RICERCA ITALIANA     

Metodologie e strategie sintetiche orientate alla creazione di diversità molecolare per la preparazione di molecole biologicamente attive

Università degli Studi di Genova

Abstract

La ricerca proposta si prefigge di sviluppare nuove metodologie per la sintesi orientata alla diversità di librerie di composti con potenziale attività biologica in campo oncologico. Le metodologie saranno progettate in modo da portare a composti basati su ''scaffold'' (''piattaforme molecolari'') di tipo eterociclico e/o peptidomimetico progettati razionalmente sulla base dei target di interesse. Le metodologie/strategie sintetiche che verranno messe a punto dovranno prestarsi bene alla creazione di diversità molecolare e quindi alla preparazione di collezioni di composti (librerie). Queste librerie privilegeranno la qualità rispetto al numero di composti. Saranno perciò relativamente piccole, preparate in modo parallelo e formate da molecole progettate in modo razionale, pure e ben caratterizzate, in quantità di almeno 20 mg per diversomero. Le sequenze sintetiche dovranno essere brevi, convergenti, permettere l'introduzione di diversi ''elementi di diversità'' e prevedere un gradiente elevato di aumento della complessità molecolare per stadio sintetico.
Le applicazioni delle librerie saranno nel campo degli antitumorali non tradizionali "mirati". In particolare saranno esplorate molecole in grado di inibire le Istone Deacetilasi, di esercitare attività agonistica (o anche antagonistica) sul recettore della capsaicina TRPV1 e di interferire con le interazioni tra proteine pro-apoptotiche e anti-apoptotiche.
Onde raggiungere questi scopi i proponenti la ricerca sfrutteranno le loro molteplici e documentate esperienze nel settore, utilizzando alcune strategie o tecnologie di grande rilevanza nella sintesi orientata alla diversità quali: le reazioni multicomponente, le reazioni regiocomplementari, le reazioni domino, la sintesi multiparallela in soluzione con l'ausilio di reattivi e/o ''scavenger'' supportati, l'uso di microonde e le reazioni fotoindotte.
Grande rilevanza verrà anche data all'analisi configurazionale e conformazionale dei componenti delle librerie che verranno via via prodotti. A tale scopo si utilizzerà l'accoppiamento della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare con le tecniche computazionali. Queste ultime saranno impiegate anche nella fase di progettazione o di selezione dei nuovi scaffold (sulla base della loro possibile utilità applicativa per i target oncologici di interesse) e nella progettazione delle librerie basate sugli scaffold stessi, mentre la spettroscopia NMR sarà impiegata in studi di riconoscimento molecolare tra le molecole più promettenti ed i target biomacromolecolari.
L'effettuazione di test di attività biologica dei prodotti sintetizzati costituirà anch'essa una parte essenziale del progetto e verrà realizzata in vitro sia studiando l'interazione con il target molecolare (enzima, recettore, proteina) che mediante studi di attività antiproliferativa e pro-apoptotica su linee cellulari.
Verranno preparati anche coniugati di alcuni degli scaffold eterociclici preparati dalle varie U.R. con sistemi terpenoidi allo scopo di migliorare le caratteristiche farmacodinamiche e farmacocinetiche.
In conclusione, gli obiettivi che questa ricerca biennale si prefigge di raggiungere sono: a) la messa a punto di diverse metodologie originali per la sintesi orientata alla diversità di nuovi scaffold eterociclici di interesse biologico/farmaceutico b) la sintesi di alcune librerie selezionate basate su tali scaffold; c) l'ottenimento di nuovi "hit" dotati di attività biologica nei confronti di target oncologici; d) la creazione di un gruppo di lavoro che comprenda competenze molteplici e possa costituire un punto di riferimento per un settore di ricerca emergente quale la sintesi orientata alla diversità.
L'attività di ricerca delle 5 unità operative sarà fortemente interconnessa, con scambio di competenze, metodologie e scaffold a vari livelli. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Luca Banfi Università degli Studi di GENOVA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Gli obiettivi che il progetto di ricerca si prefigge di ottenere sono i seguenti:
1) La messa a punto di nuove metodologie e strategie orientate alla diversità che si prestino alla sintesi breve ed efficiente di librerie di composti caratterizzati da una struttura eterociclica e/o peptidomimetica "drug-like" (scaffold) decorata da una combinazione di differenti sostituenti.
2) La preparazione, in soluzione ed in modo parallelo, di una serie di librerie di composti basati sugli scaffold citati al punto precedente, selezionate non solo sulla base della potenziale attività biologica dei composti finali (per analogia a lead già noti o con l'ausilio di studi di modelling), ma anche tenendo conto dell'efficienza della sintesi. Le sintesi devono infatti essere brevi, facilmente automatizzabili e portare ad un veloce incremento della complessità strutturale. Le collezioni saranno formate da composti puri ed in quantità relativamente elevata (20-50 mg per diversomero) in modo da poter testare la stessa libreria su differenti target o su linee cellulari, nonché da poter condurre sui composti più promettenti studi conformazionali o di binding con il target.
3) La determinazione dell'attività dei componenti delle librerie preparate come potenziali antitumorali. Questi test verranno condotti sia a livello molecolare (inibizione delle istoni deacetilasi, attività vanilloide, inibizione di interazioni proteina-proteina), che su linee cellulari per evidenziare gli effetti antiproliferativi e l'induzione dell'apoptosi. In alcuni casi i composti potenzialmente attivi saranno coniugati con strutture di tipo terpenoide in modo da migliorare le loro caratteristiche farmacocinetiche e farmacodinamiche.
4) Lo studio, sia con metodi sperimentali (NMR) che computazionali (o per accoppiamento delle due tecniche) delle caratteristiche conformazionali dei prodotti sintetizzati e delle peculiarità strutturali che favoriscono il binding con il target biologico. Questo studio permetterà di progettare nuove librerie più "mirate" di analoghi degli hit trovati preliminarmente.

L'obiettivo ultimo del progetto è quello di identificare hits, esplorarne le relazioni struttura-attività e progettare librerie di analoghi in modo da poter gettare le fondamenta per lo sviluppo di nuovi antitumorali non tradizionali "mirati".

Un importante obiettivo collaterale della ricerca è però anche la creazione, a livello nazionale, di un gruppo di lavoro, dotato di competenze complementari e fortemente interconnesso, che costituisca un punto di riferimento per la sintesi orientata alla diversità. Sotto tale aspetto da non trascurare sarà l'aspetto formativo. Al progetto collaboreranno infatti studenti, dottorandi, borsisti, assegnisti, etc., che potranno assimilare e ridiffondere i concetti e le tecnologie caratteristiche di questo settore di ricerca emergente.

Il raggiungimento di questi obiettivi richiede all'interno del gruppo proponente la presenza di competenze interdisciplinari e complementari relative alla sintesi delle librerie, agli studi NMR, al modelling, all'effettuazione dei test biologici. Anche per ciò che riguarda l'aspetto sintetico, che è quello preponderante, stante la necessità di poter disporre di una ampia collezione di librerie, gli obiettivi non possono essere raggiunti da un'unica unità operativa "sintetica", ma tramite la collaborazione ed integrazione di diverse competenze presenti in varie sedi universitarie. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Fino a pochi anni fa le metodologie sintetiche in chimica organica erano rivolte essenzialmente alla preparazione di sostanze singole. Tale approccio, detto TOS ("target oriented synthesis") ¹ permette di esplorare solo pochi punti isolati dello "spazio chimico". ²
L'esigenza, proveniente soprattutto dall'ambito farmaceutico, di poter disporre di un numero molto più ampio di sostanze da esaminare per saggiarne la potenziale efficacia applicativa, ha portato a modificare radicalmente l'approccio mentale verso la sintesi organica. L'enfasi si è così spostata dalla ottimizzazione (resa, selettività) della sintesi di un unico target, alla messa a punto di metodologie/strategie/tecnologie che consentano, al contrario, di ottenere in modo rapido e automatizzabile una collezione di prodotti diversi (librerie).
Questo nuovo approccio metodologico e concettuale può essere definito con il termine generale di ''sintesi orientata alla diversità'' ^1,3 o di "sintesi combinatoria", ^4,5 anche se per alcuni i due termini hanno significato leggermente differente ¹ ed il primo assume una valenza più generale.
La chimica combinatoria può essere considerata come una metodologia orientata alla diversità in cui si sfrutta la possibilità di unire, in modo per l'appunto combinatorio, degli ''elementi di diversità'' o ''input di diversità''. Essa deriva direttamente dalle metodologie altamente automatizzate per la sintesi su fase solida di biopolimeri (peptidi-oligonucleotidi) e pertanto, nella sua fase iniziale (dal 1990 in poi), è stata caratterizzata soprattutto da progressi di tipo tecnologico, che hanno permesso l'ottenimento, specialmente in fase solida, di vaste librerie di composti, sfruttando però metodologie sintetiche non particolarmente innovative. Ciò ha portato alla preparazione di librerie comprendenti milioni o addirittura miliardi di composti, ma caratterizzati da un numero di strutture base (o piattaforme molecolari o ''scaffold'') piuttosto limitato e spesso non perfettamente adatte agli obiettivi prefissi.
I parziali insuccessi di questo approccio ⁶ hanno portato negli anni successivi i chimici sintetici a puntare di più sulla qualità delle librerie che sulla quantità dei loro costituenti. ^7,8 Qualità significa librerie basate su una serie di parametri preordinati piuttosto che sulla sintesi di un vasto numero di composti senza un fine razionale. ⁹ Significa quindi progettare razionalmente degli scaffold (spesso eterociclici) in modo che siano adatti al target specifico su cui si mira ed abbiano buone caratteristiche di drug-likeness. Ma significa anche una maggiore attenzione verso le metodologie sintetiche in modo da realizzare sintesi brevi, facilmente automatizzabili e che consentano un veloce incremento della complessità molecolare. Infine significa anche essere in grado di differenziare non solo le decorazioni intorno ad un dato scaffold, ma anche lo scaffold stesso, in modo da poter attuare una sorta di "fine tuning" delle proprietà biologiche dei composti finali.
Oggi la tendenza più diffusa in questo campo è la generazione di collezioni di molecole che siano ben razionalmente progettate, pure e ben caratterizzate in quantità di almeno 20 mg per diversomero (in modo da poter sperimentare una data libreria su più target). ¹⁰ Ormai la stragrande maggioranza delle librerie preparate nell'industria sono formate da meno di 500 membri e la tendenza è verso una continua diminuzione del numero di composti. ⁴
Queste esigenze hanno messo nuovamente in primo piano la creatività e l'arte della sintesi organica, che deve ricercare nuovi processi efficienti, puliti e che portino a grandi variazioni strutturali in poco tempo. Il suo contributo può aver luogo su due livelli:
Livello a) Miglioramento delle tecnologie, cioé sviluppo di sistemi che accelerino le reazioni o ne facilitino il work-up. Questo si realizza per esempio con apparecchiature di sintesi in parallelo che permettano di ripetere contemporaneamente la stessa reazione su substrati diversi. Inoltre l'accelerazione dei tempi di una reazione, associata ad una maggiore selettività, può essere realizzata conducendo le reazioni sotto irraggiamento con le microonde. Questa tecnica è recentemente emersa come una delle più efficienti per la sintesi in parallelo di collezioni di molecole ¹¹ ed è, insieme con l'uso di reattivi o reagenti per la decontaminazione dei grezzi di reazione (scavengers) su supporto insolubile, ^12,13 uno dei mezzi più validi per la preparazione di collezioni di molecole sufficientemente pure con potenziali applicazioni in campo farmaceutico e agrochimico. Queste metodologie possono essere addirittura applicate in processi multi-stadio per preparare strutture complesse tra cui prodotti naturali. ¹⁴ L'U.R. di Siena ha acquisito un'esperienza pluriennale nella sintesi parallela di sistemi eterociclici variamente sostituiti utilizzando sia le microonde ^15-18 che i reattivi/scavenger supportati. ^19-21
Livello b) Sviluppo di nuove metodologie/strategie sintetiche orientate alla diversità. L'approccio mentale da adottare va completamente rivoluzionato rispetto a quello retro-sintetico classico. L'esigenza è in questo caso quella di partire da molecole semplici e generare la complessità strutturale nel modo più breve possibile, in modo da ottenere i prodotti finali in pochi passaggi sintetici, amplificando la diversità sia a livello di scaffold che delle sue decorazioni. Quindi è necessario adottare un approccio "avant-sintetico" che conduca dal semplice e indifferenziato al complesso e differenziato. ¹
Una metodologia utile in questo contesto è rappresentata dalle reazioni di tipo "domino" ²² in cui si riescono a formare diversi legami in un'unica sequenza (bond-forming efficiency) senza dover isolare intermedi, cambiare le condizioni di reazione o aggiungere altri reagenti. In tal modo è anche possibile limitare le quantità di reagenti e solventi rispetto alle tradizionali reazioni multistadio, con vantaggi sia dal punto di vista economico che ambientale. Tra di esse, rivestono un ruolo importante le reazioni domino anioniche, con particolare riguardo alle trasformazioni in cui almeno uno stadio è rappresentato da una reazione di Michael (reazioni Michael-Michael, Michael-aldolica e reazioni di doppia aza-Michael). ²³ Esse offrono un'ampia gamma di possibilità e permettono di ottenere non solo legami carbonio-carbonio, ma anche carbonio-eteroatomo, con accesso a sistemi monociclici o biciclici contenenti azoto e/o altri eteroatomi.
Un'altra metodologia sintetica, naturalmente orientata alla creazione di diversità molecolare, è costituita dalle reazioni multicomponente (MCR), ²⁴ che in molti casi possono essere considerate un sottogruppo delle reazioni domino. Le MCR sono per definizione dei processi in cui tre o più substrati vengono combinati a dare, in un unico stadio, prodotti che contengono parti essenziali di tutti i componenti iniziali. Proprio per la loro natura, esse sono estremamente convergenti e producono un aumento di complessità molecolare maggiore di qualunque reazione bicomponente. Quelle basate sulla peculiare reattività degli isonitrili, come le reazioni di Ugi ²⁵ e di Passerini, ²⁶ si sono rivelate tra le più utili e sono perciò state impiegate molto spesso per la sintesi di librerie, anche in contesto industriale. ²⁷ Le modificazioni di queste reazioni, in particolare la loro combinazione con trasformazioni post-condensazione, ²⁸ permettono l'accesso a nuovi scaffold eterociclici sia aromatici che parzialmente saturati.
Un ulteriore espediente che si presta molto bene all'esplorazione della "scaffold diversity" è rappresentato dalle reazioni regiocomplementari, cioé quelle in grado di generare in modo selettivo regioisomeri diversi a seconda delle condizioni. ²⁹ Infine un'ulteriore metodologia "diversity-oriented" che sta assumendo notevole rilevanza negli anni recenti è rappresentata dalla cosiddetta "click chemistry", che consente la facile unione di due frammenti anche complessi. Una reazione molto usata in questo ambito è la cicloaddizione tra azidi e alchini (reazione di Huisgen), ^30-32 che conduce alla sintesi di triazoli.
Le U.R. afferenti al progetto hanno una consolidata esperienza in queste metodologie/strategie innovative. In particolare l'U.R. di Ferrara per le reazioni domino ^33-37, L'U.R. di Genova ^38-47 e, in parte, quella del Piemonte Orientale, ^48,49 per le reazioni multicomponente con isonitrili, l'U.R. del Piemonte Orientale per le reazioni regiocomplementari e la click chemistry. ⁵⁰

Come detto più sopra, la qualità di una libreria dipende anche dall'approccio razionale nella sua progettazione. Ciò può derivare da un'analogia strutturale con "lead" già noti, supportata da metodologie "in silico" che esaminino la sovrapponibilità dello "scaffold" progettato con il composto che ha ispirato il suo design. Una seconda fase di progettazione razionale risponde invece all'esigenza di proporre una serie di "building block" per decorare gli "scaffold" selezionati, prima della generazione effettiva della libreria. In seguito all'ottenimento dei primi "hit", l'analisi puramente "in silico" deve essere affiancata da metodiche sperimentali che permettano di individuare dettagliatamente le basi molecolari delle interazioni piccola molecola-macromolecola.
L'abbinamento della spettroscopia NMR con le moderne tecniche computazionali è una delle tecniche più potenti per questo tipo di indagine. ^51,52 Due sono i parametri NMR che possono essere utilizzati per ricavare dettagliate informazioni sulla disposizione tridimensionale dei vari gruppi in molecole strutturalmente complesse: l'effetto nucleare Overhauser (NOE) e le costanti di accoppiamento. Un approccio combinato tra la spettroscopia NMR e le tecniche di chimica computazionale ^53,54 offre la possibilità di risolvere sia la configurazione che la conformazione prevalente di un dato composto. Si possono seguire due logiche: nella prima si confrontano i dati sperimentali con quelli calcolati per le varie configurazioni/conformazioni in modo da selezionare quella che permette un accordo dei due tipi di dati; nella seconda si eseguono dei calcoli introducendo dei vincoli di distanza o di angoli diedri desunti dai dati sperimentali NMR. Oltre alla delucidazione conformazionale e configurazionale dei prodotti ottenuti, recenti tecniche NMR consentono oggi di studiare dettagliatamente le basi molecolari di interazioni piccola molecola-macromolecola, focalizzando l'attenzione solo sulla molecola organica. Per di più studi di questo tipo, centrati cioè sul ligando, richiedono quantità minime di preziosi campioni biologici, come recettori, enzimi, proteine. Ad esempio, tecniche NMR quali l'STD (saturation transfer difference) o altre simili tecniche basate sulla variazione di proprietà di rilassamento longitudinale o trasversale (T1 o T2 ) causata dal "binding", consentono di effettuare "screening" di librerie di potenziali ligandi nei riguardi di un dato recettore. L'STD, in particolare, appare come una tecnica molto potente, visto che fornisce una mappa di epitopo sul ligando, consentendo quindi rapidamente ed efficacemente di identificare i determinanti molecolari del binding. ⁵⁵ L'U.R. di Salerno ha maturato notevole esperienza nel campo della spettroscopia NMR e della chimica computazionale con particolare riguardo ai settori della caratterizzazione strutturale di prodotti naturali bioattivi e del riconoscimento molecolare. ^55-58

Le librerie preparate dalle varie U.R. verranno progettate e testate come antitumorali non tradizionali, sfruttando la notevole esperienza di molti membri delle U.R. nel campo degli antitumorali. ^59-62
Questo è un settore in cui la sintesi orientata alla diversità è particolarmente utile, se si considera l'estrema varietà dei fenotipi tumorali. I farmaci antitumorali classici hanno come bersaglio tutte le cellule a rapida proliferazione, e portano quindi ad effetti collaterali marcati che limitano la dose e la frequenza della loro somministrazione. Trattamenti prolungati portano inoltre all'insorgenza della resistenza. I tumori si differenziano dalle cellule normali per una serie di "capacità acquisite" che sono essenziali per sostenere la loro replicazione illimitata e l'invasione di altri tessuti. ⁶³ I farmaci progettati mirando ai meccanismi biochimici connessi con queste capacità acquisite ("targeted antitumor drugs") sono in principio più selettivi ed in grado di contrastare più efficacemente (anche attraverso la combinazione di più principi attivi) la resistenza indotta. Per questi motivi la ricerca odierna si sta sempre di più rivolgendo verso questi farmaci "mirati", piuttosto che su molecole con semplice attività citotossica non specifica.
Tra i numerosi target innovativi, il gruppo di ricerca si concentrerà in particolare sui seguenti:
a) Le Istone Deacetilasi. L'acetilazione degli istoni è uno dei principali processi che interessano il rimodellamento della cromatina ed è governato dall'attività di due enzimi, l' Istone Acetiltranferasi (HAT) e l'Istone Deacetilasi (HDAC). ⁶⁴ Poichè l'acetilazione degli istoni è un processo chiave che promuove l'espressione genica, gli inibitori dell'istone deacetilasi sono stati studiati come potenziali agenti terapeutici per numerose patologie, ⁶⁵ ma soprattutto come antitumorali, visto che il silenziamento di geni antiapoptotici o antiproliferativi costituisce una delle capacità acquisite dei tumori. Recentemente alcuni componenti del gruppo di ricerca hanno sintetizzato un promettente lead peptidico, denominato FR 235222, dotato di attività inibitrice dell'Istone Deacetilasi. ⁵⁶ Partendo da questo lead, con l'ausilio di studi di modelling, bisognerà progettare e sintetizzare delle strutture semplificate, basate su semplici scaffold eterociclici.
b) Il canale ionico TRPV1 (recettore vanilloide o della capsaicina). ⁶⁶ Il TRPV1 è un canale ionico non selettivo il cui malfunzionamento è implicato in varie condizioni patologiche. ⁶⁷ L'emergenza di TRPV1 come bersaglio oncologico è legata a due serie di osservazioni, l'espressione od iperespressione di TRPV1 in vari tumori, e la potente azione pro-apoptotica della capsaicina. ⁶⁸ I vanilloidi sono pertanto considerati un argomento di grande rilevanza per la ricerca oncologica, ma sono necessari ulteriori studi, basati sulla sintesi di svariati analoghi, per validare il loro potenziale clinico, chiarire il loro meccanismo di azione, e migliorarne il profilo farmacocinetico. ^69,70
c) Le interazioni proteina-proteina implicate nella resistenza all'apoptosi delle cellule tumorali. I tumori hanno sviluppato dei meccanismi di difesa che consentono loro di opporsi efficacemente all'apoptosi, tramite una iperespressione di proteine antiapoptotiche che, mediante eterodimerizzazione con proteine pro-apoptotiche, disattivano queste ultime. Trovare piccole molecole in grado di interferire con questa eterodimerizzazione costituisce pertanto un promettente approccio per l'ottenimento di antitumorali mirati. ^71-73 L' U.R. di Genova ha da poco iniziato una collaborazione con un gruppo di oncologia molecolare presso l'IST di Genova, che studia da tempo queste interazioni proteina-proteina. ⁷⁴
Nello sviluppo di nuovi potenziali antitumorali si trarrà inoltre vantaggio dalla documentata esperienza di alcune U.R. nel campo dei terpenoidi, ^62,75-80 per sintetizzare coniugati tra gli agenti antitumorali e rappresentanti di queste classi di sostanze naturali. Per esempio gli acidi biliari, in una forma opportunamente modificata, continuano ad essere ampiamente proposti come shuttle per il trasporto di farmaci. ⁸¹ D'altronde le sottostrutture terpenoidi posso svolgere il ruolo delle code lipofile solitamente presenti negli inibitori delle Istone Deacetilasi. <<<