RICERCA ITALIANA     

L'UTILIZZO DELLE CELLULE STAMINALI NELLA RIPARAZIONE DELLE LESIONI CARTILAGINEE. STUDIO SU MODELLO ANIMALE.

Università degli Studi di Sassari

Abstract

L'obiettivo della ricerca è quello di valutare la capacità condrogenica di cellule staminali derivanti da embrioni di pecora prodotti in vitro inoculate in difetti cartilaginei. Verranno studiate le caratteristiche cliniche, biomeccaniche, istologiche, immuno-istochimiche ed ultrastrutturali del rigenerato e la sua integrazione con i tessuti vicini.
Verranno contestualmente definite le metodiche per ottenere sia le cellule staminali del cordone ombelicale di pecora che quelle embrionali e del cordone ombelicale di cane e di gatto, per successive applicazioni sperimentali e cliniche. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Eraldo SANNA PASSINO Università degli Studi di SASSARI

Obiettivo del Programma di Ricerca

È noto che la cartilagine articolare, una volta danneggiata, non è in grado di rigenerarsi. L'assenza di vascolarizzazione, il lento turn-over molecolare e cellulare, l'incapacità da parte dei mediatori dell'infiammazione di raggiungere la sede del danno cartilagineo spiegano come mai le lesioni cartilaginee non tendono alla guarigione. Lesioni anche di modesta entità possono comportare alterazione della funzionalità articolare, con idrarto, ipotrofia muscolare, intolleranza all'esercizio fino a determinare osteoartrosi, patologia invalidante, algica e correlata a disfunzione articolare che colpisce sempre più spesso soggetti in giovane età. Il trattamento è complesso e le tecniche chirurgiche utilizzate per riparare le superfici articolari, quali il debridement o la mosaico plastica, non consentono di ottenere risultati soddisfacenti a lungo termine, in quanto determinano la formazione di tessuto fibrocartilagineo o simile alla cartilagine ialina con caratteristiche istologiche e biomeccaniche diverse dalla cartilagine articolare nativa.
Prove sempre più numerose indicano che ogni tessuto possiede cellule staminali. La nostra comprensione della biologia delle cellule staminali rivela che questa popolazione di cellule svolge un ruolo critico nell'omeostasi e nella riparazione tessutale.
Al di là di determinate aree selezionate, alcuni altri compartimenti del corpo, come il midollo osseo possono rappresentare riserve di popolazioni di cellule staminali.
Nei danni tessutali più gravi, vengono richiamate popolazioni di cellule di riparazione che, migrano da riserve di cellule staminali situate anche in sedi distanti guidate dalla risposta locale, contribuiscono al processo riparativo.
L'obiettivo della ricerca è di valutare se cellule staminali ovine di origine embrionale, quando inoculate in difetti cartilaginei articolari, possono differenziarsi in condrociti.
Verranno valutate le caratteristiche cliniche, biomeccaniche, istologiche, immuno-istochimiche ed ultrastrutturali del tessuto rigenerato e verrà studiata la sua integrazione con i tessuti vicini. Lo studio delle capacità condrogeniche delle cellule staminali embrionali rappresenta un punto di passaggio per poter arrivare ad impiegare le cellule staminali del cordone ombelicale. L' interesse di poter sostituire le cellule staminali embrionali con quelle del cordone ombelicale è dovuto ad una serie di motivi, tra i quali la tendenza delle prime alla trasformazione in cellule oncogene, dimostrata in diverse specie animali, come osservato nel caso di impianti su cartilagine effettuati nel topo.
La possibilità di ottenimento, con isolamento, caratterizzazione e conservazione di cellule staminali dal cordone ombelicale è ben nota, nonostante non sia ancora ben chiaro quali siano le loro potenzialità. Questo ha suscitato grande interesse in campo clinico poiché rappresenterebbe il presupposto per l'allestimento alla nascita, di una banca di cellule staminali autologhe che possano essere eventualmente impiegate nella cura di patologie insorte in età adulta.
Per questo motivo verranno definite le metodiche per ottenere le cellule staminali di origine embrionale e del cordone ombelicale di cane, per successive applicazioni sperimentali e cliniche.
La fase iniziale del progetto prevede di perfezionare le metodiche di preparazione e di conservazione di cellule staminali (stem like cells) embrionali della pecora e di verificare la loro capacità di differenziarsi in condrociti quando inoculate in lesioni cartilaginee.
Al momento, infatti, nel laboratorio dell'Istituto Zootecnico Caseario della Sardegna vengono utilizzate un grande numero di blastocisti in pool per ottenere nuclei di cellule staminali pluripotenti in numero teoricamente sufficiente per un trapianto su lesioni cartilaginee. Lesioni sperimentali del diametro di 6 mm sono state create sul condilo mediale del femore ovino e sono state trattate con impianto di cellule di origine embrionale di ovino (400.000 cellule per nucleo cellulare dopo 7 giorni di coltura), con risultati incoraggianti. Ad una indagine istologica del reperto necroscopico ottenuto dopo 20 gg dal trapianto, si evidenzia una zona di cellule di nuova formazione da riferirsi alle cellule staminali non ancora differenziatesi. Tali cellule dopo preparazione dei tessuti sono state sottoposte ad indagine immuno-istochimica con anticorpi specifici per le cellule staminali e per i tessuti in differenziazione. Gli anticorpi utilizzati sono i SSEA1 e SSEA3 (stage specific embrionic antigen), Fe-C6 (early mesoderm), F1-652 (embryonal myosin). I SSEAs hanno dato risposta negativa (evidentemente le cellule non erano più staminali) invece Fe-C6 e F1-652 hanno dato una netta positività lasciando pensare che le cellule stessero già differenziandosi verso la linea condrocitaria. Infatti il mesoderma è il foglietto embrionale da cui origina la cartilagine. Attualmente sono in corso test specifici volti a valutare la validità di determinate metodiche che sono state utilizzate. In particolare, con anticorpi specifici per tessuti di origine mesodermica, verranno trattati tessuti originati dagli altri foglietti embrionali, l'ectoderma (cute) e l'endoderma (ghiandole).
La ricerca impiegherà la pecora come modello sperimentale per diversi motivi.
Prima di tutto gli embrioni di pecora sono, nella nostra regione, di semplice reperimento e presentano una relativa semplicità di isolamento e di moltiplicazione in coltura. Al momento presso i laboratori dell'Istituto Zootecnico Caseario della Sardegna è possibile isolare, mantenere in coltura e caratterizzare cellule staminali embrionali derivanti da blastocisti ovine.
Inoltre, la struttura e lo spessore della cartilagine articolare dell'ovino (1,68 mm circa sul condilo laterale del femore) sono molto simili a quelle dell'uomo (2,2-2,4 mm) e del cane (1,3 mm).
Infine la semplice accessibilità all'articolazione femoro-tibio-rotulea nonché la facilità di creare lesioni riproducibili suggeriscono l'impiego di questa specie come modello animale per studi sperimentali sulla rigenerazione della cartilagine.
Il ricorso ad animali adulti consentirà di riprodurre lo stesso tipo di modificazioni che subisce la cartilagine nei pazienti che si incontrano nella pratica clinica.
L'esame clinico e la valutazione biomeccanica in vivo, l'esame istologico, immuno-istochimico ed ultrastrutturale costituiranno i parametri per la valutazione del grado di guarigione e della funzionalità del tessuto riparativo in presenza o meno di cellule staminali.
Verranno contestualmente definite le metodiche per ottenere sia le cellule staminali del cordone ombelicale di pecora che quelle embrionali e del cordone ombelicale di cane e di gatto, per successive applicazioni sperimentali e cliniche.
Il progetto si propone di isolare e coltivare, per la prima volta sulla specie canina, "stem like cells" embrionali derivate da blastocisti di cagna, prodotte in vivo e vetrificate, intraprendendo approfonditi studi per perfezionare le metodiche e per migliorare l'efficienza delle colture individuando quali siano le possibili condizioni di coltura ottimali che permettono di mantenere in vitro tali cellule indifferenziate per diversi passaggi. A questo proposito sono stati individuati fattori che in altre specie animali svolgono un ruolo importante nel mantenimento delle colture cellulari. Tali fattori, o combinazioni di fattori, uniti a medium di coltura potrebbero risultare importanti anche per il mantenimento delle colture in vitro per la specie canina.
Il progetto prevede la messa a punto di metodiche di caratterizzazione per accertare lo stato di pluripotenza delle colture. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I difetti cartilaginei superficiali o a pieno spessore di aree articolari sottoposte a carico sono comuni sia in medicina umana che veterinaria. Il loro trattamento è complesso a causa della ridotta capacità di rigenerazione da parte della cartilagine articolare.
È noto infatti che la cartilagine adulta possiede un turn-over cellulare e molecolare molto lento. Inoltre, a causa dell'assenza di vascolarizzazione, la cartilagine non può essere raggiunta dai mediatori dell'infiammazione che sono fondamentali nei normali processi riparativi.
I fattori che influiscono nel processo di riparazione sembrano essere la sede, la profondità e l'ampiezza della lesione nonché il grado di maturazione della cartilagine.
I difetti condrali (superficiali) possono restare a lungo come tali senza presentare segni di guarigione, oppure essere colmati da tessuto fibroso, fibrocartilagineo e più di rado, da cartilagine ialina, che comunque non arriva mai a coprire tutta la lesione. Le lesioni che coinvolgono l'osso subcondrale hanno invece capacità riparative di poco superiori, anche se di efficacia variabile. I difetti a tutto spessore possono riempirsi completamente di cartilagine immatura che in pochi mesi darà origine a tessuto fibroso o fibrocartilagineo.
La maggiore capacità di riparazione delle lesioni a tutto spessore rispetto a quelle più superficiali indica che il processo riparativo può essere mediato dalla proliferazione e differenziazione di cellule mesenchimali del midollo osseo e non da condrociti presenti sulle pareti della lesione. Per questo motivo le lesioni a carico degli strati superficiali, intermedio e profondo mostrano differenti capacità di riparazione. Relativamente all'estensione, la guarigione dei difetti cartilaginei ampi è meno soddisfacente rispetto a quelle delle lesioni più piccole. I difetti osteocondrali situati in aree che articolano con un'altra superficie cartilaginea guariscono meno rispetto a quelli che non articolano con la cartilagine.
Al contrario, i difetti piccoli ed a tutto spessore negli animali giovani rigenerano completamente. Tale capacità di rigenerazione sembra dipendere dall'accesso nell'area lesionata di cellule progenitrici osteocondrali presenti nel midollo osseo.
Nonostante alcuni soggetti non sviluppino alcun problema clinico derivante da tali difetti cartilaginei, il più delle volte, associate al danno cartilagineo, si creano alterazioni degenerative. Queste degenerazioni sono progressive e divengono irreversibili con lo sviluppo di osteoartrosi, patologia invalidante, correlata a disfunzione articolare che sempre più spesso colpisce soggetti in giovane età.
In medicina veterinaria le tecniche chirurgiche utilizzate per riparare le superfici articolari, quali il debridement, non consentono di ottenere risultati soddisfacenti a lungo termine, in quanto determinano la formazione di tessuto fibrocartilagineo con caratteristiche istologiche e biomeccaniche diverse da quelle della cartilagine articolare. Di conseguenza, il risultato che si riesce ad ottenere è solo un ritardo nello sviluppo del progressivo processo artrosico. L'impiego di innesti osteocondrali e di condrociti autologhi, ancora a livello sperimentale in medicina veterinaria, trova applicazione clinica soprattutto nel cane.
In medicina umana l'aspetto terapeutico è un problema importante come evidenziato dalle stime secondo le quali da 10 a 12 milioni di italiani di tutte le età soffrono di artrosi degenerativa, diventata progressiva a partire da lesioni condrali acute o croniche.
Un recente studio retrospettivo su 31516 artroscopie di ginocchio ha dimostrato un'incidenza di lesioni condrali di III grado di Outerbridge del 41% e di IV grado del 19,2%, sottolineando la prevalenza di queste lesioni nella pratica medica ortopedica. Nel corso degli anni sono state utilizzate numerose tecniche chirurgiche per il trattamento della cartilagine articolare danneggiata, tra le quali: il debridement e lavaggio, l'abrasione artroplastica, le perforazioni subcondrali e le microfratture.
Le lesioni trattate mediante queste procedure, soprattutto quelle più ampie (>2cm2), spesso richiedono più di un intervento chirurgico. Ciascuna di queste tecniche ha riportato una differente percentuale di successo in relazione alla formazione di un tessuto fibrocartilagineo o simil ialino dotato, comunque, di proprietà biomeccaniche inferiori alla cartilagine articolare nativa. Molti di questi pazienti diventano gravemente o completamente menomati e la protesi totale dell'articolazione, ove possibile, rimane l'unica alternativa per eliminare il dolore.
Un innovativo approccio alla riparazione dei difetti della cartilagine articolare è basato sui principi dell'ingegneria tissutale che utilizza condrociti "commissionati" isolati, fatti crescere in coltura, successivamente impiantati nei difetti cartilaginei articolari e, in alcuni casi, mantenuti in sede mediante un flap periostale. I primi studi condotti sul coniglio nel 1984 prevedevano il trapianto in lesioni focali della rotula di condrociti autologhi precedentemente espansi in vitro: un anno dopo il trapianto l'esame della regione ha evidenziato che il 70% circa del difetto era coperto da un neo tessuto simil cartilagineo.
Questi incoraggianti risultati hanno dato un grande impulso per ulteriori ricerche e prove sia sperimentali che cliniche.
Sebbene i risultati clinici nell'uomo riportino, ad un minimo di due anni dall'intervento, un miglioramento clinico nell'80% dei pazienti, la vitalità a lungo termine di questo tessuto rimane ancora in dubbio, e sono necessari ulteriori studi per definire il ruolo dei condrociti "commissionati" nella riparazione dei difetti parziali ed a tutto spessore della cartilagine articolare adulta.
Nonostante nell'uomo l'impianto di condrociti autologhi nella riparazione della cartilagine articolare costituisca ormai una realtà, sono diversi i limiti della metodica e i dubbi sui risultati a distanza. I principali limiti sono rappresentati da:
- necessità di eseguire due interventi chirurgici; il primo per raccogliere le cellule da espandere in vitro e il secondo per l'impianto;
- è indispensabile avvalersi di un laboratorio attrezzato per l'espansione in vitro delle cellule;
- il numero di cellule ottenute in vitro deve essere sufficiente per colmare il difetto presente nel paziente;
- l'integrazione con il tessuto ospite circostante è in genere incompleta, anche se i difetti cartilaginei vengono sostituiti con cartilagine simil ialina vitale;
- sebbene la qualità del tessuto rigenerato che si ottiene nei casi più favorevoli sia simile alla cartilagine ialina, l'esame artroscopico, la biopsia e l'imaging con R.M.N. non sono in grado di dimostrare il ripristino biomeccanico del rigenerato.
Un altro approccio alla riparazione cellulo-mediata della cartilagine prevede l'utilizzo di cellule staminali. Le cellule staminali possiedono particolari caratteristiche che le rendono differenti dalle altre cellule. In sintesi sono definite da due aspetti fondamentali:
- sono indifferenziate, non specializzate e mantengono la capacità di moltiplicarsi in modo illimitato o prolungato senza differenziarsi;
- sono sensibili a stimoli che le rendono capaci di dare origine a cellule altamente differenziate e specializzate.
In realtà le cellule staminali sono molto diverse tra loro: differiscono nella capacità di dare origine ad un tessuto oppure ad un altro, rispondendo a determinati segnali che ne guidano il loro sviluppo. In base a questa caratteristica si possono distinguere in:
- Totipotenti. Hanno la capacità di generare tutti i tessuti che formeranno l'embrione e che ne supporteranno lo sviluppo in utero. La loro capacità di differenziazione è elevata se si considera che l'individuo adulto possiede circa 200 tipi di cellule differenti, oltre quelle "extra-embrionali" della placenta e del cordone ombelicale. Solo le cellule dell'embrione nel primo stadio di sviluppo (fino a 16-32 cellule) sono totipotenti;
- Pluripotenti. Sono in grado di differenziarsi nei diversi tipi cellulari, a partire dai tre foglietti embrionali primitivi, dai quali avranno origine tutte le cellule specializzate dell'organismo animale, ma nono le cellule embrionali. Sono pluripotenti le cellule nelle prime fasi di sviluppo embrionale (blastocisti) e le cellule dei tessuti fetali dai quali origineranno le gonadi. Le cellule staminali embrionali, chiamate appunto ES (Embrionic Stem Cells) costituiscono la "massa cellulare interna" ICM (Inner Cell Mass). In vivo le cellule staminali pluripotenti hanno una vita piuttosto breve, in quanto tendono a differenziarsi rapidamente; in opportune condizioni di coltura in vitro è invece possibile mantenerne la pluripotenza.
- Unipotenti. Possono dar luogo soltanto a cellule specializzate di un determinato tessuto od organo. Questo termine è comunemente usato per le cellule staminali adulte. Ogni tessuto dispone di una riserva di staminale anche se questa non è stata ancora individuata in tutti i tessuti. In condizioni normali tale riserva è quiescente e si attiva in seguito a stimoli ormonali ed ambientali a seconda della necessità provvedendo al mantenimento dei tessuti a ricambio rapido e alla loro riparazione in seguito ad un danno. Questi elementi cellulari possiedono una certa plasticità per cui con adeguati stimoli possono de-differenziare, ossia dare origine a cellule istologicamente diverse. In particolare, è dimostrato che le cellule staminali mesenchimali (MSCs) presenti nel midollo possono differenziarsi in osteoblasti, condrociti, mioblasti e adipociti.
Tuttavia, per un'applicazione terapeutica di questa categoria di cellule staminali è necessario risolvere molti problemi legati, prima di tutto, alla loro potenziale malignità. Da studi di differenziazione in vivo è risultato, infatti, che se le cellule staminali embrionali non vengono rifiutate dopo impianto in animali riceventi, possono dare origine a un teratoma benigno, forma tumorale non metastatica che porta lentamente a morte l'animale. Inoltre a causa della naturale eterogenicità cellulare durante le fasi di differenziazione si pone il problema di ottenere una singola linea cellulare. E' importante ottenere in laboratorio il numero di cellule necessario per l'applicazione clinica. Infine deve essere tenuto conto dell'aspetto etico e legislativo che necessariamente interessa questo tipo di ricerca e di applicazione clinica.
Si riporta una applicazione clinica nell'uomo dove, nei difetti cartilaginei dell'articolazione tibioastragalica (a carico dell'astragalo), si e' proceduto ad un trattamento di nove pazienti mediante l'impianto di cellule staminali mesenchimali autologhe CD34+. La procedura chirurgica ha previsto la regolarizzazione del difetto e l'impianto delle cellule con copertura di lembo periostale. I risultati clinici sono stati controllati dopo un periodo variabile tra i 6 mesi ed i 3 anni, mediante valutazione clinica e Risonanza Magnetica, rivelandosi più che soddisfacenti.
E' noto, inoltre, che si possano ottenere cellule staminali dal sangue del cordone ombelicale sebbene non sia ancora ben chiaro quali siano le loro potenzialità. Questi elementi hanno suscitato grande interesse in campo clinico poiché si riconosce la possibilità di creare alla nascita una banca di cellule staminali autologhe che possano essere eventualmente utilizzate per curare patologie insorte nell'età adulta.
Le cellule staminali embrionali sono state ampiamente studiate sul topo, ma l'interesse su di esse è aumentato dopo il loro isolamento e la loro coltura anche nei primati non umani, nell'uomo e negli animali domestici. Tuttavia la strada per la coltura delle cellule staminali si è rilevata piuttosto complicata. Queste cellule sono altamente sensibili ai diversi medium di coltura e ai fattori che li arricchiscono, nonché ai cambiamenti di pH, alla sovrappopolazione, alle variazioni di temperatura etc.. Questo comporta la tendenza ad esprimere anticipatamente i loro naturali processi differenziativi. Allo stato attuale, la capacità di mantenere in vitro presunte cellule staminali, "stem like cells", risulta dunque ancora molto limitata. I metodi di coltura, le vie di segnale e i fattori di trascrizione, coinvolti per ottenere e mantenere cellule staminali derivate da blastocisti di topo, sono stati spesso assunti come riferimento anche per gli studi su diverse specie di mammifero. È stato tuttavia provato che è estremamente difficile ottenere cellule staminali da diverse specie seguendo unicamente i media e le vie di segnale impiegate per le ES di topo. Molte specie richiedono infatti monostrati o terreni condizionati, e diversi fattori di crescita specifici aggiunti al medium per migliorare la crescita in coltura e in grado di intervenire nel mantenimento dello stato indifferenziato delle cellule.
Per quanto riguarda l'isolamento di stem like cells embrionali di origine canina, a fronte della disamina bibliografica, appare evidente che l'argomento non è stato trattato.
Per quanto riguarda il gatto, sono più collaudate le metodiche per la maturazione dei gameti in vitro e la produzione di embrioni in vitro. Sono quindi più conosciute le esigenze delle cellule embrionali, i fabbisogni nutritivi e le risposte alla coltura. Per quanto concerne il cane, la maturazione dell'oocita in vitro è determinata da peculiarità di tipo fisiologico e le esigenze dell'embrione in coltura e le risposte ai diversi substrati colturali non è investigata appieno. Esiste comunque la possibilità di utilizzare embrioni prodotti naturalmente sottoponendo ad ovario isterectomia le cagne coperte da 8/10 giorni per disporre di embrioni vitali e idonei per la lavorazione successiva.
Ci sono indagini riguardanti l'utilizzo di cellule derivate da feti di diversa età gestazionale e cellule da cellule somatiche, derivate dal midollo osso. L'approccio previsto nella nostra ricerca è totalmente innovativo e permette di avere la massima totipotenza e il minor rischio di immuno competenza. <<<