RICERCA ITALIANA     

Analisi di macro- e micro-sintenia tra cereali per l'identificazione di geni di importanza agronomica

Università degli Studi di Bologna

Abstract

La conservazione di un riconoscibile ordine cromosomico dei geni (sintenia) tra specie filogeneticamente vicine fornisce l'opportunità di utilizzare specie a genoma semplice per facilitare il clonaggio di geni di interesse in specie coltivate a genoma complesso. Tra i cereali, la specie a genoma più semplice (440 Mb) è il riso (Oryza sativa) e per questo è stata scelta come modello. Il recente ottenimento della sequenza dell'intero genoma di riso ha notevolmente aumentato il potenziale impatto sulla genomica dei cereali di un maggiore utilizzo delle informazioni di sintenia.
Questo progetto si propone di utilizzare le relazioni di sintenia tra riso, orzo e mais, al fine di mappare geneticamente e fisicamente una serie di geni di importanza agronomica in orzo e mais, e porre le basi per il loro clonaggio. Forte enfasi verrà data all'identificazione di geni candidati, che verranno identificati sulla sequenza annotata di riso sintenica a quella del locus oggetto di studio nella specie originale. Il progetto si propone anche di sequenziare una porzione del genoma di mais (ca. 2 Mb), ed eventualmente di una più breve sequenza corrispondente di orzo. Oltre a consentire l'identificazione di geni candidati ai loci oggetto di questo studio, l'ottenimento di tale informazione di sequenza permetterà un'estesa analisi di microsintenia riso-orzo-mais e, più in generale, fornirà informazioni sull'organizzazione e sull'evoluzione del genoma dei cereali. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Roberto TUBEROSA Università degli Studi di BOLOGNA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il presente progetto, utilizzando una serie di attività tra loro integrate, si pone come obiettivo la mappatura di loci di interesse agronomico di orzo e mais in relazione a geni candidati ed ove possible in relazione alla mappa fisica. Le attività verteranno attorno all'utilizzo della sintenia tra cereali, che consentirà di semplificare e migliorare le fasi di mappatura genetica e fisica e l'identificazione di geni candidati. Attraverso una significativa attività di sequenziamento, il progetto contribuirà a chiarire la struttura del genoma di mais e di orzo; tale attività consentirà, a sua volta, di migliorare le conoscenze riguardanti la sintenia tra riso, orzo e mais per le regioni sede dei geni bersaglio e fornirà informazioni sull'organizzazione e sull'evoluzione del genoma dei cereali.

I loci oggetto di studio, per i quali si procederà ad una mappatura genetica fine (risoluzione pari almeno ad 1 cM) ed eventualmente alla mappatura fisica, sono:
• root-ABA1, un QTL che influenza la struttura dell'apparato radicale e controlla l'accumulo di acido abscissico nella foglia (L-ABA) in mais (Tuberosa et al., 1998; Landi et al., 2005);
• i mutanti gametofitici di mais GaMS1 (Sari-Gorla et al., 1996) e Ga-1 (Ziegler e Ashman, 1994);
• 2-3 mutanti dello sviluppo di orzo, scelti tra una lista iniziale di 40 mutanti già mappati in orzo (Pozzi et al., 2000, 2003).

Due fra i loci di mais oggetto di studio, root-ABA1 e GaMS1, mappano sul cromosoma 2, bin 2.04. GaMS1 è compreso nell'intervallo di supporto (1-LOD supporting interval) entro cui è stato localizzato il QTL root-ABA1. (Vedi figura).



E' quindi possibile che, a seguito della mappatura fisica di questi due loci, essi vengano localizzati entro una regione di dimensioni tali da poter essere completamente sequenziata nell'ambito di questo progetto (ca. 2 Mb, corrispondenti a ca. 20 cloni BAC).

Se possibile, verranno sequenziati anche 1-3 BAC di orzo per una porzione ortologa alla regione di mais. Il sequenziamento avrà lo scopo di facilitare l'identificazione di geni candidati ai loci oggetto di studio in mais e consentirà di svolgere un'ampia analisi di microsintenia mais-riso (ed eventualmente orzo) a livello di sequenza di DNA. Il livello di risoluzione dell'analisi di microsintenia fornirà informazioni dettagliate sul tipo e numero di riarrangiamenti cromosomici, sia per sequenze geniche che intergeniche e/o ripetute, avvenuti nelle Poaceae dopo la loro divergenza evolutiva da un progenitore comune (50-70 milioni di anni fa), L'ottenimento ed il confronto di significative porzioni di sequenza genomica tra riso, orzo e mais porrà inoltre le basi per migliorare l'identificazione e lo studio di regioni regolative dell'espressione genica tramite l'identificazione di regioni conservate non codificanti (CNS: Conserved Non-coding Sequences. Inada et al., 2003).
Per alcuni dei geni candidati studiati in orzo, il numero di alleli disponibili verrà eventualmente ampliato tramite ricerca in una popolazione di tipo TILLING che è in via di sviluppo presso la UR1 (Salvi et al., 2004). <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

SINTENIA E SUO UTILIZZO.
Sebbene esista notevoli differenze in numero cromosomico e contenuto in DNA tra le specie della famiglia delle Poaceae, esse mostrano una elevata conservazione nella struttura del genoma per quanto concerne l'ordine lineare dei geni sui cromosomi. Tale caratteristica è stata osservata inizialmente nel corso di studi di mappatura genica comparativa, in cui le stesse sonde RFLP a copia singola venivano mappate su popolazione di mappa di specie diverse (bibliografia riassunta in Gale and Devos, 1998). Il confronto basato sulla disponibilità di campioni di sequenze genomiche ha recentemente dimostrato che le differenze in dimensioni del genoma sono attribuibili in gran parte al diverso contenuto e livello di duplicazione di sequenze trasponibili nelle regioni intergeniche (SanMiguel et al., 1996). Queste osservazioni hanno portato allo proposta di un modello di lavoro, definito del clonaggio posizionale comparativo (Feuillet and Keller, 1999) o clonaggio posizionale basato su piccoli "surrogate genomes" (Bennetzen and Ma, 2003), in cui i geni oggetto di studio sono mappati approssimativamente nella specie coltivata a genoma complesso, ma le lunghe e costose fasi di chromosome walking sono svolte in una specie imparentata, a genoma più semplice. Pur con le dovute cautele, tali considerazioni si applicano anche al clonaggio di QTL (Salvi and Tuberosa, 2005). Per i cereali, la specie modello è il riso, grazie al suo piccolo genoma (ca. 440 Mb), già completamente sequenziato ed in via di annotazione (Goff et al., 2002; Yu et al., 2002; www.tigr.org). E' anche opportuno sottolineare che sono state realizzate analisi per valutare il livello di sintenia tra specie filogeneticamente distanti come Arabidopsis e riso (Devos et al., 1999; Van Buuren et al., 2002). Purtroppo, i risultati hanno mostrato un alto numero di riarrangiamenti genomici, tali da precludere l'utilizzo della sintenia con Arabidopsis per il clonaggio posizionale nei cereali.

ANALISI DI MICROSINTENIA A LIVELLO DI SEQUENZA DI DNA.
Dati recenti basati sul confronto diretto di sequenze contigue di DNA di orzo (Dubcovsky et al., 2001; Brunner et al., 2003) e mais (Tarchini et al., 2000; Song et al., 2003; Swigonova et al., 2005) con riso hanno mostrato che esistono molte eccezioni, sia riguardanti sequenze codificanti che non, alla pur identificabile generale colinearità. Tali osservazioni hanno portato a concludere che il clonaggio posizionale comparativo è possibile ma anche che un'occasionale assenza di colinearità può riscontrarsi anche in regioni che appaiono perfettamente sinteniche al livello di mappa genetica tradizionale (Bennetzen and Ramakrishna, 2002, Delseny, 2004).
Tuttavia, pur in situazioni di occasionale assenza di microcolinearità, la sintenia con riso offre ampie possibilità di i) incrementare il numero di marcatori nelle regioni oggetto di studio (per esempio trasformando le sequenze a singola copia di riso in sonde a fini di mappatura genetica o fisica) senza la necessità di produrre tali marcatori nella specie di interesse (Feuillet and Keller, 2002); ii) identificare più facilmente CGs grazie alle informazioni di annotazione e di funzionalità genica disponibili nelle specie modello (Pflieger et al., 2001).
Tutti gli studi di microsintenia svolti finora e fondati sul confronto di sequenze di DNA hanno comparato porzioni cromosomiche relativamente brevi (delle dimensioni di qualche clone BAC) con la sequenza genomica di riso. Si sono realizzati dei progetti pilota di sequenziamento del genoma di mais basati su metodi in grado di arricchire di sequenze codificanti la porzione sequenziata (Palmer et al., 2003; Whitelaw et al., 2003) ed il sequenziamento sistematico di terminazioni di inserti di cloni BAC (Messing et al., 2004). Sulla base dei primi promettenti risultati, un progetto relativamente economico potrebbe basarsi sul sequenziamento della porzione del genoma contenente i geni (ca. 16-17% del totale) insieme ad un sequenziamento veramente parziale (grado di copertura medio dell'1x) di un serie di cloni BAC rappresentanti un contig minimo di copertura del genoma, ma agganciati alla mappa genetica (Martienssen et al., 2004). Anche in assenza di una sequenza genomica, le principali specie di cereali possiedono un vasto assortimento di strumenti di analisi del genoma che facilitano il clonaggio posizionale. Le specie qui oggetto di studio, mais ed orzo, hanno entrambe mappe genetiche rappresentative basate su marcatori molecolari, amplie collezioni di EST, librerie BAC e database pubblici disponibili su siti dedicati (www.maizegdb.org; www.graingenes.org). Il recupero, sulla base delle relazioni di sintenia, di EST e geni (ORFs) candidati alle funzioni oggetto di studio dovrebbe perciò essere alla portata di questo progetto.
Il trasferimento di informazione da riso alla specie oggetto di studio si può realizzare in modi diversi, a seconda della specie e del locus. In orzo, come in altri cereali, è possibile usare le sequenze dei marcatori più prossimi al locus bersaglio per cercarne di omologhe in riso. Da riso, le sequenze geniche prossime ai marcatori possono essere poi rimappate in orzo direttamente o tramite l'identificazione di una EST di orzo omologa. I marcatori o sequenze geniche più prossime potrebbero essere usate per lo screening di librerie BAC. In mais, la disponibilità in rete di due mappe fisiche (www.genome.arizona.edu/fpc/maize; www.genome.arizona.edu/fpc_hicf/maize), associate alla mappa genetica grazie ad un gran numero di sonde sequenziate a singole copia ("overgos"), consente di svolgere un "chromosome walking" elettronico quasi completo. Tramite ricerca BLAST, a partire da sequenze a singola copia (per esempio, dai marcatori che fiancheggiano il locus oggeto di studio) e mappate sui cloni BAC, è possibile allineare i cloni sulla sequenza genomica di riso. L'alto numero di tali sequenze consente la verifica della microcolinearità riso-mais su tutta la regione del contig (M. Morgante, com. personale). Sulla base dell'annotazione della sequenza di riso si procederà all'identificazione di CG e/o all'identificazione dell'intervallo fisico di mais da sequenziare.
Il problema del riconoscimento e dell'utilizzo a fini di miglioramento genetico di dati di microsintenia tra cereali ha ulteriori livelli di complessità. Il confronto di ca. 100 kb di sequenza di DNA al locus Bronze di due linee di mais ha consentito di identificare differenze sia nel contenuto in trasposoni sia nel numero di geni, indicando una locale mancanza di microcolinearità intraspecifica (Fu and Dooner, 2002). Tale livello di divergenza è apparentemente maggiore di quello osservato tra le due sottospecie di riso, indica e japonica (Feng et al., 2002; Song et al., 2002). E' quindi ovvio che violazioni della microcolinearità entro mais sono da tenere in considerazione quando si cerca di determinare le relazioni di sintenia riso-mais. Recentemente, il confronto di sequenze genomiche tra specie filogeneticamente vicine si sta proponendo come un sistema per il riconoscimento di sequenze regolative dell'espressione genica. L'assunto è che, entro certi limiti, anche le sequenze non codificanti che svolgono un ruolo regolativo sono sottoposte a vincoli funzionali che ne impediscono una veloce modificazione evolutiva e possono quindi essere riconosciute come sequenze conservate (chiamate CNS: Conserved Non-coding Sequences) (Hardison, 2000). Il confronto di tali sequenze fra mais e riso ha già portato all'identificazione di diverse CNS (Inada et al., 2003).

GENI OGGETTO DI STUDIO.
I caratteri oggetto di studio in questo progetto sono: la concentrazione di acido abscissico nella foglia (L-ABA) e l'apparato radicale di mais, lo sviluppo del gametofito di mais e caratteri legati allo sviluppo in orzo.
L'acido abscissico riveste un ruolo centrale nella modulazione della risposta adattativa della pianta alla stress idrico (Zeevaart and Creelman, 1988; Sharp, 1994; Tuberosa et al. 2002; Tuberosa 2004). Nel germoplasma coltivato di mais, il carattere L-ABA è sottoposto ad un controllo genetico di tipo quantitativo per il quale sono già stati identificati svariati QTL (Tuberosa et al., 1998). La caratterizzazione di un "major" QTL per L-ABA ha mostrato che tale QTL ha un effetto anche su caratteristiche della radice (Landi et al., 2005). La mappatura fine del QTL consentirà di chiarire se l'effetto sui caratteri correlati sia dovuto a pleiotropia di un unico gene o a concatenazione di geni diversi sottesi a root-ABA1, e potrebbe consentire di realizzare il clonaggio posizionale del/i gene/i alla base del QTL.
Lo sviluppo del gametofito maschile richiede l'azione integrate di molti geni (Bedinger et al., 1994). In mais sono già stati descritti e mappati alcuni mutanti per lo sviluppo del gametofito maschile (Sari-Gorla et al., 1997; Fink et al., 2001). L'isolamento dei geni alla base di tali funzioni avrà implicazioni non solo per lo studio della biologia del polline ma anche per il miglioramento della tecnologia dell'impollinazione nella produzione di seme ibrido e per il controllo della dispersione del polline in coltivazioni transgeniche.
In orzo è stata caratterizzata una importante collezione di ca. 40 mutanti dello sviluppo (Castiglioni et al., 1998; Pozzi et al., 2003, Roig et al., 2004). Molte di tali mutazioni influenzano caratteri agronomici quali l'altezza della pianta, l'accestimento, la morfologia della foglia e la struttura e la fertilità della spiga. L'isolamento dei geni corrispondenti ad alcune di queste mutazioni contribuirà alla comprensione dei meccanismi molecolari alla base dello sviluppo dei cereali. <<<