RICERCA ITALIANA     

Sindromi Mielodisplastiche: modelli patogenetici e nuove possibilità terapeutiche

Università Cattolica del Sacro Cuore

Abstract

BACKGROUND
Le sindromi mielodisplastiche (MDS) comprendono un gruppo eterogeneo di disordini clonali della emopoiesi, caratterizzati da un'emopoiesi attiva, ma inefficace, che determina una grave pancitopenia e che può evolvere in leucemia mieloide acuta. L'espansione del clone abnorme è caratterizzata ,dal punto di vista morfologico, da segni di displasia,da ritardo della differenziazione, difetti della funzione cellulare e instabilità genetica. Anomalie citogenetiche sono dimopstrabili nel 40-50% delle MDS primitive e fino all'80% dei pazienti con MDS secondarie. Lo specifico cromosoma interessato, il numero e la complessità delle alterazioni cromosomiche inflenzano significativamente la prognosi, e questo dato è ben recepito dalla recente classificazione WHO. Tuttavia, l'evoluzione della mielodisplasia è anche influenzata da eventi epigenetici. Per esempio, la metilazione e quindi il silenziamento del proto-oncogene p15ink4b si ritrovano nel 70% dei pazienti che evolvono in leucemia mieloide acuta. Inoltre, osservazioni precliniche suggeriscono che le interazioni tra il clone maligno e il microambiente servono a creare un "milieu" ostile che accentua l'emopoiesi inefficace, che è poi il marchio della mielodisplasia e deriva dalla scarsa risposta dei progenitori emopoietici agli stimoli trofici e dall'eccesso di citochine inibenti. Questo modello è supportato da studi che, mediante la neutralizzazione delle citochine, dimostrano la diretta relazione tra produzione di TNF-alfa e il grado di apoptosi secondaria alla produzione di radicali liberi e all'ossidazione del DNA nei progenitori emopoietici clonali. Recenti ricerche indicano inoltre che molecole angiogenetiche prodotte dal clone maligno facilitano il rinnovamento della staminale maligna e nello stesso tempo promuovono la formazione di citochine pro-apototiche. Considerando questa complessa patogenesi della SMD, si sono recentemente aperte nuove possibiltà terapeutiche mirate, quali ad es. i farmaci demetilanti, gli antiangiogenetici e gli anti-TNF.


OBIETTIVI
1) STUDI DI GENETICA CELLULARE E MOLECOLARE.
a. identificazione di nuovi meccanismi genetici e molecolari importanti nella patogenesi delle SMD e le altre malattie mieloproliferative, utilizzando sia la citogenetica classica che la FISH, l'ibridizzazione genomica comparativa ed i microarray;
b. Caratterizzazione genetica e molecolare del cromosoma 3, ai punti di rottura 3q21 e 3q26, con analisi molecolare dei geni EVI1, MEL1,RPN e dei geni di fusione RPN1-EVI1 e MEL-RPN1;
c. Analisi molecolare delle mutazioni di tirosin-kinasi specifiche (FLT3, PDGFR, VEGFR e AKT);
2) STUDI DELLE ALTERAZIONI EPIGENETICHE.
a. Pattern di metilazione di alcuni geni regolatori la riparazione del DNA, l'angiogenesi e l'apoptosi;
b. Pattern di acetilazione istonica del DNA delle cellule CD34+ derivate da pazienti con MDS;
c. Modulazione dell' attività trascrizionale indotta dall'ATRA e dagli inibitori della acetilasi su linee cellulari leucemiche e su cellule CD34+ da pazienti con MDS;
d. Rapporti tra alterazioni genetiche ed epigenetiche (espressione di EVI1 e attività deacetilasica)
3) Studi in citofluorimetria per valutare
a. espressione di molecole di adesione (Lecam1, ICAM1, VLA-4, VLA-5, Thy1 CD90) e antigeni differenziativi (CD45, CD34,HLA-DR, CD13, CD33, CD15, CD11b, CD16) da parte di cellule midollari di pazienti affetti da SMD, utilizzando come gruppi di confronto campioni di midollo ottenuti da pazienti affetti da leucemia mieloide acuta de novo e midolli di soggetti normali;
b. alterazioni dell' apoptosi mediante analisi di proteine quali apo/fas (CD95), bax, bcl-2, annessina V e Caspasi-3.
4. Valutazione degli effetti biologici dei trattamenti con agenti ipometilanti e acetilanti.
5. Associazione specifica tra alterazioni genomiche e pattern morfologico e immunologico, in accordo con la classificazione WHO.
6. Ruolo terapeutico di inibitori specifici delle tirosin-kinasi, del TNFalfa e dell' angiogenesi. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giuseppe LEONE Università Cattolica del Sacro Cuore

Obiettivo del Programma di Ricerca

Obiettivo del progetto e' l'identificazione di specifici profili biologici delle mielodisplasie (MDS), classificate secondo la clssificazione WHO, alla diagnosi e dopo trattamento con farmaci in grado di indurre modificazioni epigenetiche. I sottotipi di MDS verranno identificati e caratterizzati mediante studi genetici ed epigenetici, che verranno correlati con immunofenotipo e morfologia.

a) OBIETTIVI DEGLI STUDI GENETICI
1) DEFINIZIONE BIOLOGICA DELLE SINDROMI MIELODISPLASTICHE, PRIVE DI MARKER GENETICO NELLA CLASSIFICAZIONE WHO.
Questa parte del progetto e' stata concepita al fine di identificare nuovi marker genetici e molecolari, per definire nuove entita' nell'ambito della classificazione WHO e identificare lesioni genomiche nuove e/o criptiche nei casi con anomalie del cariotipo o nei casi con citogenetica normale o non valutabile.

2) IDENTICAZIONE DI NUOVI GENI E MECCANISMI MOLECOLARI IMPORTANTI NELLE SINDROMI MIELODISPLASTICHE E ALTRE NEOPLASIE EMATOLOGICHE CORRELATE.
L'ibridizzazione genomica comparativa (CGH) e la FISH in metafase verranno eseguite su mDS a cariotipo complesso. Gli studi molecolari comprenderanno la caratterizzazione dei geni DUP16 (un nuovo gene oncosoppressore localizzato in 12p13, che codifica per una fosfatasi MAPK) e il gene NUP98.

3)MATRIX-CGH E ANALISI DI ESPRESSIONE GENICA NEI CROMOSOMI E IN MACROAARAY. La "Matrix-CGH" e' utile per aumentare la sensibilita' della CGH in metafase.

4)CARATTERIZZAZIONE CITOGENETICA E MOLECOLARE DELLE MDS, CON COINVOLGIMENTO DELLE REGIONI BREAKPOINT A LIVELLO DI 3q21 E 3q26.
Verra' studiata la relazione fra i geni di fusione MEL1-RPN1 e altri geni, fra cui EAP, GR6 e GATA2, sulla banda 3q21. Il riarrangiamento e l'espressione di RPN1-Evi1 e degli altri geni sopra-indicati verrano studiati mediante:
a) citogentica convenzionale e fluorescence in situ hybridisation (FISH);
b)analisi qualitativa e quantitativa mediante Real Time RT-PCR.

5) RUOLO DI EVI1 E MDS-EVI1 NELLA PATOGENESI DELLE MDS E NELLA TRASFORMAZIONE LEUCEMICA.
E' noto che Evi1 and Mds1-Evi1 vengono indotti dall'acido retinoico in alcune linee cellulari. Il profilo di espressione dei blasti verra' studiato usando i microarray prima e dopo trattamento con ATRA in vivo e in vitro.

b) OBIETTIVI DEGLI STUDI EPIGENETICI
1)Valutazione dell'attivita' di 4 inibitori dell'HDAC sugli istoni H2A e B, H3, H4 in cellule primarie da MDS CD34-positive, paragonate ai progenitori normali.

2) Valutazione del significato della metilazione degli istoni nella regolazione dell'espressione genica.

3)Profili genici dopo metilazione/acetilazione istonica dovuta agli inibitori dell'HDAC (HDACi). Studio del pattern di possibile riespressione genica dopo trattamento con HDACi, e verifica della inibizione di geni induttori di apoptosi, proliferazione e resistenza ai farmaci.

4)Analisi dei pattern di trasduzione del segnale e interazioni fra cellule isolate da MDS, trattate con HDACi.

5) Analisi proteomica delle cellule mielodisplastiche CD34+, paragonate alle cellule normali, con enfasi sulle modfiche traslazionali delle proteine identificate, istoniche e non (circa 200 proteine), in particolare il grado di acetilazione prima e dopo aggiunta di HDACi e DNMTi.

6)Ruolo di Evi1 e della sua attivita'. L'attivita' di Evi1, verra' inibita mediante un potente inibitore dell'istone deacetilasi, come tricostatina A/Acido valproico. Verra' inoltre valutata la derepressione dei geni bersaglio di Evi1.

7)Pattern di metilazione dei geni di riparazione del DNA. Verra' studiato lo stato di metilazione di BRCA-1 e MGMT. Le mutazioni di BRCA1 sono un fattore di suscettibilita' al cancro della mammella e dell'ovaio familiare. Studieremo la metilazione di BRCA1 nelle MDS, come gene oncosoppressore. Verra' utilizzata una PCR metilazione-specifica.

8)Stato di metilazione dei fattori angiogenici COX-2 e trombospondina.
E' stato dimostrato che l'angiogenesi svolge un ruolo importante nelle MDS. Fra i geni importanti per l'angiogenesi, studieremo COX-2, che ha ruolo pro-angiogenico e pro-apoptotico, e la trombospondina, che ha funzione anti-angiogenica.

9)Studi funzionali sulla metilazione di DAP-kinasi nelle MDS trattate con agenti demetilanti in vitro e in vivo.
Dap-kinasi e' una kinasi serina/treonina, regolata dalla calmodulina, che partecipa ad un'ampia serie di sistemi apoptotici, indotti dall'interferone gamma, TNF-alpha, Fas, e distacco dalla matrice cellulare. Abbiamo dimostrato che DAP-kinasi e' ipermetilata in circa il 50% delle MDS e AML: studieremo gli effetti funzionali della metilazione di questo gene nelle cellule primarie di pazienti con MDS e t-AML, trattati con agenti demetilanti e inibitori dell'istone deacetilasi. Per studiare l'effetto della riattivazione di DAP-kinasi sull'apoptosi, valuteremo la percentuale di cellule apoptotiche, mediante la marcatura dell' Annesina-V, utilizzando la citometria a flusso.

10) Attivita' trascrizionale indotta dagli inibitori della metiltransferasi nelle linee cellulari o nelle cellule primarie che esprimono Evi1.
Studieremo il profilo di espressione delle MDS dopo esposizione a farmaci in grado di inibire l'attivita' metil-transferasica, come Azacitidina (Pharmion) o Decitabina (SuperGen). Il metodo del silenziamento genico verra' usato per studiare le modificazioni indotte da Evi1 e l'attivita' HDAC. Il metodo di silenziamento "double-strand RNA (dsRNA"), noto anche come "RNA interference (RNAi)" e' un metodo di soppressione della funzione genica e permette studi di funzione genica in coltura cellulare e in vivo. RNAi verra' usato per inibire enzimi importanti per l'epigenetica.

c)Immunotipizzazione e altri studi
- Obiettivo del progetto e' studiare il profilo fenotipico delle MDS, con particolare riferimento all'espressione di antigeni di adesione, differenziamento e apoptosi:
1.Pattern di espressione di molecole di adesione (Lecam1, ICAM1, VLA-4, VLA-5, Thy1-CD90), antigeni di differenziazione(CD45, CD34, HLA-DR, CD13, CD33, CD15, CD11b, CD16) nel midollo di pazienti affetti da MDS, paragonato al midollo normale o alle leucemie acute. In questa fase si studiera' se le MDS esprimono i marker in maniera anomala e se i fenotipi aberranti possano essere utilizzati come marker di malattia minima residua;
2.Anomalie dell'apoptosi, utilizzando l'espressione di apo/fas (CD95), bax, bcl-2, annessina V e caspasi-3;
3.Verificare se l'alterazione dell'espressione antigenica e le anomalie dell'apoptosi influenzano la prognosi;
4.Correlare l'espressione antigenica e l'apoptosi ad altre variabili, quali citogentica e sottotipi FAB/WHO;
5. Seguire le possibili alterazioni del profilo biologico del paziente durante terapia con Infliximab (MDS a basso rischio) or 5-Aza/DAC (MDS ad alto rischio);
6.Analizzare le possibili correlazioni fra le modificazioni biologiche indotte dai farmaci e la prognosi.

- Valutazione dell'evoluzione clonale dei diversi tipi di MDS e correlazione con il pattern di metilazione e di risposta al trattamento.
Studieremo la clonalita' in pazienti che ottengono la remissione completa dopo la chemioterapia, sui granulociti separati dal sangue perierico o dal midollo osseo, utilizzando una metodica che studia il polimorfismo del primo esone del recettore per gli androgeni (HUMARA). <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Le sindromi mielodisplastiche (MDS) sono un gruppo eterogeneo di disordini clonali dell'ematopoiesi, che determinano pancitopenia, con un rischio elevato (30%) di trasformazione in leucemia mieloide acuta (AML). L'espansione del clone anomalo e' caratterizzato morfologicamente dalla displasia, alterata differenziazione, difetti della funzione cellulare e instabilita' genetica. Anomalie genetiche clonali si evidenziano nel 40%-50% dei pazienti con MDS primitive e fino all'80% deo pz con MDS indotte da precedente trattamento. Lo specifico cromosoma coinvolto e il numero di anomalie cromosomiche offrono importanti informazioni prognostiche. I risultati degli studi citogenetica hanno fornito le basi per le nuove classificazioni. Inizialmente la cosiddetta classificazione MIC (Morfologia, Immunologia, Citogenetica) delle leucemie acute e croniche, era basata su associazioni specifiche fra aspetti morfologici, immunologici e citogenetici. Piu' recentemente la "World Health Organisation" (WHO) ha proposto una classificazione ampia delle neoplasie ematologiche e ha stabiltito lo stato dell'arte nella diagnosi genetica delle malattie linfo- e mieloproliferative. Gli aspetti citogenetici e molecolari sono noti per alcune malattie, ma rimangono ignoti per la maggioranza di esse. In circa il 60% dei casi di leucemie mieloide acuta e MDS con cariotipo normale o alterazioni rare non e' nota la lesione molecolare.
La conoscenza delle basi genetiche delle neoplasie ematologiche si e' ampliata notevolmente nel momento in cui alla citogenetica convenzionale si e' affiancata la citogenetica molecolare, per es. la ibridizzazione in situ con sonde fluorescenti (FISH) e l'ibridizzazione genomica comparativa (CGH). Applicando queste tecniche, importanti progressi sono stati ottenuti negli ultimi dieci anni: e' aumentato il numero delle diagnosi di sottogruppi di varianti citogenetiche; sono stati clonati nuovi geni ; sono stati trovate nuove proteine di fusione con effetti trasformanti; casi in cui la citogenetica convenzionale era fallita sono stati analizzati con successo con le nuove metodiche; il monitoraggio della malattia minima residua dopo chemioterapia e dopo trapianto di midollo è migliorato; nuovi marker citogenetici sono stati identificati per distinti sottogruppi di neoplasie ematologiche che condividono le stesse caratteristiche ematologiche e cliniche.
Tra le più frequenti alterazioni citogenetiche delle SMD sono le delezione di un intero cromosoma o parti di esso, come la sindrome del 5q-, il 20q- e la monosomia del cromosoma 7. Di rilievo appaiono inoltre le alterazioni cromosomiche interessanti il cromosoma 3 che definiscono uno specifico subset di mielodisplasie ad alto rischio (HR-MDS). In particolare, la 3q21 e la 3q26 che sono interessate simultaneamente nella inversione inv(3)(q21q26) e nella traslocazione t(3;3)(q21;q26). Queste alterazioni si riscontrano in pazienti con Leucemia Mieloide Acuta (LAM), nelle sindromi mielodisplastiche e nella leucemia mieloide cronica (CML) in fase blastica. La inv(3) e la t(3;3) sono associate a una malattia molto aggressiva con scarsa risposta alla chemioterapia, ridotta possibilità a raggiungere la remissione completa e ridotta sopravvivenza. I pazienti con aberrazione del 3q di frequente hanno un numero di piastrine normale o elevato e un pool espanso di megacariociti displastici con anormale maturazione.
Due geni localizzati nel cromosoma 3 a livello q26 sono stati implicati nello sviluppo o progressione in leucemia mieloide acuta: Evi1 and Mds1. Evi1 codifica per una proteina che si lega al DNA, interferisce con la maturazione sia eritrocitaria che megacariocitaria ed è stato suggerita una possibile associazione tra la dismegacariocitopoiesi e la aumentata espressione di Evi1. Inoltre Evi1 contiene un dominio SET. Le proteine che contengono questo tipo di dominio sono associate con attività istone metiltrasferasica, che caratteristicamente regola l'espressione genica.
Alcune modificazioni epigenetiche lavorano insieme per la corretta regolazione dell'espressione genica. L'acetilazione istonica e la metilazione del DNA sono le modificazioni epigenetiche meglio caratterizzate. Le modificazioni post-sintetiche del DNA e delle proteine della cromatina sono di estrema importanza in quanto interferendo con la struttura della cromatina ne determinano il suo rimodellamento, che regola l'accessibilità all'informazione che è presente sul DNA. La metilazione è in grado di modificare il DNA e consiste nella introduzione dei gruppi metilici sulle citosine principalmente presenti nei dinucleotidi CpG. Questa modificazione epigenetica introduce una quinta base sul DNA, la 5-metilcitosina. Per quanto riguarda la distribuzione della 5-metilcitosina è ben noto che essa si distribuisce in maniera non-random sul DNA genomico, sicchè la citosina non-metilata si distribuisce nella cromatina densa (bulk chromatin) mentre il DNA metilato è localizzato principalmente in particolari regioni chiamate isole CpG.
Le alterazioni epigenetiche, sia della metilazione che dell'acetilazione, con il conseguente rimodellamento del DNA, sono state riconosciute di capitale importanza nella patogenesi ed evoluzione delle MDS in leucemia. Diversi gruppi hanno dimostrato che le cellule midollari dei pazienti con MDS presentano delle alterazioni della metilazione. Fra i geni studiati nelle MDS vi sono gli inibitori delle chinasi ciclino-dipendenti, p15 e p16, e più recentemente p21 e p57. Il gene p15INK4B ed il suo omologo funzionale p16INK4A, codificano per proteine che regolano negativamente il ciclo cellulare mediante l'inibizione delle chinasi ciclino-dipendenti 4 e 6. La metilazione aberrante del promotore di p15 si trova comunemente nelle MDS, quali l'anemia refrattaria con eccesso di blasti (AREB) o AREB in trasformazione, e si associa alla perdita dell'espressione di p15.
Utilizzando una PCR metilazione-sensibile, l'ipermetilazione di p15 era assente nelle MDS a basso rischio, mentre in quelle ad alto rischio era presente nel 23% dei casi alla diagnosi e nel 30% dei casi negli stadi avanzati. I pazienti con ipermetilazione di p15INK4B alla diagnosi o durante il follow-up avevano una frequenza di progressione significativamente più alta di quelli con pattern non metilato. L'ipermetilazione potrebbe avere un ruolo fondamentale anche nella patogenesi delle MDS "therapy-related". L'esposizione alla chemio-radioterapia induce nei progenitori emopoietici delle modificazioni molecolari. Fra queste, è frequente l'ipermetilazione delle regioni dei promotori di geni importanti per la riparazione del DNA, la progressione del ciclo cellulare e la sopravvivenza. Fra i geni regolati dalla metilazione del promotore, vi è la "death-associated protein kinase" (DAP-chinasi). In uno studio di Voso et al, la frequenza di ipermetilazione di questo gene nelle SMD è risultata del 27.5%. Si ritiene che le alterazioni della risposta apoptotica, dovute alla perdita di funzione di DAP-chinasi, potrebbero essere eventi precoci nello sviluppo della SMD e nella progressione in leucemia. Altro aspetto rilevante e' l'ipermetilazione dei geni di riparazione del DNA, fra i quali MGMT e BRCA-1. Il gene di riparazione MGMT rimuove gli addotti mutagenici dalla posizione O6 della guanina, proteggendo il genoma dalle mutazioni G in A. MGMT e' ipermetilato in molte neoplasie umane ed e' stato associato alle mutazioni G in A di K-ras nel cancro del colon-retto. Il livello di espressione di MGMT e' diverso nei diversi tessuti e nelle diverse neoplasie, si associa al silenziamento del gene e risulta in una ridotta detossificazione degli agenti alchilanti. Livelli bassi di MGMT nei progenitori ematopoietici potrebbero predisporre all'accumulo di mutazioni e indurre la mielodisplasia. Le mutazioni costituzionali del gene BRCA1 conferiscono aumentata suscettibilita allo sviluppo del cancro familiare della mammella e dell'ovaio. BRCA1, come gene oncosoppressore, svolge un ruolo importante nel mantenere la stabilita' del genoma, interagendo con numerose proteine e formando complessi che riconoscono e riparano il DNA, per tali motivi potrebbe svolgere un ruolo importante nel mantenere la stabilita' del genoma nei progenitori emopoietici e funzionare come gene oncosoppressore.
Il rimodellamento del DNA a livello dei promoteri è un evento necessario per l'attivazione della trascrizione, in questo senso il meccanismo meglio studiato e conosciuto è quello della acetilazione degli istoni. L'acetilazione degli istoni avviene sui residui N terminali della classe H2B, H3 e H4 e questo processo facilita l'accesso al DNA mediante l'interazione destabilizzante istone-DNA. L'acetilazione istonica è regolata dall'equilibrio di due enzimi, l'istone acetiltransferasi, HAT, e deacetilasi (HDAC). Specifiche alterazioni citogenetico-molecolari agiscono modificando lo stato di acetilazione della cromatina tramite il reclutamento di proteine in grado di legare complessi repressori trascrizionali incluse le istone deacetilasi. Questo evento porta alla perdita di residui acetilati degli istoni e quindi ad una diversa conformazione del DNA, che a sua volta comporta un blocco trascrizionale.
Esistono complesse interazioni tra le metiltrasferasi (DNMTs) i fattori di trascrizione delle proteine (MBDs) che si legano ai dinucleotiti CpG metilati, gli enzimi demetilanti, gli enzimi acetilanti e deacetilanti gli istoni(HDAC), e la struttura cromatinica. L'associazione dell'armamentario metilante, DNMTs e MBDs, con HDACs provvede ad un legame cooperativo tra metilazione e deacetilazione istonica nel silenziamento trascrizionale. Vi sono numerosi esempi di ipermetilazione di promotori di geni oncosoppressori che si traducono nel silenziamento genico, che conferisce un vantaggio proliferativo. In diversi sistemi è stato stabilito uno stretto rapporto tra ipermetilazione del DNA, silenziamento trascrizionale e cromatina estremamente compatta. Le ricerche degli ultimi 5 anni hanno portato ad un notevole aumento delle conoscenze nel meccanismo della modulazione della struttura della cromatina e hanno rivelato che essa è una struttura che gioca un ruolo importante nella regolazione trascrizionale. Le regioni inattive della cromatina pesantemente metilate sono state state trovate arricchite di istoni ipoacetilati. Il processo di metilazione, mediato dalla metiltrasferasi-1, può dipendere o generare una cromatina alterata attraverso l'attività istone deacetilasica. Molti progressi per capire il legame tra la metilazione del DNA, la deacetilazione istonica, ed il silenziamento genico sono venuto dalle ricerche di 2 laboratori (Fucks et al e Nan et al). Entrambi i gruppi hanno dimostrato che la proteina legante i metili, MeCP2, conosciuta per essere impegnata nella repressione trascrizionale del DNA metilato, recluta una istone-deacetilasi, HDAC1, per mezzo di un legame con una proteina Sin3a. Il rapporto tra la metilazione del DNA e la deacetilazione istonica potrebbe avere implicazioni terapeutiche.
Gli inibitori della istone-deacetilasi, da soli o in combinazione con gli agenti ipometilanti, possono essere utili nello riattivare i geni oncosoppressori nelle cellule tumorali. Uno studio che utilizza la 5-azacitidina seguita dalla tricostatina A (TSA), un potente e reversibile inibitore della HDAC delle cellule de cancro del colon e leucemiche, riattiva i geni ipermetilati MLH1, TIMP3, p15 e p16.
Accanto alla nozione che la MDS deriva da un danno genetico, cui conseguono alterazioni epigenetiche, numerose evidenze suggeriscono che interazioni reciproche tra il clone maligno ed il microambiente servono a creare un "milieu" ostile che si traduce in una inefficace produzione di cellule del sangue. La mielopoiesi inefficace, la caratteristica fondamentale delle MDS, deriva da una ridotta risposta dei progenitori emopoietici agli stimoli trofici e ad un eccessiva produzione locale di citochine inibitorie, che promuovono l'apoptosi dei progenitori e della loro progenie. Supportano questo modello studi di neutralizzazione con anticorpi delle citochine e la diretta relazione tra la concentrazione di tumor necrosi factor (TNF) ed apoptosi, inoltre molecole angiogenetiche generate dai progenitori mielomonocitici favoriscono l'autorinnovamento dei progenitori in evoluzione leucemica. In questo contesto il ruolo del TNF è stato estensivamente studiato, ed è divenuto chiaro che esso potrebbe controllare la crescita displastica, sia direttamente, attraverso la formazione di radicali liberi che a loro volta causano rotture a livello cromosomico e molecolare, o inducendo il malfunzionamento dello stroma midollare. Analizzando la crescita, sopravvivenza, differenziazione e morte programmata (apoptosi) delle cellule ematopoietiche, sono state identificate alcune molecole critiche nella regolazione di tali processi, in primo luogo le molecole di adesione (integrine, selectine). Nelle MDS, il difetto di crescita e l'alterazione dei meccanismi di regolazione della differenziazione e sopravvivenza cellulare, possono essere correlate in generale ad un difetto di espressione e di traduzione del segnale di queste molecole di superficie nelle cellule ematopoietiche. Gli studi di espressione di tali molecole nel compartimento staminale di pazienti affetti da MDS, hanno dimostrato una deficitaria espressione di VLA-4 (CD49d) con conseguente alterato legame con fibronectina ed un difetto di segnali di sopravvivenza da parte del microambiente midollare, tale da determinare eccesso di apoptosi delle cellule ematopoietiche. Le beta1 integrine (Lecam1, Icam1) sembrano quindi coinvolte sul piano fisiopatogenetico nello sviluppo del clone mielodisplastico. Un difetto di espressione di Lecam1 ed una iperespressione di Icam1 nel compartimento staminale di pazienti affetti da MDS è stato messo in evidenza dal gruppo di Amadori. Tale difetto, quantificato con una "ratio" tra i valori di espressione di tali molecole, si accentuava nelle forme di MDS ad alto rischio o nel corso di progressione leucemica. L'aumento dell'espressionedi Icam1 sarebbe parallelo al progressivo incremento di molecole antiapoptotiche (ad es. bcl-2) come è dato osservarsi nelle forme di SMD ad alto rischio e nelle leucemie acute mieloidi secondarie a SMD (sAML), e questo contrasta con l'eccesso di apoptosi che si osserva invece nelle forme a basso rischio. La correlazione diretta di tale sovraespressione con l'eccesso di apoptosi rimane ancora da chiarire a livello fenotipico e molecolare. Un altro esempio di correlazione tra dati fenotipici e controparte genetico-molecolare è l'espressione difettiva di altre molecole di adesione quali CD11a, CD11b, CD11c, CD49d, L-Selectina e di molecole che distinguono le varie fasi della differenziazione mieloide (CD45, CD34, HLA-DR, CD13, CD33, CD15, CD11b, CD16). Tale anomalia può essere connessa ad un'alterazione quantitativa e qualitativa della regolazione genica, sia nel contesto di mutazioni geniche che di modificazioni epigenetiche della cromatina cellulare (metilazione e acetilazione degli istoni). In quest'ottica, merita ulteriore approfondimento la segnalazione, da parte del gruppo di Amadori, di una superiore espressione di Thy1 nel compartimento blastico di pazienti affetti da MDS e leucemie acute mieloidi secondarie (LAMs), rispetto a blasti di LAM de novo.
L'insieme delle conoscenze fisiopatologiche accumulate in questi anni costituisce la premessa all'impiego terapeutico di modulatori biologici come farmaci ad azione anti-citochinica (anti-TNFalfa), agenti ipometilanti (5-azacitidina, decitabina), da soli ed in associazione con inibitori delle deacetilasi. <<<