RICERCA ITALIANA     

Nuovi Strumenti Analitici per la Sicurezza e le Indagini: Determinazione di Tracce di Esplosivi e Composti Correlati.

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

L’uso di esplosivi a scopo terroristico e criminale è un problema che coinvolge apparati di sicurezza ed investigatori in tutto il mondo. Nel parlare di chimica analitica forense è opportuna una suddivisione preliminare: il contributo alle attività di sicurezza, quali la prevenzione di attacchi terroristici o lo sminamento, e quello alle attività d’indagine. La necessità di dare oggettività ai fatti ed ai reperti ha reso l’impiego di metodi scientifici sempre più importante. L’identificazione e la quantificazione delle tracce di esplosivi è inoltre diventato un argomento di grande interesse ambientale.
Nel progetto si intende mettere a punto procedure analitiche che consentano di affrontare i seguenti scenari operativi:
1. zone di un’esplosione (detriti e frammenti di vario genere);
2. mani ed altre superfici lisce (ad esempio un tavolo di lavoro o il pianale di un autocarro);
3. indumenti o altre superfici in tessuto (ad esempio le tappezzerie di un autovettura);
4. campioni di interesse ambientale (terreni, acque).
Il programma di ricerca riguarda in primo luogo lo sviluppo di nuovi metodi per la determinazione di esplosivi in situ, la validazione di tali metodi, la loro applicazione a campioni reali ed il confronto con metodi già noti e accettati. Si intende sviluppare sia saggi immunologici su micropiastra (ELISA), sia immunosaggi a flusso su striscia (LFIA) per rivelare e quantificare in modo rapido, economico e di facile uso gli esplosivi più frequentemente usati. A tal fine verranno considerati ed applicati i metodi basati sulla interazione specie-recettore, prendendo in considerazione anche recettori biomimetici sintetici, cioè i polimeri a stampo molecolare (MIP). Tali polimeri verrano utilizzati per realizzare 1) sistemi analitici in situ e 2) sistemi di campionamento. In particolare:
1.A Verrà verificata la possibilità di realizzare test analoghi a quelli ELISA. <br />1.B I polimeri MIP verranno preparati in modo da poter essere applicati a un elettrodo per realizzare sensori con trasduzione del segnale di tipo amperometrico.
1.C Combinando sensori diversi tra loro in un “sensor array” si cercherà di ottenere dei dispositivi altamente selettivi, pratici ed efficaci.
2.A I polimeri più adatti verranno utilizzati per la separazione di esplosivi da matrici reali.
2.B Si studierà una procedura di “swabbing” usando i MIP per il campionamento e preconcentrazione sulle mani di sospetti o comunque su superfici lisce.
Verranno inoltre studiate nuove metodiche elettroanalitiche, utilizzando elettrodi solidi costruiti in laboratorio, spettroscopiche e cromatografiche. Il programma vuole inoltre approfondire il problema di ottimizzare il campionamento ed i successivi trattamenti prima di effettuare analisi mediante MEKC ed HPLC/MS-MS nei quattro teatri operativi elencati.
Successivamente si intende validare le metodiche analitiche messe a punto mediante prove intra- ed inter-laboratorio, utilizzando anche tecniche analitiche radiochimiche.
Infine sarà affrontato il problema dell’utilizzazione del metodo e dell’interpretazione forense dei risultati. Verranno analizzati campioni reali e verranno sottoposti all’analisi campioni realizzati in condizioni controllate, che consentano l’ interpretazione forense vera e propria, in particolare approfondendo i problemi del trasferimento e della persistenza delle tracce. Per queste sperimentazioni ci si avvarrà della collaborazione con il RIS dell’Arma dei Carabinieri e dell’ l’Ecole de Sciences Criminelles dell’Università di Losanna (CH).
Il completamento del programma consentirà di affrontare in modo completo il problema dell’analisi di tracce di esplosivi e composti correlati a partire dal campionamento fino all'interpretazione dei risultati analitici a scopo forense. Un tale approfondimento fornirà strumenti più efficaci per la sicurezza e le indagini sul terrorismo e potrebbe rappresentare la base per una standardizzazione delle attività analitiche in materia, almeno a livello Europeo. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Roberta Curini Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Nel progetto si intende mettere a punto procedure analitiche che consentano di affrontare i seguenti scenari operativi:
1. zone di un’esplosione (detriti e frammenti di vario genere);
2. mani ed altre superfici lisce (ad esempio un tavolo di lavoro o il pianale di un autocarro);
3. indumenti o altre superfici in tessuto (ad esempio le tappezzerie di un’autovettura);
4. campioni di interesse ambientale (terreni, acque).

Tre gruppi di composti sono stati selezionati per il presente progetto di ricerca:
A) Il primo gruppo include esplosivi ad alto potenziale.
B) Il secondo gruppo include i composti presenti nelle polveri da lancio e nei residui dello sparo.
C) Il terzo gruppo include tutti composti presi in considerazione dall’EPA Method 8330 (alcuni già inclusi nel primo gruppo).
Durante lo svolgimento del progetto potranno essere aggiunti ulteriori composti di interesse di cui sarà possibile reperire gli standard.

Il programma di ricerca riguarda in primo luogo lo sviluppo di nuovi metodi per la determinazione di esplosivi in situ, la validazione di tali metodi, la loro applicazione a campioni reali ed il confronto con metodi già noti e accettati. Parallelamente verranno studiate procedure innovative per effettuare analisi di laboratorio.

Saggi ELISA e LFIA chemiluminescenti
Per rivelare e quantificare le tracce di esplosivi si intende sviluppare sia saggi immunologici su micropiastra ELISA sia immunosaggi LFIA per la determinazione rapida, economica e di facile uso di esplosivi e composti correlati. Si inizierà il lavoro con anticorpi commerciali. In seguito, in base ai risultati ottenuti con gli anticorpi commerciali, si potranno produrre nuovi anticorpi.
Polimeri a Stampo Molecolare
Verranno applicati polimeri a stampo molecolare (MIP) al fine di studiare nuovi metodi per la determinazione di esplosivi in situ. I polimeri a stampo molecolare saranno sintetizzati, saranno determinate le loro capacità adsorbenti da vari solventi e la loro selettività. La sintesi dei polimeri più promettenti sarà ottimizzata considerando i monomeri funzionali più adatti, i reticolanti più adatti e le condizioni più opportune per la polimerizzazione. A seguito della sintesi di adatti polimeri a imprinting molecolare verrà verificata la possibilità di realizzare test analoghi a quelli ELISA. Verranno inoltre elaborati test anche con MIP in forma di membrana rigida da utilizzarsi come stick a immersione riutilizzabili. I polimeri MIP verranno preparati anche sotto forma di membrane rigide, in modo da poter essere applicati ad un elettrodo a carbone vetroso per realizzare sensori con trasduzione del segnale di tipo amperometrico. Si studierà infine la combinazione di sensori diversi in un “sensor array” per realizzare un dispositivo pratico ed efficace.
Verranno infine sperimentati i MIP per il campionamento e preconcentrazione di tracce di esplosivi sulle mani di sospetti, o comunque su superfici lisce (scenario 2), basato sulla tecnica dello “swabbing” e per la separazione di esplosivi da matrici reali quali ad esempio acque naturali, estratti di terreni, materiali di contatto, eventualmente arricchiti.
Voltammetria
Verranno finalizzati gli studi attualmente in corso per lo sviluppo strumentale di un polarografo con particolare riguardo alla preparazione di elettrodi “home-made” mercury free, dedicati selettivamente a elementi di interesse forense tra i quali in particolare: Sb, Ba, Sr, Hg, Pb. L’obiettivo finale è quello di costruire un array di elettrodi sensibili ai diversi analiti che possono essere presenti nei campioni, la cui identificazione verrà poi ottenuta per mezzo di un’analisi chemiometrica dei risultati ottenuti. Si pianifica un’ulteriore sviluppo di tipo strumentale: la costruzione di una cella a flusso con rivelazione elettrochimica specificamente dedicata alla rilevazione di residui di esplosivi.
Spettrofotometria di assorbimento atomico
L’UO di Bologna ha messo a punto un sistema prototipo di ETA-AAS, nel quale l’hardware è stato modificato in modo da realizzare una atomizzazione instantanea con una resa di atomizzazione totale, rendendo possibile la quantificazione assoluta. Durante la realizzazione del progetto si intende innanzi tutto validare questo sistema allo scopo di applicarlo a saggi specifici di matrici di interesse per il presente progetto.
Spettometria NIR
Lo strumento NIR, utilizzato come pirometro, verrà utilizzato in assorbimento per la misurazione di spettri dai quali identificare per via chemiometrica i componenti di campioni complessi. Si intende poi eseguire uno sviluppo strumentale costruendo un’apposita cella NIR a flusso, già impiegata per matrici complesse con l’obiettivo di migliorare le prestazioni analitiche. In particolare, si pianifica l’applicazione di metodologie NIR in riflessione su campioni solidi ed in trasmissione su matrici solide solubilizzabili.
Elettroforesi capillare
Le metodologie elettrochimiche verranno sempre confrontate con analisi per via cromatografica HPLC-UV, secondo il metodo EPA 8330 e con analisi mediante elettroforesi capillare micellare, eventualmente con rivelatore MS, in modo da ottenere più bassi limiti di detezione.
HPLC/MS-MS
Verrà studiata una o più procedure complete che, a partire dagli scenari operativi illustrati, consentano di ottenere risultati analitici basati sulla cromatografia liquida (HPLC) accoppiata alla spettrometria di massa tandem per l’analisi di esplosivi e composti correlati. Nell’affrontare gli scenari operativi 1 e 4 verranno studiate diverse tecniche, tra cui l’estrazione con solvente di tipo tradizionale e l’ASE (Accelerated Solvent Extraction) e la SPME (Solid Phase Micro Extractrion). Per gli scenari 2 e 3 verranno studiate lo swabbing, il tape lifting ed il vacuum lifting. Qualora non fosse possibile trovare condizioni idonee alla separazione di tutti i composti di interesse e di un idoneo standard interno in un’unica corsa cromatografia, si cercherà di mettere a punto un primo metodo per gli esplosivi ad alto potenziale elencati, un secondo metodo per l’analisi dei cd. residui dello sparo organici, un terzo metodo per gli analiti del metodo EPA 8330. Una volta affrontato e risolto il problema della separazione cromatografia saranno ricercate le condizioni ottimali per l’analisi HPLC/MS-MS utilizzando il sistema API 3000 (Applied Biosystem) ed il QqTOF (Qstar-Pulsar-Applied Biosystem). Le analisi quantitative saranno realizzate considerando due transizioni in conformità con la “Decisione della Commissione del 12 agosto 2002 che attua la direttiva 96/23/CE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e all’interpretazione dei risultati”.
Validazione dei metodi sviluppati
Una parte rilevante del lavoro di ricerca sarà dedicata alla validazione ed all’accreditamento, nel rispetto, fra l’altro, delle “Validation Guidelines for Laboratories Performing Forensic Analysis of Chemical Terrorism”.
Una volta completata la messa a unto del metodo analitico a partire dai quattro scenari operativi illustrati, sarà affrontato il problema dell’utilizzazione del metodo e dell’interpretazione forense dei risultati. Verranno analizzati campioni reali e sarà effettuato lo studio di situazioni simulate, realizzate in condizioni controllate, che consentano l’interpretazione forense vera e propria, in particolare approfondendo i problemi del trasferimento e della persistenza delle tracce.
Il completamento del programma consentirà di affrontare in modo completo il problema dell’analisi di tracce di esplosivi e composti correlati a partire dal campionamento fino all’interpretazione dei risultati analitici a scopo forense. Un tale approfondimento fornirà strumenti più efficaci per la sicurezza e le indagini sul terrorismo e potrebbe rappresentare la base per una standardizzazione delle attività analitiche in materia, almeno a livello Europeo. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L’uso di esplosivi a scopo terroristico e criminale è un problema che coinvolge gli apparati di sicurezza e le forze di polizia in tutto il mondo. In Italia è ancora vivo il ricordo degli attentati di Mafia ai giudici Falcone e Borsellino (1992).
Successivamente Cosa Nostra pianificò e realizzò fra l'aprile del 1993 e l'aprile del 1994 una stagione di terrore, con attentati a Roma, Milano e Firenze. Anche una partita di calcio di serie A fu scelta per realizzare un attentato, il 31 ottobre 1993. Una Thema vicino allo stadio Olimpico, era stata lasciata imbottita di esplosivo, la domenica dell'incontro Lazio-Udinese. Qualcosa non ha funzionato nell'attivazione a distanza dell'ordigno e Cosa Nostra fu costretta a far sparire l'auto e l'esplosivo che fu poi fatto ritrovare nascosto sotto terra all'inizio del 1994 a Capena dove il pentito Antonio Scarano aveva affittato una casa.
Ancora più numerosi sono i gravissimi episodi di terrorismo internazionale verificatisi in tempi più recenti. Basti ricordare l’attentato del 2004 a Madrid e quello di Londra nel 2005. A livello internazionale nel 2005 il numero degli attentati ammonta a 11.000, di cui 3.500 solo in Europa.

L’ identificazione e la quantificazione di tracce di sostanze esplosive riveste particolare importanza sia nelle indagini di prevenzione di attentati esplosivi (es: rivelazione degli esplosivi nei bagagli dei passeggeri nei punti di imbarco aeroportuale), sia nelle indagini forensi di individuazione degli esecutori dell’atto criminale. In quest’ultimo caso, infatti, è di particolare importanza accertare sia il tipo di sostanza esplosiva utilizzata, sia rilevare la presenza di tracce di esplosivo ad esempio sulle mani e/o sugli indumenti di individui sospetti di avere partecipato al confezionamento o/e al trasporto dell’ordigno sul luogo del fatto.
L’identificazione e la quantificazione delle tracce di esplosivi è diventato un argomento di grande interesse anche ambientale, per quanto concerne la bonifica di terreni inquinati, dato che non sono da sottovalutare gli effetti tossicologici della presenza di esplosivi, che costituiscono un rischio notevole anche a livelli di concentrazione molto basse [1,2], ma anche i prodotti di degradazione. In quest’ultimo caso esiste una vera e propria sovrapposizione tra chimica analitica forense e chimica analitica dell’ambiente, come dimostrato dal metodo 8330 dell’Environmental Protection Agency (http://www.epa.gov/).
I composti esplosivi più potenti che possono essere utilizzati a scopo criminale sono denominati esplosivi ad alto potenziale. Tra i più noti annoveriamo pentaeritritolo tetranitrato (PETN), 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazocicloesano (RDX), 1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7-tetrazocicloottano (HMX), etilenglicole dinitrato (EGDN), nitroglierina (NG), 2,4,6-trinitrotoluene (TNT). Essi vengono usati da soli o mescolati tra loro in vario modo o con altri composti, che ne modificano le prestazioni [3,4].
I primi studi sull’analisi gas-cromatografica di esplosivi e composti strutturalmente correlati risalgono agli anni sessanta [5]. Esistono alcuni problemi per l'analisi dei composti esplosivi mediante GC, quali la scarsa volatilità, l’adsorbimento sulla fase stazionaria e la decomposizione degli esplosivi più termolabili. La nitroglicerina ha una temperatura di esplosione di 200 °C [3].
Un altro problema è la notevole contaminazione dei campioni, siano essi residui post-esplosione o prelievi effettuati sulle mani di soggetti sospettati di aver maneggiato esplosivi (handswabs), imponendo laboriose procedure di purificazione.
Il rivelatore a cattura di elettroni (ECD), quello a chemiluminescenza (TEA) o lo spettrometro di massa forniscono prestazioni migliori del rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) [6,7]. Comunque, la risposta dell’ECD è facilmente condizionata da contaminanti presenti negli estratti da residui post-esplosione o da handswabs, che influiscono molto sui limiti di rivelazione e sugli intervalli di linearità delle metodologie analitiche considerate. Negli anni settanta, Jenkins, Leggett, e Murrmann [8] usarono la GC-ECD per la determinazione di esplosivi nel suolo, sia per l’individuazione di siti pericolosamente inquinati, sia per la rivelazione di mine seppellite [9]. Jane et al. [10]utilizzarono la GC-ECD per la ricerca di residui dello sparo organici.
Il rivelatore a pirolisi/chemioluminescenza (TEA) si è dimostrato utile per l’analisi GC e HPLC di molecole contenenti azoto [11]. La sensibilità del GC-TEA per gli esplosivi può raggiungere valori di pochi picogrammi [12-16]. Kolla et al. hanno studiato l’utilizzo della GC-TEA nell’analisi di residui post-esplosione di dinamiti [17]. La tecnica GC-TEA è stata anche applicata all’analisi dei residui organici di arma da fuoco [18].
Gli spettri di massa ad impatto elettronico (EI) di NG, EGDN e PETN contengono ioni caratteristici a valori di m/z di 30 (NO+), 46 (NO2+), e 76 (CH2ONO2+), ma non contengono ioni pseudomolecolari. L’utilizzo della tecnica di ionizzazione chimica (CI) può fornire maggiori informazioni grazie agli ioni pseudomolecolari individuati. Sigman et al. hanno confrontato i differenti MDL della GC-MS al variare della tecnica di ionizzazione [19]. Yinon ha usato la GC-MS con un iniettore a temperatura programmabile per analizzare quantità dell’ordine dei pg di esplosivi (TNT, tetrile, RDX, HMX, PETN, DNT) in matrici acquose [20]. Halasz et al. hanno determinato la concentrazione di TNT, RDX e HMX e dei loro prodotti di “(bio)trasformazione” in campioni di acqua, terreno e tessuti vegetali [21].
L’HPLC e l’elettroforesi capillare sono di gran lunga le tecniche più adatte nell’analisi di questo tipo di composti. Promettenti risultati sono stati ottenuti mediante la Micellar Electrokinetic Capillary Electrophoresis (MEKC) [22-27] ma la rivelazione soffre di scarsa sensibilità e selettività.
Tecniche di elettroforesi capillare, come per esempio MEKC[28] e CEC [29], sono state recentemente applicate per la separazione di esplosivi, ottenendo ottimi risultati. Sono stati proposti anche metodi di separazione su microchip [30], con vantaggi in termini di miniaturizzazione del sistema.
Il metodo EPA 8330 è basato sull’utilizzo dell’HPLC con rivelatore UV, ma è necessaria una seconda analisi di conferma con una diversa colonna. Il rivelatore UV può rappresentare una scelta soddisfacente per i campioni acquosi [31] ma in caso di matrici complesse manifesta limiti significativi. Lloyd ha studiato un metodo di analisi di nitro-composti organici mediante l’uso di un rivelatore elettrochimico a goccia di mercurio [32], successivamente migliorato [33].
La combinazione HPLC/MS offre, ad oggi, prestazioni senza eguali per l’analisi di composti poco volatili e termicamente instabili. Sono state inizialmente studiate la Direct Liquid Introduction (DLI) [34, 35] e l'interfaccia termospray (TS), ottenendo limiti di rivelazione di 200 pg per il TNT, 5 ng per l’ammonio picrato [36] e 2,5 pg per la PETN [37]. Limiti di rivelazione più bassi possono essere ottenuti con interfacce elettrospray (ESI), a pressione atmosferica (API) o ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI). Casetta e Garofolo hanno studiato HMX, EGDN, RDX, NG, TNT, tetrile, DNT, PETN, etc. mediante LC-MS e LC-MS/MS [38]. Garofolo et al. hanno messo a punto un metodo per la rivelazione quantitativa di composti esplosivi termostabili [39]. Studi sui processi di frammentazione mediante ESI sono stati effettuati da Yinon e McClellan in ioni negativi [40]. Recenti miglioramenti nei metodi di interfacciamento LC-MS hanno incrementato notevolmente la sensibilità e la selettività nell’analisi di costituenti polari e termolabili in fase acquosa [41]. TNT, NG, PETN ed RDX risultano essere più efficientemente ionizzati in APCI in presenza di cloro [42]. La tecnica LC-MS, con ionizzazione ESI e APCI in negativo, è stata studiata per l’analisi di tre esplosivi del tipo esteri-nitrato ampiamente utilizzati (NG, PETN, EGDN), usando additivi post-colonna [43]. Gapeev et al. hanno confrontato le sorgenti ESI ed APCI nell’analisi di RDX [44].
Infine è opportuno ricordare l’ambito dei residui dello sparo organici, cioè le tracce di nitroglicerina e di additivi per le polveri da lancio. Tali accertamenti sono realizzati solo in un numero limitato di laboratori [45-47]. In tale ambito Romolo ha studiato l’applicazione dell’HPLC/MS-MS alla determinazione dei residui dello sparo organici, a partire da campioni prelevati dalle mani e dagli indumenti di soggetti che hanno sparato [48,49].
In campo spettroscopico poi, è stato approfondito lo studio circa la possibilità di effettuare, con buona accuratezza, determinazioni di metalli mediante la spettroscopia di assorbimento atomico con atomizzazione elettrotermica (AAS-ETA) impiegando il metodo dell'analisi assoluta, procedura questa che può essere definita come un metodo attraverso il quale un segnale strumentale può essere correlato alla concentrazione di analita attraverso un'equazione esatta, consentendo quindi di calcolare la concentrazione stessa di analita da una singola misura senza necessità di standard di matrice identica a quella da analizzare [50-55].
Diversi metalli già largamente studiati sono protagonisti di reperti balistici [56, 57] nonché di polveri e altri componenti utilizzabili come esplosivi o provenienti da essi [58-60].
I metodi, bio e chemiluminescenti, che sono stati sviluppati comprendono sia saggi in soluzione che a flusso, saggi immunoenzimatici (ELISA) e saggi biotossicologici in campo clinico, alimentare e ambientale [61-65].
Esiste un’ampia letteratura che documenta l’importanza della rivelazione chemiluminescente in chimica analitica, spaziando in numerosi campi dalla chimica degli alimenti alla biomedicina [66-68]. Per quel che riguarda lo specifico argomento di questo progetto la chemiluminescenza è impiegata per la rivelazione di tracce di esplosivi in combinazione con tecniche cromatografiche di separazione[69-71].
Gli immunosensori si stanno rivelando uno strumento affidabile ed economico per l’analisi di un largo numero di composti. Gli immunosaggi chemiluminescenti hanno il vantaggio di essere altamente selettivi grazie all’impiego di anticorpi monoclonali e permettono di raggiungere limiti di rivelazione degli analiti migliori delle tecniche colorimetriche [69].
Fra i test immunochimici gli approcci più promettenti per lo sviluppo di sistemi rapidi di analisi da impiegare fuori dai laboratori riguardano saggi immunoenzimatici su strisce di membrane o a flusso.
Lo sviluppo e la combinazione di anticorpi specifici, di particelle colloidali (carbone, silice, oro, latex ecc..) come marcatori e di sistemi a membrana a flusso laterale ha permesso di creare gli Immunosaggi a Flusso Laterale (Lateral Flow Immunoasssay, LFIA) [72]. I saggi LFIA sono progettati per essere robusti, facili da usare e portatili, adatti alla determinazione semi-quantitativa degli analiti. Richiedono una strumentazione molto economica e offrono una riduzione sostanziale del tempo richiesto per la misura, se confrontati con i saggi immunoenzimatici su micropiastre. Le particelle colloidali, che sono direttamente o indirettamente coniugate all’anticorpo specifico per l’analita, servono come rivelatore dell’immunosaggio, mentre la membrana serve come base per la separazione e la concentrazione del complesso antigene-anticorpo [73].
La necessità di determinazioni in situ è stata affrontata con lo sviluppo di sensori immunochimici quali quelli proposti per esempio da Narang [74, 75], e da sensori elettrochimici come quelli proposti da Wang [76]. Questi, per quanto riguarda la determinazione di TNT, sono praticamente liberi da interferenze come benzidina, fenolo, idrazina, e metallo-ioni, mentre RDX, e numerosi nitroderivati alla concentrazione di 10 mg/l davano una diminuzione del segnale di qualche percentuale 5 mg/l di TNT. Alti livelli dei comuni tensioattivi Triton X-100, sodio dodecilsolfato, gelatina e acido umico davano diminuzioni di 4, 25, 9 and 28% rispettivamente. Campioni contenenti alte concentrazioni di materiale umico richiedevano l’uso di un sensore più complicato, corredato di possibilità di microdialisi.
D’altra parte anche gli immunosensori presentano delle interferenze, per esempio, nel caso dell’immunosensore a TNT, da parte di composti nitroaromatici, dovute alla reattività incrociata dell’anticorpo [77].
I metodi immunochimici sono basati sull’interazione tra la specie considerata e il corrispondente anticorpo specifico. Tra i diversi metodi immunochimici i più promettenti per uso rapido in situ sono quelli basati su dipstick e i formati flow-through [78].
Molto interessante è quello per competizione riportato da Bart e coll.[79] e Goldman e coll.[80].
Un problema quando si utilizzano metodologie di questo tipo può essere costituito dal fatto che gli anticorpi sono molecole biologiche. Si potrebbe avere un notevole miglioramento sostituendo il recettore biologico con recettori di sintesi biomimetici. I polimeri a imprinting molecolare (MIP) sono sostanze di questo tipo, contenenti siti di interazione molecolare specifica per la specie considerata. I vantaggi dei recettori sintetici rispetto a quelli biologici sono:
- resistenza in mezzi acidi, basici, organici e a temperature elevate
- costi più bassi rispetto ai recettori biologici
- preparazione semplice
I MIP possono essere sintetizzati per molti tipi di composti, e la loro selettività, come anche l’intensità della interazione con la molecola stampo possono essere modulati variando la composizione della miscela di polimerizzazione e le modalità di preparazione del polimero [81].
In linea di principio i MIP possono essere utilizzati analogamente agli anticorpi, tanto per operazioni di separazione della specie considerata da matrici complesse, quanto per metodologie analitiche tipo ELISA o simili, e per lo sviluppo di sensori.
Sono state sviluppate ed applicate tecniche analitiche basate sull’uso di MIP tanto per procedimenti di estrazione in fase solida (SPE) finalizzati alla preconcentrazione e al clean-up [82], quanto per la costruzione di sensori potenziometrici [83] e amperometrici [84] basati su membrane MIP. Sono stati considerati quali molecole stampo alcuni composti triazinici, per i quali sono stati sintetizzati polimeri a imprinting molecolare in forma di particelle adatte per operazioni di adsorbimento in batch e in colonna, e membrane rigide, applicabili in stretta connessione a elettrodi di carbone vetroso. E’ stato sviluppato un sensore potenziometrico per atrazina, e un sensore amperometrico per atrazina e acido cianurico. Sono stati ottenuti limiti di detezione dell’ordine di 100 nM, in tempi molto brevi, dell’ordine di qualche secondo. Tale metodologia di trasduzione del segnale sembra quindi particolarmente adatta per applicazioni in tempo reale e sul campo.
Uno schema di saggio simile a quello sopra riportato utilizzando anticorpi quali recettori [79] può essere facilmente adattato a tests in cui i recettori siano costituiti da siti molecolari “Imprinted”. Ad esemppio i MIP possono essere ottenuti in forma di particelle con cui si possono riempire colonne per tests competitivi flow-through. Si può anche pensare di realizzare formati tipo ELISA diretto per competizione basati su MIP quali recettori. In questo caso si deve utilizzare una molecola stampo opportunamente marcata quale competitore della molecola non marcata per i siti di interazione del MIP. Il MIP specifico in forma di membrana rigida potrebbe essere utilizzato anche come dipstick.
In effetti il gruppo di Pavia ha sviluppato un polimero MIP per atrazina che è stato applicato per un metodo ELISA, tramite il quale si è ottenuto un limite di detezione circa 10 nM, e una ottima selettività nei confronti di molecole triaziniche analoghe. Metodi simili possono essere evidentemente sviluppati per altri analiti. <<<