RICERCA ITALIANA     

Studi sull'attività biologica di estratti vegetali con particolare riguardo alle Meliaceae

Università degli Studi di Bologna

Abstract

Nell'ultimo ventennio si è verificato nei paesi occidentali un aumento della sensibilizzazione verso le problematiche ambientali, con un conseguente maggiore interesse verso pratiche agricole che garantiscano il rispetto dell'ambiente e la commercializzazione di prodotti esenti da residui chimici dannosi per il consumatore. Numerose sono state le ricerche avviate per valutare il possibile utilizzo di sostanze di origine naturale in vari settori: difesa, gestione della fertlità del suolo e dello stato nutrizionale della pianta, e controllo dello sviluppo di microrganismi dannosi nel settore agro-alimentare e farmaceutico. Nel presente studio sarà valutata l'attività biologica di estratti di Meliaceae nei confronti di artropodi fitofagi e loro nemici naturali, microrganismi di interesse agroalimentare e farmaceutico, flora batterica del suolo con particolare riguardo alla mineralizzazione dell'azoto nel terreno, e l'attività antiossidante degli estratti vegetali per applicazioni come conservanti e anti-radicali liberi in ambito agroalimentare e farmaceutico. A tal scopo verranno utilizzati estratti di Melia azedarach L. ottenuti da porzioni diverse di pianta e da tessuti allevati in vitro di genotipi selezionati; in particolare verrà utilizzato materiale vegetale di un clone micropropagato di Melia azedarach. Tali estratti saranno confrontati con prodotti commerciali (es. neem cake, derivato da Azadirachta indica)) ed estratti di altre piante (es. Artemisia absinthium e Annona spp.) per cui sono già disponibili alcuni dati relativamente all'attività su artropodi. Saranno inoltre messi a punto differenti metodi di estrazione e individuate le correlazioni tra procedure di estrazione, materiali vegetali e attività dei composti. Saranno inoltre valutati il polimorfismo genetico di Melia azedarach e l'eventuale insorgenza di variabilità somaclonale nel materiale vegetale derivato da colture in vitro, in relazione all'attività biologica degli estratti, e la tossicità degli estratti rispetto a cellule animali. I risultati ottenuti verranno utilizzati per eventuali applicazioni pratiche e commerciali. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Bruno MARANGONI Università degli Studi di BOLOGNA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'obiettivo del presente progetto è la valutazione dell'attività biologica di estratti di Meliaceae (Melia azedarach e Azadiracta indica) rispetto a:

1. Artropodi fitofagi di importanza economica e loro nemici naturali.
In particolare saranno condotte ricerche di laboratorio e prove di pieno campo sulle proprietà biocide di estratti di Melia azedarach nei confronti dei seguenti fitofagi e nemici naturali:
a) Ceratitis capitata Wied., Bemisia tabaci (Genn.), Trialeurodes vaporariorum (Westw.);
b)Tetranychus urticae Koch) - due specie di acari predatori della famiglia Phytoseiidae (Phytoseiulus persimilis Athias-Henriot e Cydnodromus californicus (McGregor).
c) Myzus persicae Sulz. e Aphis fabae Scop. (Homoptera: Aphididae) - Adalia bipunctata L. (Coleoptera: Coccinellidae) – Aphidius spp. (Hymenoptera: Aphiididae).
d) Pseudaulacaspis pentagona (Targioni) (Homoptera: Diaspididae) - Chilocorus bipustulatus L. (Coleoptera: Coccinellidae) – Encarsia berlesei Howard (Hymenoptera: Chalcidoidea).
e) Nezara viridula L. (Heteroptera: Pentatomidae) - Trissolcus basalis Woll. (Hymenoptera: Scelionidae).
Nei confronti di tutte le specie sopra elencate, inoltre, saranno saggiati anche alcuni estratti di Artemisia absinthium e Annona spp.

2. Microrganismi procarioti ed eucarioti d'interesse agro-alimentare e farmaceutico.
L'attività degli estratti di Melia azedarach e altre piante (es. Artemisia absinthium e Annona spp.) e la loro minimal inhibitory concentration (MIC) saranno valutate su batteri isolati dal suolo, dalle piante e dagli animali, come Pectobacterium, Pseudomonas, Xantomonas, Rhizobium (generi che svolgono un importante ruolo in agricoltura), Bacillus, Clostridium, Bifidobacterium, Streptococcus, Lactobacillus (generi di interesse agroalimentare e farmaceutico) e su diverse specie di lievito. Inoltre saranno determinate le proprietà antiossidanti degli estratti vegetali per applicazioni come conservanti e anti-radicali liberi in ambito agroalimentare e farmaceutico. Verrà inoltre valutata, su germogli di fruttiferi allevati in vitro, l'attività antimicrobica degli estratti su ceppi batterici (es. Bacillus circulans, Pseudomonas paucimobilis) ritrovati come contaminanti di colture vegetali.

3. Flora batterica del suolo.
L'effetto dei derivati di Meliaceae sull'attività microbica del terreno sarà studiato con particolare riguardo al processo di nitrificazione (lento rilascio di N), al fine di modulare questo effetto in modo da regolare la disponibilità di N minerale alle esigenze dell'albero. L'attività degli estratti sarà inoltre confrontata con quella di prodotti chimici e naturali (es. neem cake, derivato da Azadirachta indica) disponibili in commercio. Le variazioni dell'attività microbica relative all'utilizzo degli estratti verranno valutate sulla base della respirazione del suolo (Soil Induced Respiration).

4. Differenti tecniche di estrazione.
Sarà determinata la composizione quali-quantitativa di estratti ottenuti da differenti parti (foglie, radici, frutti, semi) di Meliaceae e altre piante (es. Artemisia absinthium e Annona spp) e da materiale allevato in vitro (germogli, calli, colture cellulari) di Melia azedarach
Sarà inoltre valutata l'attività di miscele artificiali preparate con quantità modificate delle molecole con migliore attività biologica. Sarà anche studiata la possibilità di preparare formulati su matrice polimerica a velocità di rilascio controllata.

Verranno utilizzati dalle differenti UO estratti preparati a partire da porzioni diverse di piante (es. foglie, frutti, radici, semi) e da tessuti allevati in vitro di genotipi selezionati di Melia azedarach L. Tali estratti saranno confrontati, in modo variabile da parte delle differenti UO, con prodotti commerciali derivati da Azadirachta indica A. Juss (es. neem cake) ed estratti di altre piante (es. Artemisia absinthium e Annona spp.) per cui sono già disponibili alcuni dati relativamente all'attività su artropodi. Per un migliore confronto delle attività biologiche nei diversi settori, va sottolineato che si potrà utilizzare materiale vegetale di un clone micropropagato di Melia azedarach, di cui sono già disponibili numerose piante adulte e si presume potranno esserlo in tempi brevi anche colture in vitro (germogli, calli, colture cellulari) in quantità idonea alle sperimentazioni in programma. A tale scopo saranno messi a punto protocolli che permettano di ottenere una produzione costante nel tempo di callo omogeneo, a partire da tessuti adulti di genotipi di Melia azedarach selezionati e l'ottenimento dai calli di sospensioni cellulari caratterizzate da attiva crescita. Verrà studiata in particolare l'influenza di fattori chimico fisici sulla crescita delle colture e sulla produzione di azadiractina e di eventuali altri composti ad attività biologica nei differenti sistemi analizzati (colture di germogli, calli, sospensioni cellulari).

Saranno valutati inoltre: 1. L'insorgenza di variabilità somaclonale nel materiale vegetale derivato da colture in vitro di Melia azedarach, allo scopo di verificare l'uniformità del materiale di partenza; 2. Il polimorfismo genetico della specie in relazione all'attività biologica degli estratti; 3. La tossicità rispetto a cellule animali degli estratti che avranno rivelato maggiore attività biologica.

Sono previsti incontri semestrali al fine di valutare lo stato di avanzamento dell'attività e, sulla base dei risultati parziali ottenuti, indirizzare in maniera più mirata le successive fasi della ricerca, nell'ambito degli obiettivi prefissati. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Nell'ultimo ventennio si è verificato nei paesi occidentali un aumento della sensibilizzazione verso le problematiche ambientali, con un conseguente maggiore interesse verso pratiche agricole che garantiscano il rispetto dell'ambiente e la commercializzazione di prodotti esenti da residui chimici dannosi per il consumatore. In Italia, la superficie agricola a conduzione biologica è passata da 91.500 ettari nel 1993 (MIRAAF, 1998) agli attuali 1.168.212 ettari (Sansavini e Kelderer, 2004), che corrispondono a circa l'8% della SAU, con un aumento della richiesta di prodotti di origine naturale inorganica o vegetale e fitofarmaci a basso impatto ambientale da utilizzare in Agricoltura Biologica e nei programmi di controllo integrato. Numerose sono state le ricerche avviate per valutare il possibile utilizzo di sostanze di origine naturale in vari settori: difesa, gestione della fertlità del suolo e dello stato nutrizionale della pianta, e controllo dello sviluppo di microrganismi dannosi nel settore agro-alimentare e farmaceutico. Nel settore dell'ortoflorofrutticoltura, la progettazione di sistemi eco-compatibili, integrati o biologici, richiede l'ottimizzazione dello sfruttamento delle risorse naturali, in modo da soddisfare sia le esigenze nutrizionali delle piante (Weinbaum et al., 2002) che la disponibilità di nutrienti per l'assorbimento radicale (Tagliavini et al., 1996). Particolare attenzione è stata rivolta al controllo della clorosi ferrica in piante erbacee e specie arboree da frutto in vivo (Matocha, 1984; Rombolà et al., 2002) e in vitro (Marino et al., 2004) mediante l'utilizzo di derivati di piante (es. Amaranthus spp, Urtica dioica) in alternativa ai trattamenti con chelati di ferro sintetici (Tagliavini and Rombolà, 2001). Il ricorso a fertilizzanti organici in sostituzione dei concimi di sintesi ha determinato inoltre un crescente interesse verso gli ammendanti compostati di qualità (Centemero M., 2002), per i quali mancano tuttavia informazioni relativamente alle condizioni che permettono un efficace riciclo di nutrienti attraverso la mineralizzazione della sostanza organica. Spesso si assiste ad una eccessiva disponibilità di nitrati come conseguenza della somministrazione di sostanza organica. L'inibizione della nitrificazione potrebbe essere un interessante mezzo per limitare la presenza di nitrati e con essa i rischi di lisciviazione dell'N nelle acque di falda. Numerose sono le specie vegetali che hanno dimostrato un'azione inibitoria della nitrificazione, tra esse l'Azadirachta indica (neem) (Majumbdar et al., 2002; Panda et al., 1988), l'olio di Artemisa annua e di Menta spicata (Usha e Patra, 2003). Nel settore della difesa, l'approccio ecochimico, basato su relazioni pianta-insetto sembra essere uno dei più promettenti metodi di controllo. Alcune sostanze di origine vegetale hanno mostrato un buon controllo nei confronti di diverse specie di artropodi fitofagi, mostrando un'azione variabile, ma in molti casi ridotta, riguardo ai vari nemici naturali (Ragusa Di Chiara et al., 2002; Tsolakis et al., 2004); le molecole di sintesi sono apparse invece una delle cause principali di esplosioni demografiche dei fitofagi per il loro impatto negativo sulle popolazioni degli entomofagi (Croft, 1990). Le modalità di azione di questi composti naturali sono risultate di diversi tipi: tossica, ormonosimile, sterilizzante, fagodeterrente e repellente, spesso esplicate contemporaneamente e con entità variabile nei confronti delle diverse specie (Di Ilio et al., 1999; Klocke e Kubo, 1982; Mansour et al., 1997; Rembold et al., 1984; Schmutterer, 1987; Tsolakis et al., 2002; Tsolakis e Ragusa, 1999). Appare tuttavia necessaria la determinazione delle singole molecole ad attività biologica, in modo da consentire la registrazione di nuovi prodotti nel rispetto delle vigenti normative europee; infatti attualmente sono presenti sul mercato solo tre fitofarmaci di origine vegetale, che non riescono a coprire le esigenze di questo settore. Numerose ricerche hanno riguardato inoltre l'attività antimicrobica di estratti vegetali (Brul e Coote, 1999; Gould, 1996), in alternativa agli antibiotici, verso cui i microrganismi hanno sviluppato una certa resistenza a seguito del loro uso indiscriminato. E' stata così dimostrata una spiccata specificità delle sostanze verso i diversi ceppi batterici (Biavati et al., 2003; Croom e Walker, 1995; Kalemba e Kunica, 2003;) e un'elevata attività antimicrobica soprattutto degli estratti contenenti strutture fenoliche, come carvacrol, eugenolo e timolo (Dorman e Deans, 2000). Benchè quando si parla di microrganismi patogeni o che producono alterazioni si è soliti pensare ad attività batteriche, anche numerose specie di lievito vengono ritrovate con frequenza piuttosto alta e possono rappresentare un problema come microrganismi alteranti, in campo agro-alimentare; tra gli altri, i lieviti apiculati appartenenti alle specie Hansensiaspora (Kloeckera), numerose specie di Candida, Zygosaccharomyces e altri lieviti dotati di vigorosa attività fermentativa, come Saccharomyces cerevisiae e specie affini (Ribereau et al., 2000; Rodriguez e Fonseca, 2003; Romano, 2003). I gruppi botanici più promettenti nel fornire sostanze biocide sono Meliaceae, Rutaceae, Asteraceae, Annonaceae, Lamiaceae, Aristolochiaceae e Malvaceae, alcune delle quali sono state caratterizzate come piante aromatiche (Duke, 1985). In particolare, la specie tropicale Azadirachta indica A. Juss, (fam. Meliaceae), albero del neem, che viene impiegata per molteplici usi nei paesi di origine (farmaceutico, zootecnico, ecc.) è stata studiata prevalentemente per le sue proprietà di pesticida naturale, di ridotto impatto ambientale, per gli effetti negativi sulla nutrizione, crescita e riproduzione degli insetti (Mordue(Luntz) e Blackwell, 1993). Questi effetti sono imputabili soprattutto al tetratriterpenoide azadiractina, presente in maggiore quantità nei semi, ma anche in altri tessuti della pianta; inclusi quelli allevati in vitro (Allan et al., 1994) e la cui concentrazione è risultata variabile in relazione alla condizioni di coltura e al genotipo (Wewetzer, 1998). Vengono inoltre riportati alcuni risultati incoraggianti relativi all'efficacia di derivati da tessuti del neem come inibitori della nitrificazione (Majumbdar et al., 2002; Panda et al., 1988). Più recentemente, è tuttavia emersa l'esigenza di estendere le ricerche a specie della stessa famiglia che crescono nei climi temperati, supponendo per esse un'attività simile al neem. Ad esempio, è stata verificata l'attività biocida di estratti di semi di Melia volkensii su micobatteri (Cantrell et al., 1999). Particolarmente interessante risulta Melia azedarach L., ampiamente utilizzata come pianta ornamentale per il bel fogliame e le graziose infiorescenze; è moltiplicata prevalentemente per seme e talea, ma è risultata di facile propagazione in vitro, anche partendo da espianti di piante adulte (Shahzad e Siddiqui, 2001; Thakur et al., 1998). Sono inoltre riportati in Letteratura risultati preliminari sulla possibilità di stabilire colture di cellule in sospensione di Melia azedarach partendo da calli ottenuti da semenzali (Handro e Floh, 2001). Tuttavia non esistono dati relativi alla crescita durante subcolture ripetute di calli derivati da tessuti di piante adulte, ne' ricerche specifiche relative alle sospensioni cellulari. Gli estratti di frutti e foglie e di tessuti allevati in vitro hanno mostrato attività biocida su uova e larve di insetti di diverse specie (Banchio et al., 2003; Hammad et al., 2000; Hammad et al., 2001; Marangoni et al., 2004) e su funghi (Sharma, 1995), comparabile a quelle di altri pesticidi biotici e sintetici. Tale attività è stata imputata prevalentemente alla presenza di azadiractina, ma anche a nuovi terpenoidi e limonoidi (Bohnenstengel et al., 1999). Alcuni di questi composti hanno peraltro mostrato una certa tossicità verso cellule animali (Zhou-HongLei et al., 2004). Gli obiettivi principali del progetto sono quelli di verificare in vivo ed in vitro l'attività biologica di derivati di Meliaceae in campo entomologico, microbiologico e nella gestione della fertilità del suolo in sistemi colturali eco-compatibili. <<<