RICERCA ITALIANA     

Infezioni virali persistenti, latenti e croniche da virus a DNA e ad RNA: studio dei meccanismi di regolazione genica e della risposta immune.

Università degli Studi di Parma

Abstract

Questo progetto si propone di affrontare le complesse problematiche legate alla persistenza virale sotto diversi aspetti, nell'intento di approfondire le conoscenze sui meccanismi che concorrono all'insediamento silente del virus in specifiche cellule dell'ospite, di verificare la validità di approcci terapeutici innovativi e di individuare eventuali marcatori genotipici di resistenza di virus che sviluppano infezioni croniche, con valore predittivo sull'impiego della terapia antivirale.
Nell'ambito dei virus erpetici, tutti caratterizzati da una fase di latenza che fa seguito all'infezione primaria, citomegalovirus umano (HCMV) viene ancora oggi considerato non solo uno tra gli agenti eziologici più importanti nell'indurre anomalie congenite e/o sequele neurologiche tardive nel bambino in seguito ad un'infezione primaria intrauterina, ma costituisce anche un potenziale problema per ogni ospite immunocompromesso. Lo studio condotto dall'Unità di Ricerca 1 si prefigge di approfondire le conoscenze, a tutt'oggi incomplete, sui meccanismi molecolari utilizzati da citomegalovirus per indurre uno stato di latenza, come anche quelli che ne regolano la riattivazione, utilizzando modelli in vitro.
Analogo, elevato impatto sulla salute umana hanno le infezioni sostenute da altri virus erpetici, quali Herpes simplex di tipo 1 (HSV-1), anch'esse con possibile evoluzione verso quadri patologici estremamente gravi in particolari categorie di soggetti a rischio. In questi casi, la migliore strategia di controllo dell'infezione è rappresentata dall'uso di vaccini mirati alla prevenzione della riattivazione virale. Gli ostacoli maggiori allo sviluppo di un efficace vaccino sono connessi alla identificazione dei principali effettori del sistema immunitario in gioco nelle suddette infezioni, così come delle principali proteine immunogeniche di HSV-1. Lo studio condotto dall'Unità di Ricerca 3 verterà principalmente sulla messa a punto di vaccini sintetici a formulazione innovativa per HSV-1, per valutarne poi le caratteristiche immunogeniche. Il passo successivo sarà quello di saggiare l'efficienza di questo tipo di vaccino in modelli murini (Unità di Ricerca 2), ponendolo a confronto con altre due strategie vaccinali, quali un protocollo classico di immunizzazione e l'utilizzo di vaccini a DNA.
Oltre alla latenza, altra importante forma di persistenza virale nell'ospite si ha per quei virus che sono in grado di sviluppare infezioni croniche, dopo un primo episodio acuto o un'infezione asintomatica, quali i virus dell'epatite B (HBV) e C (HCV), con possibile evoluzione verso processi degenerativi delle cellule epatiche, come cirrosi ed epatocarcinoma. Per quel che riguarda l'approccio terapeutico, in particolare nei confronti di HCV, questo è non di rado inficiato da meccanismi di resistenza virale. L'Unità di Ricerca 4 si propone di affrontare questa complessa problematica attraverso un'analisi comparativa dei genotipi virali rilevabili in pazienti sensibili o resistenti alla terapia antivirale, sia in caso di infezione da HCV, che di doppia infezione (HCV e HBV), al fine di identificare marcatori di resistenza prognostici di riattivazione di HCV, che abbiano anche, possibilmente, un valore predittivo sull'efficacia della terapia.
Infine, esistono verosimilmente altri tipi di meccanismi, non ancora completamente chiariti, che garantiscono l'insediamento duraturo del virus nell'organismo infettato, come nel caso di infezioni persistenti da parvovirus umano B19 (PB19), non di rado evocate nell'ambito di alcune rilevanti patologie, quali malattie autoimmuni del connettivo, oltre che in anemie croniche. Lo studio condotto dall'Unità di Ricerca 5 si prefigge di individuare i tipi di cellule in cui PB19 possa persistere ed il tipo di interazione virus-cellula in modelli in vitro, come anche di chiarire l'eventuale ruolo della risposta immunitaria cellulo-mediata nelle infezioni persistenti sostenute da PB19. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Carlo CHEZZI Università degli Studi di PARMA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo progetto si propone di affrontare le complesse problematiche legate alla persistenza virale sotto diversi aspetti, nell'intento:
A- di approfondire le conoscenze sui meccanismi molecolari che concorrono all'insediamento silente di un virus in specifiche cellule dell'ospite, con particolare riferimento ad agenti virali che vanno incontro a latenza, quali citomegalovirus umano (HCMV) (Unità di Ricerca 1), o persistono nell'organismo infettato, verosimilmente attraverso meccanismi alternativi, come nel caso di parvovirus umano B19 (Unità di Ricerca 5);
B- di progettare ed allestire vaccini terapeutici innovativi per il virus Herpes simplex di tipo 1 (HSV-1) (Unità di Ricerca 3);
C- di verificare il potere proteggente di tali vaccini a formulazione innovativa per HSV-1 in modelli murini (Unità di Ricerca 2);
D- di individuare eventuali marcatori genotipici di resistenza di virus che sviluppano infezioni croniche, quali quelli dell'epatite B (HBV) e C (HCV), con valore predittivo sull'impiego della terapia antivirale (Unità di Ricerca 4).

Punto A
L'obiettivo principale dello studio su HCMV, condotto dall'Unità di Ricerca 1, è quello di approfondire le conoscenze sui meccanismi molecolari utilizzati da tale virus per indurre un'infezione latente, verificando, in particolare, la possibilità che il virus sfrutti alcuni dei meccanismi principali utilizzati dalla cellula eucariotica per reprimere (metilazione del DNA e/o degli istoni) o, alternativamente, attivare (acetilazione degli istoni) l'espressione di specifici geni. Altra, non meno importante, finalità è quella di attuare uno studio comparativo dell'espressione genica virale in condizioni di ciclo litico o di latenza, utilizzando tecnologie sofisticate (cDNA-microarray), che permettano l'analisi contemporanea di un numero rilevante di RNA messaggeri virali e che possano, auspicabilmente, fornire un supporto per la caratterizzazione delle due condizioni interattive che citomegalovirus può stabilire con la cellula ospite.
Analoga finalità, sebbene applicata ad un virus diverso, è quella del programma dell'Unità di Ricerca 5, ovvero di chiarire i meccanismi molecolari che supportano la persistenza di parvovirus umano B19 (PB19) e le conseguenze di tale infezione sulle cellule bersaglio in modelli in vitro; scopo ulteriore ed altrettanto rilevante è quello di valutare il ruolo dell'infezione persistente da parvovirus in alcune malattie autoimmuni del connettivo, come la sclerosi sistemica (SSc). I modelli prescelti sono rappresentati sia da colture primarie di fibroblasti umani e di cellule endoteliali umane infettate in vitro, che da cellule derivanti da biopsie cutanee di individui con infezione persistente da PB19 (compresi anche pazienti con SSc). Verrà inoltre studiata la risposta immunitaria cellulo-mediata nei confronti di PB19 sia in campioni di soggetti con SSc, che in quelli di individui con infezione persistente asintomatica da PB19, a confronto con soggetti sani, al fine di chiarire se eventuali alterazioni dell'immunità cellulo-mediata possano contribuire alla persistenza del virus.

Punto B
Finalità principale del lavoro condotto dall'Unità di Ricerca 3 è quella di progettare ed allestire vaccini terapeutici a formulazione innovativa nei confronti di Herpes simplex di tipo 1 (HSV-1), sfruttando le conoscenze fino ad oggi acquisite circa la risposta immunitaria che interviene nel controllo delle infezioni ricorrenti sostenute dal suddetto virus.
Tale ricerca si articolerà su tre principali fronti:
1) produzione di proteine di HSV-1 in sistemi eterologhi (lievito);
2) analisi dettagliata dell'immunogenicità di tali proteine;
3) allestimento di un nuovo sistema vaccinale costituito da subunità peptidiche legate a costrutti lipidici idrofobici, questi ultimi con funzione di "carrier" e di adiuvanti.
In particolare, la suddetta Unità di Ricerca si prefigge innanzitutto di effettuare un'analisi dettagliata dell'immunogenicità di glicoproteine del pericapside di HSV-1 (gB, gD, gH e gL) ottenute in lievito. In tale ottica, le proteine virali prodotte in lievito saranno analizzate mediante l'uso di uno specifico programma che permette di individuarne gli epitopi immunodominanti. Sulla base delle informazioni ricavate da tale analisi, si procederà a costruire una serie di peptidi, disegnati su siti antigenici specifici delle suddette glicoproteine di HSV-1, utilizzandoli in combinazione per lo sviluppo di un vaccino a subunità. Si procederà, infine, ad allestire le preparazioni vaccinali stesse, utilizzando una sofisticata tecnologia che permette di legare diverse copie degli antigeni di interesse ad un core di natura polilisinica o polisaccaridica, a sua volta legato a lipoaminoacidi. Tali complessi molecolari hanno il doppio vantaggio di potenziare l'immunogenicità delle preparazioni vaccinali, essendo al contempo (e contrariamente agli adiuvanti classici) privi di tossicità.

Punto C
La ricerca che verrà sviluppata dall'Unità 2 ha come principale obiettivo quello di mettere a punto e valutare in modelli murini nuove strategie di vaccinazione anti-HSV-1 (messe a punto dall'Unità di Ricerca 3). Si procederà quindi alla realizzazione di tre diverse preparazioni vaccinali utilizzando sia peptidi sintetici di glicoproteine erpetiche somministrati in formulazioni differenti, sia i geni delle stesse proteine, clonati in appositi vettori di espressione per vaccini a DNA. Lo scopo sarà quello di valutare, analizzando la risposta anticorpale dell'animale, l'efficacia della preparazione utilizzata per l'immunizzazione e di confrontare le differenti risposte immunitarie ottenute. Questo consentirà di valutare sia le caratteristiche delle preparazioni antigeniche in sperimentazione, che di ampliare progressivamente la gamma di peptidi erpetici da utilizzare. La suddetta ricerca si confronterà quindi con il difficile obiettivo di saggiare se la risposta immune indotta dalle diverse strategie di immunizzazione sia più o meno in grado di proteggere efficacemente gli animali nei confronti di un'infezione da HSV-1. Allo stesso tempo, verrà valutato lo stato di latenza del virus nei topi che avranno superato l'infezione primaria, analizzando i loro gangli spinali per la presenza di sequenze di DNA di HSV-1.

Punto D
Lo studio affidato all'Unità di Ricerca 4 si propone di effettuare un'analisi genotipica e mutazionale di specifiche regioni del genoma di HCV, come anche una valutazione della carica virale di HCV e HBV, a partire da una campionatura di sieri di pazienti con epatite C cronica, ad intervalli prestabiliti rispetto all'inizio della terapia antivirale. Obiettivo principale è quello di mettere in evidenza eventuali correlazioni tra genotipi di pazienti in cui il protocollo terapeutico si è dimostrato efficace (cosiddetti "responder"), rispetto a quello dei "non-responder", sia in caso di singola che di doppia infezione, al fine di identificare, possibilmente, marcatori prognostici di riattivazione di HCV, che abbiano anche un valore predittivo sull'efficacia della terapia. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I virus si sono evoluti sviluppando diverse strategie volte ad eludere le difese dell'ospite e a garantire così la loro persistenza nelle cellule dell'organismo infettato, vanificando molto spesso gli approcci terapeutici finalizzati alla loro eradicazione. Tra i meccanismi virali più utilizzati al fine di garantire la persistenza nell'ospite, vi sono quelli che portano all'instaurarsi di uno stato di latenza, con possibili riattivazioni virali anche a distanza di anni dall'infezione primaria, come nel caso di virus appartenenti alla famiglia Herpesviridae, quali citomegalovirus e virus Herpes simplex, o meccanismi che possono sfociare nella cronicizzazione dell'infezione con possibili sequele degenerative a carico degli organi bersaglio, come per i virus dell'epatite B e C; infine quei meccanismi, peraltro non ancora definitivamente chiariti, che comunque garantiscono la persistenza del virus nell'individuo infettato, favorendo verosimilmente l'instaurarsi di vari tipi di sequele, quali processi degenerativi su base autoimmune, come nel caso di parvovirus umano (PB19).
Nell'ambito dei virus erpetici, citomegalovirus umano (HCMV) è ancora oggi considerato non solo uno tra gli agenti eziologici più importanti nell'indurre anomalie congenite e/o sequele neurologiche tardive nel bambino in seguito ad un'infezione primaria intrauterina, ma costituisce anche un potenziale problema per ogni ospite immunocompromesso, causando malattie anche gravi (e a volte mortali), in particolare nei trapiantati d'organo, come anche nei malati di AIDS.
Gli studi sulla biologia e sulla patogenesi dell'infezione da HCMV sono progrediti molto rapidamente nel corso degli ultimi decenni; tuttavia, ancora incomplete rimangono, a tutt'oggi, le conoscenze legate alle strategie messe a punto da HCMV per competere in maniera vincente con la cellula ospite e portare a termine il ciclo replicativo litico, come anche quelle adottate per indurre uno stato di latenza. In particolare, fino a qualche anno fa si riteneva che HCMV, contrariamente ad altri virus erpetici, inducesse segnali di attivazione delle sintesi macromolecolari dell'ospite, in particolare quella di DNA cellulare. Osservazioni più recenti hanno però messo in evidenza la capacità, da parte del virus, di bloccare la progressione del ciclo cellulare da G1 a S in modelli cellulari permissivi in vitro, con conseguente blocco della sintesi di DNA dell'ospite. Il vantaggio strategico per il virus consisterebbe nell'avere a disposizione il corredo di enzimi ed altri fattori coinvolti nella sintesi del DNA della cellula ospite, impedendo però la sintesi stessa dell'acido nucleico cellulare. D'altra parte, questo evento non si verificherebbe nell'infezione di cellule semi-permissive, in cui verrebbe invece attivata la sintesi dell'acido desossiribonucleico cellulare. Queste osservazioni depongono per la messa in atto, da parte di HCMV, di programmi alternativi di espressione del proprio genoma, modulanti in maniera differenziata il metabolismo della cellula ospite, dipendentemente dal tipo cellulare implicato, come anche dalla fase del ciclo cellulare in cui si trova la cellula al momento dell'ingresso del virus. Per quel che riguarda la condizione di latenza indotta da HCMV, un potenziale sito di latenza/persistenza di HCMV è stato ravvisato nelle cellule endoteliali dei vasi sanguigni: in queste ultime, il ciclo cellulare non verrebbe bloccato ed esse non accumulerebbero virus nel loro citoplasma, continuando a produrre virus infettante extra-cellulare in assenza di effetto citopatico, condizioni tipiche di uno stato di persistenza. Questo mancato intervento da parte di HCMV sul ciclo cellulare porterebbe ad un diverso tipo di interazione tra virus e cellula ospite, permettendo la coesistenza di entrambi per lunghi periodi di tempo. E' altresì possibile che la latenza si instauri in alcune cellule del sistema immunitario dell'ospite. Nell'ambito degli elementi cellulari del sangue circolante, i monociti sono stati indicati come possibili sedi di latenza/persistenza, come anche probabili veicoli di disseminazione di HCMV. Solo una volta completato il differenziamento, con transizione dei monociti a macrofagi, il livello di espressione del genoma di HCMV diventerebbe rilevante con produzione di progenie virale. In questo caso, lo stadio post-mitotico che avvia il processo di differenziamento cellulare, sembrerebbe essere intimamente connesso con la regolazione dell'espressione genomica del virus.
E' infine possibile un meccanismo di blocco proliferativo e differenziativo delle cellule ematopoietiche per infezione diretta, da parte di HCMV, delle cellule progenitrici caratterizzate dal marcatore di superficie CD34, altre possibili sedi di latenza del virus. Nonostante le recenti acquisizioni relative alle sedi di latenza virale, i meccanismi che portano all'instaurarsi dell'infezione latente, come anche quelli che regolano il passaggio dall'infezione latente all'infezione produttiva, rimangono ancora da delucidare.
Analogo, elevato impatto sulla salute umana hanno le infezioni sostenute da altri virus erpetici, quali Herpes simplex (HSV), anch'esse ad evoluzione verso uno stato di latenza e possibilità di dare luogo a quadri patologici estremamente gravi in particolari categorie di soggetti a rischio. L'infezione da HSV-1 è la più diffusa tra le infezioni erpetiche umane ed è caratterizzata da lesioni di tipo vescicoloso-ulcerativo a livello della cute e delle mucose, ad andamento benigno nella maggior parte dei casi. La caratteristica principale di tali infezioni è la ricorrenza delle lesioni erpetiche, anche nel soggetto immunocompetente, in seguito a riattivazione della replicazione virale nelle sedi di latenza (neuroni dei gangli sensitivi) ed alla migrazione del virus nei siti periferici corrispondenti alla lesione iniziale. Nei pazienti immunocompromessi, come in seguito ad infezioni perinatali, l'HSV-1 può essere causa di quadri morbosi anche estremamente gravi, diffondendo dai neuroni dei gangli sensitivi al sistema nervoso centrale e ad altri organi. Si ritiene che il virus Herpes simplex sia frequentemente responsabile di encefalite virale sporadica, di meningite asettica e di gravi forme sistemiche neonatali. Lo stato di latenza consente la permanenza del virus nell'organismo all'interno di cellule differenziate del sistema nervoso, celando il virus alle cellule del sistema immunitario. Oggi sappiamo come lo stato di latenza sia stabilito e mantenuto, ma non sappiamo come prevenirlo o limitarlo. Inoltre, sembra impossibile prevenire le periodiche riattivazioni del virus dallo stato di latenza nei neuroni infetti ad un nuovo ciclo di replicazione in siti periferici. Da ciò si comprende che l'unica soluzione possibile è di prevenire l'instaurarsi dello stato di latenza o agire sulla progenie virale riattivata nei neuroni infetti. Nell'ottica di affrontare la seconda ipotesi, la reale necessità è quella di disporre di un vaccino terapeutico contro HSV-1, diretto a correggere una risposta immunitaria difettosa in individui infettati in modo latente che vanno incontro a frequenti recrudescenze della malattia. Vaccini terapeutici sarebbero dunque rivolti, in particolare, al trattamento di infezioni da HSV-1 ricorrenti, così che essi possano essere impiegati in pazienti con infezioni latenti. Un vaccino terapeutico ideale dovrebbe ridurre la frequenza e/o i sintomi della malattia ricorrente. Gli studi più recenti riguardanti l'immunologia dei vaccini includono l'allestimento di sofisticati sistemi, basati soprattutto sull'uso di peptidi sintetici immunogeni e di adiuvanti alternativi. La selezione di nuovi adiuvanti sintetici offre la possibilità di preparare un vaccino senza l'aggiunta di adiuvanti tradizionali. I composti lipidici sintetici costruiti utilizzando vari lipopeptidi o utilizzando la tecnica ''lipid core peptide (LCP)'', forniscono un'alternativa allettante per la messa a punto di un nuovo sistema vaccinale. Il sistema LCP incorpora lipoaminoacidi associati ad un core di polilisine contenente fino a due peptidi antigenicamente differenti e unicamente progettati per incorporare antigeni, carrier e adiuvanti in una singola entità molecolare; tale sistema essenzialmente combina il peptide ad antigeni multipli con sistemi di tripalmitoil-S-gliceril-cisteina. Recentemente, è stata dimostrata l'efficacia di un vaccino auto-adiuvante multi-antigenico, progettato con la tecnica LCP, sottolineando la potenziale applicazione di tale sistema nello sviluppo di vaccini costituiti da peptidi sintetici nelle infezioni umane.
Le strategie innovative per la produzione di vaccini si sono avvalse anche della tecnica del DNA ricombinante; in particolare, dati sperimentali riguardo a vaccini costruiti con subunità proteiche di glicoproteine di superficie di virus erpetici, legate a molecole adiuvanti convenzionali o di nuova formulazione, si sono dimostrati incoraggianti, anche se non conclusivi, in modelli animali. Più recentemente, forme alternative di vaccini che utilizzano le stesse sequenze di DNA codificante per gli antigeni di interesse, sono al centro di molti studi, potendo indurre una risposta immunitaria sia umorale che cellulare. Studi comparativi sull'efficacia di diverse formulazioni di vaccini, in particolare quelli per HSV, sono necessari ed auspicabili al fine di valutarne le possibilità di successo terapeutico, inizialmente in modelli animali, per poi passare alla valutazione del potere proteggente sull'uomo.
Oltre alla latenza, altra importante forma di persistenza virale nell'ospite si ha, come già accennato, per quei virus che sono in grado di sviluppare infezioni croniche, dopo un primo episodio acuto o un'infezione asintomatica, quali i virus dell'epatite B (HBV) e C (HCV). Quest'ultimo, in particolare, determina, con ancora più elevata frequenza rispetto ad HBV, una epatite cronica associata a danni epatici, che vanno da lesioni istologiche di grado lieve fino a cirrosi e/o epatocarcinoma. Fattori come il genotipo, la carica virale e la durata dell'infezione sembrano coinvolti nella progressione della malattia.
Sono noti sei genotipi di HCV; il genotipo 1 è il più diffuso nei Paesi occidentali, quindi anche in Italia (oltre il 50% dei casi). Le mutazioni che si verificano con frequenza elevata nel genoma di HCV, giustificano il concetto di "quasispecie", che esprime l'estrema variabilità del virus, base molecolare importante per la mancata eradicazione dello stesso e la conseguente cronicizzazione dell'infezione.
In effetti, HCV si comporta nell'ospite infetto come una complessa miscela di varianti geneticamente distinte ma strettamente affini, che costituiscono sottopopolazioni virali coesistenti. Le "quasispecie" virali si trovano in un punto di equilibrio che viene influenzato da diverse circostanze quali un continuo accumulo di mutazioni nucleotidiche durante la replicazione del virus, condizione che porta alla rapida generazione di nuove varianti; pressioni selettive esercitate dall'ambiente in cui il virus si replica, in particolar modo indotte dalle risposte immuni che possono essere sia spontanee, sia sotto l'influenza di fattori esogeni come la somministrazione di farmaci antivirali. L'interferone alfa rappresenta il trattamento di elezione dell'epatite cronica da HCV; attualmente, il protocollo terapeutico è basato su una associazione di interferone alfa "pegilato" (cioè una molecola di interferone legata ad una molecola di polietilenglicole per assicurare concentrazioni elevate di interferone dopo singole iniezioni settimanali) e ribavirina, un analogo sintetico della guanosina. Quando ha successo, tale terapia porta alla eliminazione del virus (dato avallato dall'assenza di RNA di HCV dopo 24 settimane di trattamento) e concomitante eradicazione dell'infezione. Tuttavia, il fallimento terapeutico (in pazienti, cosiddetti "non-responder") si verifica nel 24% dei pazienti infetti con genotipo 2 e nel 18% con genotipo 3, mentre in quelli con genotipo 1 la percentuale di insuccesso raggiunge il 54-58%.
Nei paesi dove l'infezione con HCV è diffusa, anche l'infezione con HBV è alta e, di conseguenza, una coinfezione con i due virus è frequente e sembra sia associata con un più severo danno epatico. Il ruolo relativo svolto dai due virus infettanti nel determinare il quadro clinico finale non è tuttavia ben definito e può rappresentare un valido modello di studio, anche in prospettiva della risposta terapeutica dei soggetti coinfettati.
Nell'ambito di infezioni virali che non di rado esitano nella mancata eradicazione dell'agente virale, sono da annoverare anche quelle sostenute da PB19. Tale virus dà luogo ad infezioni acute con possibili conseguenze diverse sul piano clinico, ma sta emergendo anche come virus in grado di persistere nell'ospite, con modalità e conseguenze in gran parte non ancora chiarite. Per prima è emersa la capacità di PB19 di persistere in soggetti immunodepressi, nei quali, in mancanza di una adeguata risposta immunitaria, il virus non viene eliminato e determina un danno midollare prolungato che può manifestarsi come anemia cronica. L'uso di tecniche di amplificazione del genoma virale ha consentito di dimostrare che l'infezione da parvovirus può persistere anche in individui immunocompetenti e che altre cellule, oltre ai progenitori eritroidi, possono essere infettate e, forse, costituire una possibile sede di persistenza del virus. Le cellule permissive per la replicazione virale sono i progenitori eritroidi in attiva proliferazione, mentre non è attualmente noto in quali cellule e con quali modalità il virus persista. Il recettore cellulare principale per il virus B19 è l'antigene P, presente anche alla superficie di diversi tipi di cellule; capsidi virali possono legarsi anche ad altri glicosfingolipidi neutri di vari tessuti. Il virus è quindi in grado di interagire anche con altri tipi di cellule. Inoltre, alfa5beta1 integrina è un co-recettore per l'ingresso del virus nelle cellule. La permissività delle cellule alla replicazione del virus dipende anche dalla presenza di fattori cellulari espressi nella fase S. Nell'ambito di studi volti a chiarire il ruolo dell'infezione persistente da PB19 in alcune malattie autoimmuni del connettivo, tra cui l'artrite reumatoide (AR) e la sclerosi sistemica (SSc), è stato dimostrato che: - in cellule sinoviali di pazienti con AR è presente virus infettante e che l'infezione induce la sintesi di IL-6 e TNFα.; - l'esposizione al virus di fibroblasti da tessuto sinoviale normale induce l'acquisizione di un fenotipo invasivo; - DNA di PB19 è presente nei fibroblasti ottenuti da biopsie cutanee di pazienti con SSc; - in sezioni di tessuto da lesioni cutanee di pazienti con SSc, la presenza di sequenze di DNA di PB19 e di messaggeri virali è stata dimostrata mediante PCR in situ in fibroblasti, cellule endoteliali e cellule infiammatorie perivascolari. Sono state individuate varie attività delle proteine virali, e, soprattutto, della NS1, nei progenitori eritroidi o tramite transfezione del gene virale in diversi sistemi cellulari. NS1 ha attività di DNA "binding", di elicasi e ATPasi, transattiva il promotore virale p6 e vari promotori cellulari, ha attività citotossica, induce l'arresto del ciclo cellulare in fase G1, ed infine induce apoptosi. Grazie all'attività transattivante, induce inoltre la sintesi di IL-6 e di TNFα. Le proteine strutturali del virus inibiscono la formazione di colonie ematopoietiche da cellule staminali ottenute da fegato fetale, da sangue cordale o da midollo osseo di adulti e la regione unica di VP1 ha attività fosfolipasica "A2-like". Non è stata finora studiata la risposta immunitaria cellulo-mediata verso PB19 nelle infezioni persistenti. <<<