RICERCA ITALIANA     

Ruolo dell'interazione dei metalli con il sistema Ubiquitina/Proteasoma nella patogenesi delle malattie conformazionali

Università degli Studi di Catania

Abstract

E’ ormai accertato che diverse malattie neurodegenerative ad elevato impatto sociale quali il morbo di Alzheimer, di Parkinson e le malattie Prioniche, sono causate dal medesimo meccanismo patogenico. Per ognuna di queste patologie è infatti riscontrabile nei tessuti un accumulo anomalo di depositi proteici insolubili chiamati “amiloidi”. Nonostante gli intensi sforzi che la comunità scientifica ha negli ultimi anni dedicato alla comprensione dei fattori che, a livello molecolare, possono dar luogo alle diverse malattie, esistono tuttora molti punti da chiarire prima di proporre un’ efficace terapia. Tuttavia, è dimostrato il ruolo determinante che possono avere alcuni fattori legati all’invecchiamento, quali in particolare lo stress ossidativo esercitato dai radicali dell’Ossigeno (ROS) e la disomeostasi cellulare dei metalli nel promuovere l’amiloidogenesi. Inoltre un crescente numero di osservazioni sperimentali suggerisce che in tutte queste patologie il normale ciclo di ricambio delle proteine risulta inibito all’interno della cellula. Negli eucarioti, la eliminazione fisiologica delle proteine all’interno della cellula è garantita dal sistema Ubiquitina-Proteasoma (UPS), una complessa rete di reazioni enzimatiche che, utilizzando l’Ubiquitina come segnale di riconoscimento delle proteine da eliminare ed il Proteasoma come macchinario proteolitico, le degrada in frammenti a più basso peso molecolare. Alcuni recenti lavori hanno inoltre dimostrato che metalli bivalenti (Cu, Fe e Zn), tra cui alcuni red-ox attivi, possono anche agire da inibitori dell’UPS, dando quindi corpo alla suggestiva ipotesi di un meccanismo molecolare comune che lega la disomeostasi dei metalli, lo stress ossidativo, l’aggregazione delle proteine, l’inibizione dell’UPS e la neurodegenerazione.
Sebbene vari aspetti di questo complesso quadro siano già noti, alcuni altri, non meno importanti, risultano finora inesplorati. In particolare, uno studio sistematico della interazione dei metalli con le varie componenti del sistema UPS non è ancora stato intrapreso.
Il presente progetto di ricerca si propone di contribuire a colmare questa lacuna tramite un approccio multidisciplinare che sfrutta ed integra tra loro le competenze specifiche delle quattro unità di ricerca. Coniugando la caratterizzazione chimica dei complessi che si originano dalla interazione dei metalli con i componenti del sistema UPS con una analisi biologica in modelli cellulari ed animali, ci si attende di comprendere e razionalizzare molti degli aspetti non ancora noti fornendo così una solida piattaforma per una successiva progettazione di adeguate strategie terapeutiche.
In particolare verranno determinati, mediante indagini NMR, CD, ESI-MS, ESR, DSC e potenziometria, i parametri chimici e chimico-fisici che caratterizzano l’interazione dei vari cationi con l’Ubiquitina e suoi eventuali partners. Sarà così possibile proporre un modello utile alla creazione tramite virtual screening di una libreria di possibili molecole antagoniste capaci di ripristinare l’attività dell’UPS, compromessa dall’azione dei metalli.
Studi su colture cellulari modello saranno condotti al fine di individuare e caratterizzare gli specifici steps del processo proteolitico inibiti dai differenti metalli. Le analisi su cellule saranno completate da indagini in vivo, condotte su ratti transgenici, nonché su tessuti umani autoptici attraverso tecniche di imaging. Questo processo di “scale-up” -dalla molecola all’organismo vivente- fornirà non solo un esauriente quadro di informazioni utile alla piena comprensione di tutti i fenomeni coinvolti nel processo patogenico, ma al contempo anche un valido protocollo per testare il potenziale terapeutico delle molecole antagoniste che verranno sintetizzate sulla base dei risultati conseguiti. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Enrico Rizzarelli Università degli Studi di CATANIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il sistema Ubiquitina/Proteasoma è un efficiente meccanismo regolatore della vita cellulare. Esso controlla la divisione delle cellule, la traduzione dei segnali, lo sviluppo e la risposta immunitaria. E’ anche coinvolto nella patogenesi di molte malattie neurodegenerative considerato che gli aggregati proteici che caratterizzano la neurodegenerazione inglobano l’Ubiquitina. A dispetto degli intensi sforzi finalizzati alla comprensione del ruolo giocato dall’UPS in tutti questi processi cellulari, non è ancora stato chiarito il meccanismo di controllo delle proteine nel cervello. Di conseguenza, un obiettivo a lungo termine della ricerca consiste nel comprendere i meccanismi che sovrintendono allo smaltimento delle proteine nel cervello e le loro implicazioni nello sviluppo della neurodegenerazione e nel controllo dei cicli cellulari. E’ altresì noto che l’aumento di concentrazione di metalli nel cervello ad opera dell’invecchiamento può contribuire ad “ipermetallare” molte proteine, innescando così misfolding e precipitazione. Comunque, il ruolo giocato dai metalli nel generare un malfunzionamento dell’UPS non è chiarito. Il presente progetto di ricerca è finalizzato ad investigare l’interazione dei metalli con l’UPS ed eventualmente a capire in che modo essi possono interferire con il suo normale funzionamento. La comprensione dei meccanismi molecolari che controllano il turnover delle proteine non soltanto incrementerà la nostra conoscenza riguardo questi sistemi critici, ma fornirà anche modelli utili per la progettazione di strategie terapeutiche originali per la cura di queste malattie.
Gli obiettivi specifici del progetto sono:

i) Determinare il sito di legame, i parametri di coordinazione e l’affinità degli ioni metallici con l’Ubiquitina per fornire un modello molecolare realistico per una migliore comprensione del possibile ruolo giocato dagli ioni metallici nel legarsi a differenti regioni della proteina.
iii) Evidenziare il malfunzionamento causato dai differenti ioni metallici sulle attività proteolitiche del proteasoma.
iv) Distinguere tra processi ossidativi catalizzati dai metalli e diversi meccanismi di inibizione della proteolisi capaci di causare un sovraccarico di proteine differenti.
v) Fornire sulla base degli studi molecolari una solida piattaforma da utilizzare per gli studi di progettazione in silico di farmaci specifici capaci di interferire con l’inibizione dell’UPS indotta dai metalli.
vi) Saggiare l’attività delle nuove molecole sintetizzate in sistemi modello cell-free, in colture neuronali ed in vivo, allo scopo di individuare le molecole con il più promettente potenziale terapeutico per il successivo avvio ad indagini pre-cliniche e cliniche. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Si pensa che diverse malattie, chiamate malattie conformazionali [1] comprese le principali forme di demenza e le encefalopatie, abbiano un comune meccanismo di patogenesi. In ognuna di esse si osserva un anormale accumulo di aggregati insolubili, che, in genere, consiste di fibre contenenti una proteina non correttamente avvolta in conformazione beta-sheet, chiamate amiloidi. L’accumulo graduale di questi aggregati e la accelerazione della loro formazione per effetto di fattori di stress ambientali spiega come mai l’insorgere di tali malattie avvenga in tarda età e la loro natura sia soprattutto sporadica. La comprensione a livello molecolare di tali processi sta aprendo nuove prospettive per approcci più razionali nella ricerca e nella terapia [1]. Esiste una parziale, ma non assoluta sovrapposizione, tra le cellule nelle quali le proteine non foldate si depositano e quelle che risultano danneggiate. La spiegazione più plausibile è che le inclusioni e gli altri aggregati di proteine, rappresentino solo lo stadio finale di una serie di eventi molecolari a cascata, e che siano i primi stadi ad essere direttamente collegati con il processo patologico piuttosto che gli aggregati stessi [2]. Non vi è nessuna omologia nella sequenza o struttura tra le proteine coinvolte nelle malattie conformazionali. Comunque sempre maggiori evidenze sperimentali indicano come aggregati formati dalle diverse proteine, presentino una struttura analoga. Il loro studio è reso difficile dalla loro insolubilità e natura non cristallina. Studi condotti mediante diffrazione a raggi-X e risonanza magnetica nucleare allo stato solido, hanno comunque confermato che gli aggregati di proteine coinvolte in malattie neurodegenerative sono ricche di strutture "beta-sheet". Questi studi hanno portato alla creazione di un modello molecolare delle fibrille di tipo amiloide composte da diversi protofilamenti, che consistono di strutture "beta-sheet" legate tramite legami ad idrogeno con i "beta-strands" disposti perpendicolarmente agli assi delle fibrille, una struttura nota come conformazione cross-beta. E’ chiaro da questi studi strutturali che la catena polipeptidica va incontro ad un vasto riarrangiamento conformazionale durante il processo di misfolding e di aggregazione. Comunque non è ancora noto se sia il misfolding ad attivare l’aggregazione proteica o piuttosto l’oligomerizzazione delle proteine ad indurre le variazioni conformazionali. Sulla base delle evidenze sperimentali disponibili, sembra che anche minime variazioni conformazionali portino alla formazione di intermedi non foldati, i quali risulterebbero instabili a causa della esposizione al solvente delle componenti idrofobiche. Questi intermedi instabili interagirebbero con altre molecole formando dei piccoli oligomeri che crescendo ulteriormente porterebbero alla formazione delle fibrille di tipo amiloide. In accordo con tale modello, la conversione di proteine correttamente foldate nelle forme patologiche viene attivata da variazioni di tipo strutturale, ma il completo misfolding dipende dal processo di oligomerizzazione. Diversi fattori ambientali potrebbero catalizzare il processo di misfloding proteico, compreso variazioni nella concentrazione di ioni metallici, proteine patologiche chaperon, pH o stress ossidativi, aggregati macromolecolari ed aumento nella concentrazione di proteine misfolded. Parecchie di queste alterazioni sono associate con l’invecchiamento e questo sarebbe in accordo con la comparsa in tarda età di tali malattie neurodegenerative [3]. Un numero crescente di osservazioni suggerisce che i metalli di transizione, bi- o tri-valenti, siano in grado di accelerare il processo di aggregazione di diverse proteine patologiche, es. alfa-sinucleina (alfa-sin), il peptide beta-amiloide (Abeta), la beta2-microglobulina (beta2m) e frammenti della proteina prione (PrP) [4-9]. In particolare due generiche reazioni devono essere considerate con attenzione in relazione a queste malattie: i) una associazione metallo-proteina che porta alla aggregazione proteica; questo processo può coinvolgere metalli ionici redox-inerti come Al, Zn, oppure redox-attivi come Cu, Fe e Mn [6-9]: ii) ossidazioni di proteine catalizzate da metalli che portano al danneggiamento ed alla denaturazione della proteina; questo processo coinvolge metalli redox-attivi [8,10,11]. Un numero crescente di risultati indica che l’impossibilità ad eliminare le proteine misfolded può portare alla formazione di aggregati potenzialmente tossici, alla attivazione di proteine funzionali ed infine alla morte cellulare. Il numero di malattie legate ad una aberrante conformazione sottolinea l’importanza dell’effettivo controllo qualitativo del folding proteico per la sopravvivenza della cellula [12]. Nelle cellule eucariote il sistema ubiquitina-proteosoma (UPS) rappresenta il principale meccanismo per l’eliminazione di proteine misfolded [13-14] e per questa loro fondamentale scoperta, Ciechanover, Hershko e Rose sono stati insigniti del premio Nobel nel 2004.
Il bloccare, per via farmacologica o genetica, tale sistema impedisce l’eliminazione delle proteine misfolded e questo può portare all’eventuale formazione di aggregati intracellulari. Per la degradazione mediata dal sistema UPS, le proteine vengono marcate dal legame covalente di catene di poliubiquitina, che vengono riconosciute dal proteosoma 26S. Solamente i substrati indirizzati al proteosoma dalla ubiquitinazione sono in grado di raggiungere il suo nucleo proteolitico. La ubiquitinazione è un processo caratterizzato da differenti stadi che coinvolgono un enzima E1 ubiquitina-attivante, enzimi E2 ubiquitina-coniuganti, ed enzimi E3 ubiquitina-ligasi che selettivamente selezionano il substrato e facilitano l’ubiquitinazione. La poliubiquitinazione di alcune proteine richiede anche degli enzimi chiamati E4 che cooperano con le ligasi E3 per estendere la catena poliubiquitinica [15]. Molte malattie basate sull'aggregazione riflettono un difetto del controllo da parte del sistema UPS, sia nel controllo che nella eliminazione, il che porta ad uno squilibrio tra la sintesi, il folding e la degradazione. La relazione tra il sistema ubiquitina-proteosoma e la neurodegenerazione è stata confermata dall’osservazione che l’ubiquitina è presente nei corpi di inclusione ed altri aggregati di proteine trovati nelle cellule malate [16]. Oltre alla funzione di controllo, il processo ubiquitina-proteosoma regola diversi processi cellulari attraverso la degradazione di specifiche proteine; l’ubiquitina stessa, oltre al turnover, può essere coinvolta nella funzionalità delle proteine [17]. In effetti il sistema ubiquitina-proteosoma è stato implicato in un sempre crescente numero di malattie umane e rappresenta un promettente bersaglio farmacologico in certi tipi di cancro [18,19]. Un importante aspetto nel comprendere l’attività del UPS è relativo al come venga raggiunto un così ampio intervallo di funzioni. Le catene di poliubiquitina (poliUb)- polimeri formati attraverso la coniugazione Ub-Ub all’interno della cellula- possono essere legate alle proteine bersaglio grazie alla presenza di sette residui di lisina nell’Ubiquitina. L’esistenza di catene di poliUb strutturalmente differenti potrebbero spiegare i diversi processi nella trasduzione del segnale dipendenti dall’ubiquitina [20]. Poichè la funzionalità della poliubiquitinazione risulta essere struttura specifica, può essere importante determinare quali residui e quali aspetti strutturali siano coinvolti nella formazione delle catene. Alcuni aspetti interessanti per la funzionalità estrapolati dalla struttura 3D comprendono una parte idrofobica sulla superficie formata dai residui L8, V70 e I44, ed una componente flessibile nel dominio C-terminale che finisce con il residuo G76. Una combinazione dell’effetto idrofobico e del potenziale elettrostatico determinato dalle cariche positive (sui residui K6, R42, K48, H68 e R72, situati in prossimità della regione idrofobica) risulta determinante per le varie interazioni dell’ubiquitina. Questo potrebbe portare ad una auto-interazione tra le varie unità nella singola catena polipeptidica, e la regione idrofobica L8–V70–I44 potrebbe effettivamente mediare le interazioni fra le catene di distinte unità di Ub, determinando la conformazione di alcune catene poliUb. La possibilità che avvengano interazioni idrofobiche tra diverse unità di Ub dipende dal posizionamento del legame tra la lisina e la regione idrofobica. Le differenze osservate in tale legame nelle conformazioni della poliUb potrebbero risultare importanti da un punto di vista funzionale, poiché porterebbero ad una diversa esposizione sulla superficie dei residui idrofobici, implicati negli eventi di trasduzione del segnale dipendenti dall’Ubiquitina. Ad esempio, oggi è noto che le catene legate tramite K63 sono coinvolte nel segnale in quattro processi: tolleranza verso il danneggiamento del DNA [21]; la risposta a processi infiammatori [22]; il trasporto di proteine [23]; e la sintesi di proteine a livello del ribosoma [24]. Oltre ad enzimi di attivazione, fattori ambientali quali variazioni di pH, forza ionica, metalli e molecole chaperon, possono svolgere un ruolo importante nel controllare il processo UPS [20]. Queste evidenze sperimentali, insieme con le indicazioni che il mal funzionamento del sistema ubiquitina-proteosoma è coinvolto in molte patologie neurodegenerative, ha spinto diversi ricercatori ad esaminare approfonditamente i fattori che contribuiscono alla disfunzione del processo proteolitico. E' ben noto che la concentrazione di ioni metallici, in particolare Cu e Zn, aumenta con il procedere dell’età. Questo potrebbe contribuire alla ipermetallazione di molte proteine, innescando quindi stress ossidativo, processo di misfolding e precipitazione [8]. L’accumulo di proteine ubiquitinate in seguito a processi ossidativi, osservato nelle cellule neuronali di topo, dimostra ulteriormente che il sistema UPS è strettamente correlato con la risposta cellulare allo stress ossidativo indotto dai metalli [25]. Inoltre, studi recenti condotti sugli effetti dello stress ossidativo indotto da ioni metallici neurotossici sulle proprietà del proteosoma 20S, hanno dimostrato che la sua esposizione a concentrazioni sempre più elevate di Fe(III), Fe(II), Cu(II) o Zn(II), porta ad una diminuzione, in vario modo e grado, delle sue varie attività proteolitiche (tipo tripsina, chimotripsina, peptidilglutammil-peptide idrolasi e caseinolitica). Gli effetti a livello funzionale sembrano essere legati alle modifiche indotte dall' ossidazione, come dimostrato dall’aumento dei gruppi carbonile in seguito al trattamento con tali metalli [26]. Questi risultati giustificano la proposta di utilizzo di molecole che siano in grado di chelare metalli ed interagire con il processo UPS. In particolare è stato evidenziato che il trattamento con pirrolidina ditiocarbammato (PDTC), uno ionofero dello zinco, porta all’accumulo di diversi substrati del proteosoma. L’effetto del PDTC è dovuto alla estensione del tempo di semi-vita di queste proteine a causa della mobilizzazione dello zinco. Il PDTC e/o lo zinco aumentano anche l’intensità di fluorescenza della proteina di fusione UbG76V-GFP, che è degradata rapidamente dal sistema UPS. Il trattamento di cellule con zinco induce la formazione di complessi di inclusione ubiquitinati nel centrosoma, un marker istologico dell’inibizione del proteosoma. Analisi Western-blot hanno evidenziato l’aumento, indotto dallo zinco, di bande relative a proteine coniugate con poliubiquitina. In studi condotti in vitro, lo zinco era in grado di inibire la degradazione proteosomale ubiquitina dipendente dell’ alfa-sinucleina [27]. Successivamente è stato riportato che complessi del rame possono selettivamente ed efficaciamente inibire l’attività chimotripsinica del proteosoma, sia in vitro che in vivo. In particolare, il complesso rame(II) bis-8-idrossichinolone[Cu(8-OHQ)2], era in grado di inibire tale attività nel proteosoma purificato 20S. Inoltre è stato dimostrato che la inibizione del proteosoma 20S indotta dal rame, non può essere bloccata da agenti riducenti e che i complessi del rame con molecole organiche non producono acqua ossigenata all’interno delle cellule. Questo suggerisce che l’inibizione del proteosoma e l’induzione dell’apoptosi non sono legate al danno ossidativo delle proteine, generato dalla presenza di ioni rameici. Da questi risultati inoltre si evince che alcuni leganti organici in presenza di rame, sono in grado di agire come potenti inibitori del proteosoma ma con meccanismi diversi dalla ossidazione [28]. Inoltre è stato recentemente riportato che il cliochinolo (CQ), un composto simile alla 8-idrossichinolina ed utilizzato come farmaco per il morbo di Alzheimer, e la PDTC, in grado anche di legare il rame oltre a possedere attività antiossidante, possono interagire con il rame per formare specifici inibitori del proteosoma coinvolto nel cancro e induttori di apoptosi in cellule tumorali [29]. E’ stato anche dimostrato che l’espressione di una forma mutante dell’ubiquitina ricca di cariche negative (K48R) nelle cellule NT-2 e SK-N-MC porta ad una diminuzione della loro velocità di crescita, aumenta il danno ossidativo (presenza di gruppi carbonili nelle proteine e per ossidazione lipidica), la produzione di ossido di azoto ed elevata nitrosazione delle proteine [30]. Nei neuroni dopamminergici della sostanza nigra e nei neuroni norepinefrinici del locus coeruleus, la neuromelanina svolge un ruolo importante per l'omeostasi dei metalli ed in particolare del ferro che lega in elevate quantità [31-32]. Questi neuroni contenenti neuromelanina subiscono una degenerazione selettiva nel morbo di Parkinson, mentre altri neuroni vengono risparmiati [33]. Nella sostanza nigra è stato osservato un aumento della quantità totale di ferro sia durante l’invecchiamento che nei pazienti affetti da morbo di Parkinson [31-34]. In particolare durante l’invecchiamento viene riscontrata nei neuroni dopamminergici della sostanza nigra, un accumulo specifico del complesso neuromelanina-ferro [35]. La neuromelanina può ridurre l’attività del proteosoma 26S, come dimostrato in situ utilizzando una proteina fluorescente omologa indirizzata al proteosoma 26S, ed anche in vitro utilizzando un lisozima ubiquitinato come substrato. La neuromelanina riduce la quantità di subunità regolatrice PA700 del proteosoma 26S, ma non influenza le subunità a- e b- del proteosoma 20S. Comunque non è ancora chiaro quale componente della neuromelanina, struttura di tipo chinone, lipide, peptide o metalli, sia realmente citotossica ed inibisca l’attività del proteosoma [36]. In conclusione, sebbene vi siano diverse tracce che il processo ubiquitina-proteosoma sia cruciale per la patogenesi di malattie neurodegenerative [37], la individuazione di meccanismi specifici e l’eventuale conferma di tali dati in vivo, risulta essere ancora oggi un obiettivo da raggiungere. Questo avviene in parte perché ancora non è noto in maniera chiara a livello molecolare, come le proteine misfolded vengano ad essere ubiquitinate e degradate. Comunque è necessario anche definire quali altri fattori possano interferire con la cascata di eventi molecolari coinvolti nel processo ubiquitina-proteosoma. Riteniamo che la completa comprensione di tali meccanismi risulterà importante per lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici. L’ ipotesi relativa all’inibizione del proteosoma mediata dai metalli è stimolante perchè potrebbe costituire un meccanismo comune alle diverse patologie che coinvolgono il misfolding proteico. <<<