RICERCA ITALIANA     

Lotta biologica e integrata contro Aspergillus carbonarius: effetti sul contenuto di ocratossina A e sulla filiera viti-vinicola

Università Cattolica del Sacro Cuore

Abstract

La ricerca proposta si ricollega, e costituisce uno sviluppo, di un progetto europeo attualmente in corso "WINE-OCHRA RISK" (www.ochra-wine.com) il cui coordinatore è coordinatore anche di questo progetto. L'impiego di mezzi di lotta contro A. carbonarius, principale responsabile della sintesi d OTA in vigneto, al fine di ridurre il contenuto di questa tossina, rappresenta una parte marginale in "WINE-OCHRA RISK".
In questo progetto proposto si intende invece sviluppare la gestione fitosanitaria del vigneto nel contesto della produzione biologica ed integrata, con l'intento di minimizzare il contenuto di OTA. Particolare rilievo viene dato all'impiego di agenti di lotta biologica contro A. carbonarius.
Il progetto affronta la tematica con una visione di filiera. Pertanto, obiettivi del progetto sono anche: la valutazione dell'eventuale effetto di questi microrganismi sulla vinificazione, l'identificazione dei prodotti di degradazione dell'OTA e la valutazione della loro tossicità comparata con quella dell'OTA. Si tratta di un progetto multidisciplinare in cui le unità operative, ciascuna impegnata in 1-2 fasi della ricerca, interagiscono fra loro apportando competenze maturate in settori differenti quali la patologia vegetale, con particolare riferimento ai funghi micotossigeni e alla lotta biologica, le tecnologie alimentari, soprattutto riguardo alla vinificazione, la chimica analitica, applicata a matrici alimentari, e le scienze mediche applicate, alla valutazione della tossicità cellulare.

Il progetto sarà sviluppato in 5 fasi, da intendersi non in successione temporale, ma come attività volte a produrre un risultato che costituisce la base di partenza per altre fasi di attività.
La Fase 1- Selezione di agenti di biocontrollo, ha lo scopo di selezionare agenti di biocontrollo sulla base di:
- elevata attività antagonistica contro A. carbonarius
- buona compatibilità con fungicidi e insetticidi usati nell'ecosistema-vite in disciplinari di agricoltura biologica e integrata;
- sopravvivenza in presenza di OTA in vitro e in bacche infettate da A. carbonarius e capacità di degradazione della micotossina.
La Fase 2 - Valutazione dell'efficacia degli agenti di biocontrollo in vigneto e su uve in appassimento, ha lo scopo di:
- valutare l'impiego di agenti di biocontrollo contro A. carbonarius in piani di lotta biologica e lotta integrata in vigneto per valutarne l'efficacia, soprattutto nella riduzione del contenuto di OTA.
- valutare l'impiego di agenti di biocontrollo contro A. carbonarius su uva destinata all'appassimento soprattutto in relazione alla riduzione del contenuto di OTA
La Fase 3 - Microvinificazione di uve ottenute con lotta integrata e biologica, ha lo scopo di:
- valutare un eventuale effetto degli agenti di biocontrollo sulla vinificazione e sulle caratteristiche finali del vino
La Fase 4 - Individuazione di residui di agrofarmaci e prodotti di degradazione, ha lo scopo di:
- caratterizzare con metodi cromatografici i metaboliti prodotti dai singoli agenti di biocontrollo testati durante il progetto
- identificare strutturalmente, principalmente mediante metodologie di tipo spettrometriche, i sottoprodotti del metabolismo degradativi dell'OTA
- valutare la persistenza di alcuni dei principali agro-farmaci utilizzati nel corso del progetto per la lotta integrata.
La Fase 5 - Studio dell'effetto tossico di ocratossina A e prodotti di degradazione ha lo scopo di:
- Definire il potenziale di tossicità dell'ocratossina A in linee cellulari di determinare la dipendenza da concentrazione e tempo di esposizione con stima della dose letale 50%
- Selezionare tre linee cellulari da usare come biosensori in esperimenti di citotossicità con matrici reali complesse.
- Ottenere informazioni dettagliate sui meccanismi pro-apoptogenici dell'OTA.
Il progetto costituisce un approccio di filiera, con attenzione alla salute del consumatore, che potrà costituire in futuro un riferimento anche per l'applicazione su altre filiere <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Paola BATTILANI Università Cattolica del Sacro Cuore

Obiettivo del Programma di Ricerca

La ricerca proposta si ricollega, e costituisce uno sviluppo, di un progetto europeo attualmente in corso "WINE-OCHRA RISK" (www.ochra-wine.com) il cui coordinatore è coordinatore anche di questo progetto. L'impiego di mezzi di lotta contro A. carbonarius, principale responsabile della sintesi d OTA in vigneto, al fine di ridurre il contenuto di questa tossina, rappresenta una parte marginale in "WINE-OCHRA RISK".
In questo progetto si intende invece sviluppare la gestione fitosanitaria del vigneto nel contesto della produzione biologica ed integrata, con l'intento di minimizzare il contenuto di OTA.
Particolare rilievo viene dato all'impiego di agenti di lotta biologica contro A. carbonarius. Pertanto, obiettivi del progetto sono anche: la valutazione dell'eventuale effetto di questi microrganismi sulla vinificazione, l'identificazione dei prodotti di degradazione dell'OTA e la valutazione della loro tossicità comparata con quella dell'OTA. Si tratta di un progetto multidisciplinare in cui le unità operative, ciascuna impegnata in 1-2 fasi della ricerca, interagiscono fra loro secondo lo schema che segue.



Unità Operative coinvolte nel progetto:
- Unità Operativa Università di Piacenza, responsabile Paola Battilani UO_PC
- Unità Operativa Università di Campobasso, Responsabile Vincenzo De Cicco UO_CB
- Unità Operativa Università di Napoli, Responsabile Alberto Ritieni UO_NA
- Unità Operativa Università di Bari, Responsabile Luigi Macchi UO_BA





Pertanto gli obiettivi principali del programma possono essere così sintetizzati:

• Sviluppo di procedure innovative per l'abbattimento dell'infezione da Aspergillus carbonarius su uva, mediante metodologie basate sull'uso di agenti di lotta biologica e ridotto uso di fungicidi
• Sviluppo di procedure innovative per l'abbattimento della contaminazione della micotossina Ocratossina A (OTA) nella filiera vitivinicola

Seguendo un approccio di filiera e tenendo in considerazione la sanità degli alimenti, ulteriori obiettivi perseguiti sono:
• Caratterizzazione di microrganismi attivi nel controllo di A. carbonarius su uva
• Descrizione dell'andamento del processo fermentativo, della presenza di OTA nelle varie fasi della vinificazione e dei caratteri chimico-fisici e sensoriali dei vini
• Identificazione dei metaboliti prodotti dagli agenti di biocontrollo dalla degradazione dell'OTA in mosto
• Identificazione strutturale dei sottoprodotti del metabolismo degradativo dell'OTA
• Definizione della persistenza di alcuni dei principali agro-farmaci utilizzati nel corso del progetto per la lotta integrata.
• Definizione della tossicità dell'OTA in differenti linee cellulari di mammiferi ed invertebrati
• Definizione dei meccanismi cellulari e molecolari della tossicita' da OTA, in particolare sui meccanismi pro-apoptotici
• Definizione delle condizioni di analisi di citotossicità da OTA in matrici reali
• Definizione degli eventuali effetti citotossici dei prodotti di degradazione dell'OTA <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Base di partenza scientifica
Le micotossine
I consumatori oggi sono particolarmente attenti alla qualità degli alimenti, almeno nei paesi più sviluppati e le micotossine (MT) costituiscono uno dei maggiori pericoli per la loro salute (FAO, 1999).
Le MT sono strutturalmente un gruppo eterogeneo di metaboliti secondari con varie bioattività tossiche; le MT sono sintetizzate da funghi aerobi obbligati appartenenti per lo più ai generi Aspergillus, Fusarium e Penicillium .
Le MT entrano nella catena alimentare in modo diretto, attraverso prodotti di origine vegetale contaminati, o indiretto, tramite il carry-over, con prodotti derivati da animali alimentati a loro volta con mangimi contaminati da MT. Con il carry-over le MT ed i loro eventuali metaboliti/cataboliti si accumulano nel latte, nella carne e nelle uova e costituiscono ancora un rischio per l'uomo.
Le MT negli alimenti sono un problema attuale ed alcune stime indicano che il 25% degli alimenti risulta contaminato da MT a livello analiticamente evidente (WHO, 1992).
Tra le MT, grande importanza ha l'ocratossina A (OTA). Isolata inizialmente nel 1965 da van der Merwe et al. (1965) da A. ochraceus, è chimicamente una diidrometil-isocumarina legata con un legame ammidico alla L-b-fenilalanina (Rizzo, et al., 2002).
In Europa, l'OTA è probabilmente la MT piùdiffusa, infatti nel centro Europa (Svezia, Germania, Danimarca e Regno Unito) è ritrovata sino a 0.1 mg/kg in oltre il 90% di campioni di sangue umano esaminati (Petzinger e Weidenbach 2002).

Tossicità dell'ocratossina
OTA è una potente nefrotossina per tutte le specie animali testate, con la sola eccezione dei ruminanti adulti. Nell'ambito dei possibili cancerogeni per l'uomo, attualmente l'OTA è classificata dall'Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) nel gruppo 2B. L'OTA può essere escreta nel latte e mettere a rischio la salute di neonati alimentati con latte materno.
Con un intenso lavoro di ricerca, svolto negli ultimi 10 anni, si e' tentato di definire il possibile impatto dell'OTA sulla salute umana e numerosi modelli in vivo ed in vitro sono stati proposti ed usati per questi studi (Fink-Gremmels, 1995; Mantle, 1998; Schaaf, 2002). In particolare, è stata avanzata l'ipotesi che il danno cellulare renale, che costituirebbe la base della nefropatia indotta da OTA potrebbe essere sostenuto da meccanismi di tipo apoptotico (Mantle, 1998).
Tuttavia, nonostante i cospicui risultati che questi studi hanno prodotto, le nostre informazioni riguardanti lo spettro di citotossicità dell'OTA appaiono ancora frammentarie ed i meccanismi che, a livello cellulare e molecolare, sostengono gli effetti tossici osservati ed, in ultima analisi, condizionano l'importanza di questa MT per la salute dell'uomo, rimangono non ben definiti.

Fonti alimentari di ocratossina
La presenza mondiale di contaminazione da parte di OTA delle derrate alimentari è stata ampiamente documentata; si trova in una grande varietà di prodotti vegetali come cereali, semi di caffè, fagioli e altri legumi (Kuiper-Goodman and Scott, 1989; Pohland et al., 1992; Jørgensen, 1998). L'OTA è stata individuata anche in bevande quali la birra e recentemente anche nel vino e nel succo d'uva (Majerus and Otteneder, 1996; Zimmerli and Dick, 1996).
Dopo la prima individuazione di OTA nel vino nel 1996, sono stati condotti diversi monitoraggi, principalmente in Europa al fine di definire l'entità del problema. Queste ricerche hanno confermato la presenza di OTA nel vino, talvolta in concentrazioni elevate. Secondo un'indagine condotta a livello comunitario, il vino è ritenuto la seconda fonte di OTA per l'uomo dopo i cereali (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA, 2001). Diversi autori hanno messo in evidenza un gradiente di concentrazione di OTA nei vini, rossi>rosé>bianchi (Zimmerli and Dick, 1996; Visconti et al.,1999; Rosari et al., 2000; Filali et al., 2001), mentre in Grecia pare che la concentrazione di OTA nei vini rossi secchi non sia significativamente differente da quella dei vini bianchi e rosé (Stefanaki et al., 2003).
La quantità di OTA è influenzata dalla latitudine delle regioni di produzione dell'uva: più bassa è la latitudine, maggiore è la concentrazione della tossina. Le notevoli differenze climatiche delle diverse regioni geografiche sono in grado di influenzare sia la contaminazione fungina che la produzione di OTA (Zimmerli and Dick, 1996; Otteneder and Majerus, 2000; Rosari et al., 2000; Pietri et al., 2001; Eder et al., 2002; Stefanaki et al. 2003). Le differenze nella quantità di OTA prodotta, probabilmente dovuta alle differenti condizioni climatiche, sono state riportate anche da Pietri et al. (2001) e da Lopez de Cerain et al. (2002) per campioni raccolti nelle stesse regioni, ma in anni differenti.
L'uva essiccata può essere un'ulteriore ed importante fonte alimentare di OTA. Ricerche svolte da MacDonald et al. (1999), Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA ( 2001) e Stefanaki et al. (2003) hanno mostrato un'alta frequenza di campioni positivi, con valori talvolta elevati (massimo 53.6µg/kg). Per questo motivo, la Commissione Europea (2002) ha fissato un limite di 10 µg/kg per l'OTA nell'uvetta essiccata.
Il limite per il vino non è ancora stato definito, ma con ogni probabilità verrà fissato a 2 ppb ed entrerà in vigore dalla vendemmia 2005, sulla base anche delle raccomandazioni dell'OIV (Office International de la vigne et du vin).


Ocratossina A nell'uva e nel vino
Il problema "OTA" ha origine nel vigneto. Gli Aspergilli della sezione Nigri, ed in particolare l'A. carbonarius, sono i responsabili della sintesi dell'OTA nell'uva. Questi funghi sono sempre presenti nei vigneti e possono essere isolati dai grappoli a partire dai primi stadi di sviluppo degli acini, anche se la loro presenza diventa rilevante dall'inizio invaiatura.
Il contenuto di OTA ottenuto da campioni di uva prelevati ad inizio invaiatura è sempre risultato basso o assente anche nei casi in cui la contaminazione alla maturazione è risultata rilevante. Di conseguenza, il periodo tra inizio invaiatura e maturazione può essere considerato cruciale per l'accumulo di OTA; quindi, i fattori in grado di influenzare la crescita fungina e la sintesi dell'OTA, in particolare le condizioni meteorologiche, necessitano di essere monitorati attentamente durante questo periodo.
Per quanto riguarda il sistema colturale, diversi parametri sembrano essere rilevanti, come la varietà, il sistema di allevamento o i fungicidi utilizzati, ma finora sono disponibili solo dati di prove preliminari in vitro riguardo all'effetto dei fungicidi sulla produzione di OTA (Battilani et al., 2003).

Controllo di A. carbonarius in campo
La riduzione dell'impiego dei fungicidi e della contaminazione da MT delle derrate alimentari sono due importanti risposte alle esigenze scientifiche e sociali espresse dalla Priorità Tematica 5, Qualità e Sicurezza Alimentare, del 6° Programma Quadro dell'Unione Europea.
Una strategia promettente per ridurre l'uso di fungicidi è basata sull'impiego di microrganismi antagonisti (Biocontrol agents: BCA) da soli (lotta biologica) o in combinazione/alternanza con dosi ridotte di fungicidi (lotta integrata).
Attualmente non sono disponibili prodotti specifici efficaci contro i patogeni dell'uva responsabili della contaminazione di OTA, anche se qualche risultato promettente è stato ottenuto.
Riguardo ai BCA, questi dispongono di un insieme di meccanismi d'azione complesso e rendono improbabile l'insorgenza di ceppi del patogeno resistenti. Molti ricercatori hanno affrontato lo studio dei meccanismi d'azione dei BCA, mettendo in evidenza l'importanza della competizione per lo spazio e per i nutrienti (De Curtis et al., 1996; Castoria et al., 2001, 2003; Janisiewicz e Korsten, 2002; Droby e Chalutz, 1994).
Diversi ceppi di lieviti e di funghi lievitiformi con elevata attività antagonistica ed un ampio spettro d'azione contro B.cinerea, P.expansum, A.niger, R.stolonifer, M.laxa su diverse specie di frutta in post-raccolta sono stati isolati e caratterizzati (De Curtis et al., 1996; Arras et al., 1998; Lima et al., 1998a), studiandone i meccanismi d'azione (Castoria et al., 2001, 2003). Alcuni di questi ceppi sono risultati molto efficaci anche quando applicati in pre-raccolta (Lima et al., 1997; Lima et al., 2002). In particolare, ottimi livelli di contenimento della muffa grigia su fragola e uva da tavola sono stati ottenuti applicando gli antagonisti durante la fioritura (Ippolito e Nigro 2000; Lima et al., 1997; Wisniewski et al., 1991).
L'uso di BCA nella lotta ai funghi fitopatogeni, in particolare a quelli micotossigeni, può rappresentare una risposta innovativa anche al problema MT, che sinora l'uso della lotta chimica non ha risolto. L'impiego di fungicidi, anche se efficace, non può azzerare gli attacchi dei miceti patogeni e, nel caso dei micotossigeni, la pur bassa percentuale di piante/derrate attaccate è la fonte della contaminazione da MT. Una volta avvenuta l'infezione da parte del fungo micotossigeno, il fungicida residuo non è in grado di inibire la sintesi delle tossine. Per contro, i BCA sono "elementi attivi", cioè microrganismi vitali potenzialmente in grado di inibire la sintesi di tossine, o di degradare queste sostanze.
Ciò è stato verificato nel caso di Rhodotorula glutinis LS11, lievito in grado di degradare la MT patulina in vitro e, nella pur bassa percentuale di mele attaccate da P. expansum (produttore della MT), di rimanere vitale, determinando una significativa diminuzione dell'accumulo di tossina (Logrieco et al., 2002).
Dati preliminari, inoltre, suggeriscono che alcuni ceppi di antagonisti sono in grado di degradare l'OTA in vitro (Castoria et al., 2004); in particolare, il ceppo LS30 di Aureobasidium pullulans, recentemente caratterizzato a livello molecolare (De Curtis et al., 2004, submitted), ha mostrato elevata attività antibotritica su vite in campo (dati non pubblicati).

Effetto dei mezzi di controllo di A. carbonarius sulla vinificazione
L'OTA è sintetizzata in vigneto e le operazioni di vinificazione ne consentono solo una sua parziale riduzione (Silva et al. 2003). Tutti i trattamenti effettuati in vigneto debbono essere valutati in funzione dell'efficacia sulla presenza di OTA, ma anche in relazione all'influenza sul processo di trasformazione delle uve e sulla qualità globale del prodotto ottenuto. Da queste premesse risulta evidente l'importanza di verificare se l'uso di trattamenti per controllare lo sviluppo e l'attività di A. carbonarius sulle uve possa modificare il naturale ecosistema mosto-vino con ripercussioni negative sul processo fermentativo.
Lieviti, batteri e funghi hanno, infatti, un ruolo preminente nel determinare le caratteristiche chimiche dei vini: influenzano la qualità dell'uva prima della raccolta e durante la fermentazione i lieviti metabolizzano gli zuccheri e gli altri componenti dell'uva formando etanolo, CO2 e numerosi prodotti minoritari che, globalmente, incidono sulla finezza e sull' individualità dei caratteri dei vini. Vari fattori influiscono sullo sviluppo dei lieviti durante la fermentazione alcolica, quali l'entità della popolazione iniziale e la diversità delle specie e dei ceppi nel mosto, l'inoculo di colture starters, la composizione chimica del succo, i parametri di processo e le interazioni tra le differenti specie e ceppi di lievito (Fleet, 2003).
Diversi sono i meccanismi attraverso cui un lievito può influenzare lo sviluppo e l'attività di altri microrganismi: la disponibilità di nutrienti (sostanze azotate, vitamine, composti carboniosi, ecc.) e la formazione di certi metaboliti, quali gli acidi grassi e l'etanolo. Tali fattori modulano l'ecologia dei lieviti in fermentazione; ad esempio Saccharomyces cerevisiae, grazie alla sua capacità di formare elevate quantità di alcool, anche se scarsamente frequente sulle uve, prende il sopravvento durante il processo fermentativo sui lieviti Non -Saccharomyces. Questi ultimi sono di scarso interesse enologico e sono dotati di caratteri non positivi per la qualità dei vini (Fleet, 2003; Loureiro et al., 2003).
Inoltre gli acidi grassi a corta e media catena quali acido esanoico, ottanoico e decanoico, che si formano durante la fermentazione in quantità variabili da specie a specie e da ceppo a ceppo, influenzano sensibilmente la sequenzialità dello sviluppo dei lieviti durante il processo fermentativo.
D'altra parte le specie Non-Saccharomyces, sviluppando nelle prime fasi della fermentazione alcolica, possono sottrarre nutrienti a S. cerevisiae con conseguenti fermentazioni lente, incomplete o bloccate. Se lieviti Non-Saccharomyces sviluppano durante la fermentazione alcolica, possono essere formati in elevata quantità composti quali acido acetico, idrogeno solforato ed altri composti solforati volatili e etil-fenoli, con un impatto sensoriale negativo per il vino (Romano et al., 2003). <<<