RICERCA ITALIANA     

Fattori molecolari e immunopatogenetici nella storia naturale dell'infezione da Virus dell'Epatite C e nella risposta alla terapia antivirale.

Università degli Studi di Pavia

Abstract

Il virus dell'epatite C (HCV) è un agente trasmissibile ampiamente diffuso nel mondo responsabile di epatite cronica, cirrosi e tumore primitivo del fegato. L'infezione acuta guarisce raramente ed i meccanismi responsabili di un'evoluzione favorevole dell'epatite C o, più spesso, cronica sono ancora in gran parte sconosciuti. Attualmente si ritiene che l'evoluzione clinica dell'infezione sia fortemente influenzata dalla risposta immunitaria dell'ospite, la cui efficacia è tuttavia strettamente dipendente da fattori virologici. Infatti, sebbene una risposta immune di tipo cellulare è spesso presente nella fase acuta dell'infezione, la maggior parte dei pazienti evolve verso l'infezione cronica e tale fase è caratterizzata da una forte riduzione delle risposte immuni. Quali siano i meccanismi responsabili della soppressione delle funzioni dei linfociti T virus-specifici non sono stati ancora compresi. Un ulteriore problema dell'infezione da HCV è lo scarso successo delle terapie antivirali standard che consistono di peg-interferone alfa in associazione con l'analogo nucleotidico ribavirina. Per quanto sia la resistenza innata che farmaco-indotta vengano annnoverate tra le cause del fallimento terapeutico, sono ancora poco conosciute le basi molecolari della resistenza sia all'interferone che alla ribavirina. Sono anche poco conosciute le ragioni per cui le infezioni croniche da HCV siano associate frequentemente con manifestazioni extraepatiche come la crioglobulinemia e il linfoma non-Hodgkin a cellule B. E' chiaro, quindi, come sia indispensabile un approccio multidisciplinare integrato per chiarire gli aspetti ancora oscuri della patogenesi e virologia molecolare di HCV in modo da sviluppare le necessarie conoscenze di base per ottimizzare l'approccio terapeutico. Proprio a questo scopo un gruppo di ricercatori caratterizzati da una vasta e pluriennale esperienza nella immunopatogenesi, biologia molecolare, linfomagenesi, storia naturale e terapia dell'infezione da HCV si è riunito per proporre questo progetto. La coordinata utilizzazione delle singole conoscenze consentirà di affrontare e raggiungere tutti gli obiettivi delineati nella proposta. Quindi, per chiarire i difetti della risposta immune cellulare responsabili dell'evoluzione cronica della malattia così come la patogenesi del danno tissutale nell'infezione cronica, verrà effettuato sia uno studio prospettico delle risposte immuni cellulari in un ampio gruppo di individui con infezione acuta che una analisi dettagliata dei linfociti T con funzione regolatoria. Le basi molecolari della resistenza di HCV sia essa innata e/o indotta da IFN-alfa e/o ribavirina sarà studiata concentrando l'attenzione sulle interazioni tra NS5A e le proteine dell'ospite per le risposte all'IFN-alfa e sui determinanti genetici nell'ambito del gene NS5B che possono influenzare la risposta e l'emergenza di ceppi resistenti alla ribavirina. Inoltre, poiché la continua stimolazione antigenica potrebbe rappresentare, attraverso la proliferazione dei linfociti B, l'evento iniziale della linfomagenesi, verrà anche studiato il coinvolgimento di alcune proteine virali in questo processo. A tale scopo si verificherà se le mutazioni trovate in E2 nei pazienti con crioglobulinemia possano influenzare la struttura conformazionale delle proteine favorendo la proliferazione delle cellule B. Infine, per approfondire a livello molecolare la patogenesi dei linfomi associati a HCV e per migliorarne il loro trattamento terapeutico, verrà affrontato lo studio delle anomalie genetiche responsabili della transizione da linfoproliferazione benigna (cryo-II) a linfoma non-Hodgkin. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Mario Umberto MONDELLI Università degli Studi di PAVIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il principale obiettivo di questa proposta di ricerca e' quello di analizzare in dettaglio fattori virali e dell'ospite coinvolti nella patogenesi e nella storia naturale dell'infezione da virus dell'epatite C dal momento che l'acquisizione di dettagliate informazioni in questo settore rappresenta un requisito fondamentale per lo sviluppo di strategie profilattiche e terapeutiche contro HCV.
A questo scopo, e' stato creato un gruppo di ricerca cui partecipano ricercatori con esperienza pluriennale in questo specifico settore , con competenze diverse ma, allo stesso tempo, complementari al fine di garantire un approccio completo e multidisciplinare in stretta collaborazione tra i gruppi.
Per il raggiungimento dell'obiettivo finale il programma prevede molte fasi intermedie cui prenderanno parte le diverse unita' di ricerca.
Tra i fattori virologici, la variabilita' virale sara' analizzata nel contesto della resistenza di HCV innata o indotta dal trattamento con IFN-alfa/ribavirina e nella patogenesi dell'espansione clonale delle cellule B nel corso della crioglobulinemia mista di tipo II.
A questo scopo, il programma del Prof. Alberti sara' indirizzato alla comprensione dell'effetto delle mutazioni di HCV nell'interazione con le proteine cellulari come PKR o nella modulazione dell'espressione dei geni coinvolti nella via di trasduzione del segnale dell'IFN-alfa. Il sequenziamento del gene di NS5B in un vasto gruppo di pazienti non responsivi alla terapia combinata sara' effettuato per confermare la potenziale capacita' della ribavirina di selezionare positivamente le sostituzioni aminoacidiche precedentemente riportate nelle varianti resistenti al farmaco. Un ulteriore obiettivo di questo gruppo, che e' perfettamente coordinato con quello del prof. Mondelli, e' quello di analizzare i meccanismi responsabili della linfomagenesi indotta da HCV attraverso l'interazione della proteina ricombinante E2, clonata da isolati di pazienti con crioglobulinemia di tipo II, con la molecola CD81 espressa dai linfociti B. Il gruppo del prof. Alberti ha dimostrato l'esistenza di specifiche mutazioni nella regione ipervariabile 1 (HVR1), anche se resta di fondamentale importanza verificare se queste mutazioni sono capaci di indurre un'anormale proliferazione dei linfociti B.
In accordo con l'ipotesi di una "signature" virale caratteristica della crioglobulinemia sintomatica e considerando la complessa interazione di diverse regioni della proteina del rivestimento virale E2 con la molecola CD81, il gruppo del prof. Mondelli si occupera' di accertare la presenza di mutazioni nell'intera sequenza di E2 in un grande numero di pazienti con crioglobulinemia sintomatica e non sintomatica. Il ripetersi di specifici motivi in regioni specifiche della proteina del rivestimento virale potrebbe fornire una base molecolare per la diversa immunogenicita' delle proteine dell'envelope crioglobulinemiche e non crioglobulinemiche. Il progetto del prof. Fiorilli, complementare a quello del prof. Mondelli e a quello del prof. Alberti,sara' incentrato sullo studio dei meccanismi patogenetici della linfoproliferazione e della linfomagenesi con particolare interesse all'identificazione delle anomalie cromosomiche e molecolari che determinano il passaggio dalla linfoproliferazione benigna (crioglobulinemia di tipo II) al linfoma maligno. Infine, il progetto della dott.ssa Del Porto sara' focalizzato sull'identificazione dei potenziali difetti funzionali delle cellule T associati all'infezione cronica da HCV e sul ruolo che i diversi tipi di cellule regolatorie hanno nello stabilire un duraturo stato infiammatorio fondamentale per la sopravvivenza del virus e dell'ospite.
Pertanto, da quanto riportato, il gruppo di ricerca cosi' costituito è caratterizzato da un elevato livello scientifico e competenze sinergiche che saranno di fondamentale importanza per delucidare I meccanismi che regolano l'interazione HCV/ospite.
Le conoscenze acquisite con gli studi effettuati da questo progetto di ricerca, ci consentira' di migliorare gli approcci terapeutici nei pazienti con infezione cronica da HCV. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il virus dell'epatite C (HCV) é un agente trasmissibile diffuso in tutto il mondo, causa di epatite cronica, cirrosi e carcinoma epatico (1). Si stima che l'HCV infetti fra 170 e 350 milioni di persone nel mondo ed é considerata la prima indicazione di trapianto del fegato negli Stati Uniti. L'HCV é un virus a RNA a singola catena di circa 9600 nucleotidi che é stato classificato in un genere separato, Hepacivirus, nella famiglia delle Flaviviridae (2). Il genoma virale contiene un unico "open reading frame" che presenta alla due estremità regioni non codificanti e che codifica per una poliproteina di circa 3000 aminoacidi processata da proteasi sia cellulari che virali per generare proteine strutturali (core, envelope 1 e 2) e nonstrutturali (NS designate NS2-NS5). HCV é caratterizzato da un alto grado di variabilità genetica e, sulla base della omologia di sequenza nucleotidica in regioni del core, E1 e NS5, é stato classificato in 6 genotipi e più di 50 sottotipi (3). Tale variabilità é dovuta ad un alto tasso di mutazioni (stimato 1.5-2x10^-3 sostituzioni per sito genomico/anno) che risulta dalla combinazione di una alta replicazione virale (circa 10^10 e 10^12 virioni al giorno) e della mancanza di attività esonucleasica "proof-reading" della RNA polimerasi (4). Pertanto l'HCV circola in vivo, anche in un singolo individuo infetto, sotto forma di popolazione di genomi differenti, seppure altamente omologhi, che si distribuiscono secondo un modello definito quasispecie (5). In seguito ad infezione da HCV, alti titoli virali sono evidenziabili nel siero entro uno settimana, mentre l'attivazione delle risposte cellulari e umorali risulta sono ritardata di 1 e 2 mesi, suggerendo che il virus sia in grado di silenziare la risposta immune adattativa. Approssimativamente 8-12 settimane dopo l'infezione, contemporaneamente all'aumento dei livelli delle ALT seriche, i titoli virali diminuiscono. La maggior parte dei pazienti (55-86%) non e`in grado di eliminare il virus nei primi 6 mesi e sviluppa epatite cronica con viremia persistente che tipicamente progredisce da forme asintomatiche verso forme più gravi di danno epatico inclusi cirrosi e carcinoma epatocellulare. Si stima che circa il 20% degli individui con infezione persistente va incontro a cirrosi e il 30-50% di questi sviluppa il carcinoma epatocellulare (HCC) approssimativamente entro 10 anni (6). L'idea attuale è che l'immunità cellulo-mediata giochi un ruolo cruciale nell'eliminazione del virus dal momento che, nei pazienti che eliminano spontaneamente il virus, sono state osservate forti e multispecifiche risposte CD4+ e CD8+ (7-10).Tuttavia, recenti dati indicano che, sebbene alcuni individui siano in grado di montare delle risposte immuni cellulari nella fase acuta dell'infezione, la maggior parte di essi sviluppa l'infezione cronica. Inoltre, stabilitasi l'infezione persistente, le risposte cellulari sia CD4+ che CD8+ risultano attenuate e difficilmente rilevabili ex-vivo (11,12).Tra i meccanismi utilizzati dal virus per eludere la risposta immunitaria cellulo-mediata precoce, la capacità di HCV di indurre difetti funzionali nelle cellule T CD8+ o di eludere le risposte T citotossiche attraverso mutazioni in epitopi T CD8+ sono stati descritti. Infatti, sono stati osservati una riduzione della capacità proliferativa, dell'attività citotossica e della secrezione di IFN-gamma a carico dei linfociti T CD8+ effettori circolanti e il ripristino delle funzioni effettrici da parte di IL-2. Tali dati suggeriscono che difetti nella produzione di IL-2 possono interferire con il segnale necessario al completo differenziamento dei CTL nell'uomo (13). Di grande interesse e' il fatto che l'inibizione del differenziamento dei CTL effettori e` stata correlata alla capacita` della proteina core di HCV di inibire la trasduzione del segnale strumentale alla produzione di IL-2 nei linfociti T (14). Inoltre, recenti dati, che dimostrano la selezione di mutazioni di escape in epitopi immunodominanti della poliproteina di HCV, suggeriscono che anche meccanismi antigene-specifici contribuiscono al fallimento dell'immunita' cellulo-mediata nella fase acuta. Un altro aspetto rilevante dell'infezione cronica è il ruolo delle cellule T regolatorie nel mantenere un moderato processo infiammatorio nel tempo, favorevole alla simbiosi virus/ospite. Recentemente, in uno studio, e' stato dimostrato che nel fegato degli individui con epatite C cronica un massivo infiltrato di linfociti T effettori CCR7- CD8+ con inappropriate funzioni proinfiammatorie si associa alla presenza di cellule T regolatorie CCR7- CD8+ producenti elevati livelli di IL-10 suggerendo che esse giochino un ruolo chiave nel controllo delle risposte CTL effettrici nel fegato (15). E' stato ipotizzato che, nei casi in cui il virus riesca ad eludere le risposte CTL effettrici evocate nelle fasi precoci dell'infezione, le cellule regolatorie possono intervenire al fine di contenere le risposte patologiche mediate dai linfociti T CD8. In tal modo, queste ultime sarebbero sufficienti a contenere l'infezione e a mantenere un numero stabile di cellule della memoria. Questo equilibrio permetterebbe il perdurare di un moderato processo infiammatorio nel tempo, favorevole alla sopravvivenza sia del virus che dell'ospite. Tuttavia attualmente non è noto se anche altri tipi di cellule regolatorie possano contribuire, attraverso diversi meccanismi di soppressione, al controllo delle risposte T antivirali e la comprensione di questo aspetto potrebbe contribuire fortemente a fornire delucidazioni sulla patogenesi del danno tissutale durante l'infezione cronica da HCV.
La sola terapia attualmente disponibile per l'epatite cronica, basata su Peg-interferone alfa in combinazione con ribavirina, ha un'efficacia limitata poiché induce risposte antivirali sostenute soltanto nel 38-80% dei pazienti trattati in dipendenza dal genotipo virale (16). Lo studio dei fattori virali e dell'ospite associati al diverso esito del trattamento ha mostrato che si passa da una frequenza di risposta del 38-52%, in individui infettati con HCV di genotipo I, ad una frequenza superiore al 90% in individui infettati con HCV di genotipi 2 e 3 (17). Lo resistenza virale innata o indotta dall'uso dei farmaci è considerata il motivo principale del fallimento della terapia; tuttavia, resta da definire quali siano le basi molecolari della resistenza ad interferone e/o a ribavirina. L'effetto antivirale dell'IFN-alfa è mediato da alcune proteine intracellulari come MxA, PKR indotte in seguito al legame dell'IFN-alfa con la porzione extracellulare del suo recettore transmembrana e alla successiva attivazione della via di trasduzione del segnale Jak/STAT. Ci sono, comunque, molte evidenze che HCV interferisca con l'azione antivirale dell'IFN-alfa. In questo contesto, il meccanismo che è stato caratterizzato più dettagliatamente finora riguarda HCV di genotipo 1b il quale, com'è noto, è quello che sviluppa più facilmente di altri genotipi resistenza alla terapia. In particolare, è stato dimostrato, sia in vitro sia in vivo, che NS5A di genotipo 1b può legare e bloccare PKR e che la sostituzione di alcuni amminoacidi in una porzione discreta di NS5A (denominata ISDR) abroga il legame NS5A/PKR (18).Tuttavia, i risultati degli studi sono controversi e potrebbero esistere altri meccanismi utili a spiegare come la proteina NS5A antagonizza l'azione dell'IFN-alfa.
L'uso di ribavirina in combinazione con IFN-alfa ha significativamente aumentato la percentuale dei casi con risposta virologica sostenuta tra i pazienti trattati e questo è probabilmente dovuto ad una riduzione del numero di pazienti che riattiva dopo la sospensione del trattamento. Sebbene l'esatto meccanismo attraverso il quale agisce la ribavirina è tuttora incerto, è stato dimostrato che la ribavirina ha un effetto mutagenico diretto essendo in grado di aumentare di circa tre-quattro volte il tasso di mutazione della RNA polimerasi di HCV (NS5B)(19). Recentemente, l'identificazione di specifiche mutazioni nel gene NS5B, sia in isolati virali da pazienti non-responsivi alla terapia, sia in repliconi, è stata associata alla comparsa di ceppi resistenti di HCV a ribavirina, avendo questi una RNA polimerasi meno sensibile all'incorporazione dell'analogo nucleosidico ribavirina (20). Tuttavia, non è noto attualmente se questi effetti mutagenici possono essere dimostrati nella terapia combinata IFN-alfa/ribavirina.
Stabilitasi l'infezione persistente, possono insorgere una serie di manifestazioni extra-epatiche e disordini linfoproliferativi, specie a carico dei linfociti B, compresi la crioglobulinemia mista di tipo II e il linfoma non Hodgkin (NHL) (21,22). La crioglobulinemia sintomatica e asintomatica si sviluppa rispettivamente nel 50% e nel 2% dei pazienti con infezione da HCV e, inoltre, si stima che, in Italia, approssimativamente il 5% dei linfomi non-Hodgkin (NHL) sia causato da HCV (23,24).
Diversi studi indicano che la crioglobulinemia di tipo II e il B-NHL costituiscono fasi sequenziali di una risposta patogenica dei linfociti B all'HCV (22). La crioglobulinemia di tipo II è caratterizzata da un' espansione monoclonale benigna di una specifica popolazione di cellule B esprimenti un anticorpo della classe delle IgM con attività di fattore reumatoide (RF) e la cui regione variabile è più comunemente codificata dalla regione variabile VH1-69 (21). Questo anticorpo ha le caratteristiche di un "anticorpo naturale" polireattivo. L'abnorme espansione delle cellule B esprimenti VH1-69 nella crioglobulinemia di tipo II è probabilmente dovuta alla caratteristica di queste cellule di sfuggire ai meccanismi di controllo omeostatico (25). Nel corso di questa incontrollata espansione monoclonale, possono verificarsi anomalie genetiche con conseguente trasformazione neoplastica (22,25). Attualmente, fino al 15% dei pazienti con crioglobulinemia di tipo II sviluppa nel tempo B-NHL (22).
L'espansione monoclonale delle cellule B nel corso della crioglobulinemia di tipo II si arresta se viene meno la stimolazione antigenica da parte di HCV in seguito all'eradicazione dell'infezione con l'uso di agenti antivirali (26-28). Recentemente, alcuni studi hanno indicato che i linfomi maligni associati con l'infezione da HCV possono regredire in seguito al trattamento antivirale come dimostrato per i linfomi della milza a cellule B (29-31). Alcuni dati preliminari suggeriscono che, nei linfomi associati all'infezione da HCV, la presenza di anomalie genetiche rende le cellule neoplastiche indipendenti dalla stimolazione antigenica esercitata dal virus e, di conseguenza, refrattarie alla terapia antivirale. Nella crioglobulinemia di tipo II sono stati descritti un riarrangiamento ed un'overespressione di bcl-2 ma non sembra che questa anomalia possa svolgere un ruolo critico nella genesi del linfoma indotta da HCV (22).
Recentemente, in un linfoma della milza a cellule B sviluppato da un paziente con crioglobulinemia di tipo II, e' stata descritta una trisomia 3q, un'anomalia comunemente osservata nella zona marginale dei linfomi a cellule B (29). Tuttavia, non ci sono studi sistematici riguardanti le anomalie genetiche nei linfomi associati all'infezione da HCV (22).
L'esatto meccanismo attraverso il quale HCV induce un'espansione clonale potente e selettiva di cellule B è tuttora ignoto. Studi recenti suggeriscono che l' interazione della seconda proteina dell'involucro di HCV (E2) con la molecola CD81, abbassando la soglia di attivazione delle cellule B, potrebbe essere la causa di questo processo patogenetico caratteristico della crioglobulinemia e dei linfomi a cellule B associati con l'infezione da HCV (32,33).
L'analisi funzionale dell'interazione tra la proteina E2 di HCV e il CD81 ha evidenziato l'esistenza di almeno due distinte regioni in E2 capaci di interagire con il CD81. Una di queste regioni è localizzata tra gli aminoacidi 613-618 e si pensa essere essenziale per il riconoscimento mentre un secondo elemento, che include le regioni ipervariabili HVR1 e HVR2, potrebbe modulare il legame della proteina E2 al suo recettore (34). Tali risultati dimostrerebbero un meccanismo complesso d'interazione fra le due regioni ipervariabili e la proteina E2 di HCV nel legame al recettore CD81.
Considerata l'importanza della regione HVR1 nel legame al CD81 e il suo potenziale coinvolgimento nella patogenesi dell'espansione clonale delle cellule B, nel corso della crioglobulinemia, alcuni autori hanno esaminato le sequenze di queste regioni isolate da pazienti con crioglobulinemia nel tentativo di mostrare pattern di mutazioni tipici di questa patologia extraepatica associata ad HCV. Inoltre, sono state descritte mutazioni inserzionali nella posizione 385 all'interno di HVR1 in una percentuale relativamente alta di pazienti con crioglobulinemia asintomatica (35). Queste osservazioni potrebbero suggerire l'esistenza di una signature del virus in presenza di crioglobulinemia.
Inoltre, la ripetizione di specifici motivi in particolari regioni della proteina del rivestimento virale potrebbe fornire le basi molecolari per l' eventuale diversa immunogenicità delle proteine del rivestimento virale ottenute da pazienti crioglobulinemici e non-crioglobulinemici. <<<