall'attivazione di caspasi endogene. La trombina inibisce la
differenziazione morfologica di diversi tipi cellulari in cultura, incluso quella di neuroni del midollo spinale o del sistema nervoso
centrale, di cellule di neuroblastoma, di cellule della astroglia e di cellule neuroepiteliali (53-56,58,81-82). Il ruolo svolto dalla trombina nella patogenesi del Morbo di Alzheimer pare essere di due tipi. Il Morbo di Alzheimer è caratterizzato dalla perdita di sinapsi, e dalla morte di neuroni che conseguono allo svilupparsi di placche di beta-amiloide e di gomitoli neurofibrillari in regioni specifiche del cervello. Nel Morbo di Alzheimer, la proteina beta-amiloide normalmente solubile è trasformata in fibrille insolubili che si depositano in placche. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che la trombina sottopone a proteolisi la proteina precursore della amiloide a livello del C-terminale e genera un frammento di 28KDa che è un potenziale intermediario nella produzione
della beta amiloide (83).
Studi recenti hanno dimostrato che la trombina sembrerebbe attenuare la degenerazione indotta dalla beta-amiloide (84); ciononostante in letteratura sono abbondanti le dimostrazioni del contrario. Ad esempio, la trombina reduce la retrazione dei neuroni, elimina le sinapsi ed aumenta la tossicità della beta-amiloide. Tecniche di immunostaining hanno rivelato che la trombina si accumula sia nelle placche che nei gomitoli neurofibrillari nel cervello di pazienti affetti da Morbo di Alzheimer, mentre non è presente nel cervello di persone della medesima età ma senza deterioramento cognitivo.
Nel tessuto cerebrale di pazienti affetti da Morbo di Alzheimer si realizza un aumenta anche dell'80% dei livelli di PN-1 libera, e
questo è associato ad un aumento dei complessi PN-1/trombina. Tuttavia il ruolo specifico della trombina nella patogenesi di processi neurodegenerativi, così come i relativi aspetti biochimico-strutturali, rimangono ancora da chiarire. <<<