RICERCA ITALIANA     

Integrazione di metodologie innovative di separazione e di spettrometria di massa per una proteomica di nuova generazione

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

La sfida che la proteomica, la nuova frontiera della ricerca biologica e medica, pone alla comunità scientifica è fondata essenzialmente sulle metodologie proprie della “chimica analitica”. Lo studio del proteoma, infatti, si basa sulla separazione e sulla successiva analisi qualitativa (identificazione) e quantitativa di popolazioni di analiti di natura proteica, ponendo al centro la metodologia di più rilevante impatto sulla moderna chimica analitica: la spettrometria di massa. E’ ben noto che la proteomica, nata da poco più di un decennio, si è essenzialmente basata su tecniche di separazione e su metodologie spettrometriche di massa in gran parte mature. Nonostante gli sviluppi tecnologici e metodologici nel decennio trascorso, la proteomica è ancora lontana dall’aver raggiunto quel livello di elevata produttività che la ricerca biologica e medica, in conseguenza della sempre maggiore utilizzazione delle conoscenze genomiche, ormai richiede. Gli aspetti di maggiore criticità riguardano la preparazione del campione, le tecnologie separative, le metodologie quantitative, lo sfruttamento a pieno delle nuove generazioni di spettrometri di massa. Questo progetto vuole rispondere a queste sfide cogliendo l’essenza chimico-analitica delle problematiche proteomiche mediante l’integrazione sinergica di metodologie innovative di separazione e di spettrometria di massa con l’obiettivo di porre le basi di una proteomica di nuova generazione. Il ruolo delle cinque Unità Operative (UO) coinvolte in questo progetto nazionale è rappresentato da un “continuo” di competenze e di eccellenze che si estendono dallo screening degli analiti in complessi campioni biologici con la tecnica dei microarrays proteici, al frazionamento cellulare, subcellulare e di complessi proteici mediante tecniche di frazionamento in campo-flusso, allo sviluppo di nuovi metodi separativi di proteine e peptidi mediante tecniche cromatografiche miniaturizzate ad elevatissima efficienza, all’ideazione ed alla sintesi di nuovi tag per l’analisi selettiva e quantitativa di popolazioni proteiche. Queste competenze sono sottese da una formidabile rete di strumentazioni spettrometriche di massa che comprendono spettrometri dell’ultima generazione come MALDI-TOF/TOF, QqTOF, spettrometri con analizzatori a trappole lineari, spettrometri con sorgente a plasma ad accoppiamento induttivo (ICP-MS). Infine il progetto si propone di affrontare, mediante l’integrazione delle suddette metodologie e l’utilizzazione estensiva della strumentazione di massa, alcune problematiche di proteomica di estrema rilevanza e complessità quali: i) il profilo delle proteine del siero umano; ii) la caratterizzazione di marcatori proteici virus-specifici; iii) la rivelazione di allergeni in alimenti; iv) il profilo delle proteine sarcomeriche dei miocardiociti e dei miociti scheletrici.
La rilevanza e l’originalità della ricerca è basata sulla focalizzazione del problema in termini chimico-analitici con l’obiettivo di proporre percorsi metodologici integrati e coerenti intesi a superare le attuali criticità nello studio “reale” del proteoma. La qualità scientifica del coordinatore nazionale e dei coordinatori locali è dimostrata da una consistente, documentata ed apprezzata produzione nei campi delle metodologie analitiche separative avanzate e della spettrometria di massa. Il coordinatore nazionale è, in particolare, considerato tra i fondatori della spettrometria di massa biomolecolare in Italia ed è alla guida di uno dei centri di ricerca italiani di proteomica più qualificati. Il grado di realizzabilità del progetto è assicurato dalla rete scientifica e strumentale che si è coagulata con l’obiettivo di integrare e complementare le competenze di ciascuna UO per poi affrontare e risolvere problematiche “reali” di proteomica. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Gennaro Marino Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il principale obiettivo del presente programma di ricerca è la creazione di una rete di competenze di carattere “chimico-analitico” per definire e proporre percorsi metodologici integrati intesi a superare le attuali criticità nello studio “reale” del proteoma. A questo fine il programma si avvale delle attività di ricerca di cinque Unità Operative (UO) che rappresentano un “continuo” di competenze e di eccellenze, sottese da una formidabile rete di strumentazioni spettrometriche di massa. L’ obiettivo generale verrà raggiunto attraverso il coordinamento nazionale sia inteso all’integrazione delle metodologie che le singole UO svilupperanno, sia inteso alla soluzione dei problemi applicativi proposti da alcune UO.
Gli obiettivi metodologici riguardano lo sviluppo e la messa a punto di: 1) metodi innovativi di separazione e di screening; 2) metodi innovativi per la identificazione e la quantificazione delle proteine mediante spettrometria di massa.
In particolare per quanto concerne lo sviluppo e la messa a punto di metodi innovativi di separazione e di screening gli obiettivi riguarderanno:
1.a – Sviluppo di sistemi innovativi di frazionamento in campo-flusso a fibra tubolare porosa (HF FlFFF), realizzati anche mediante l’impiego di fibre microbore che con modifiche chimiche delle membrane.
1.b – Realizzazione di colonne monolitiche microbore per HPLC, sia mediante policondensazione sol-gel ottimizzando la distribuzione della struttura reticolata, sia (prive di frit) sol-gel impaccate, sia con bio-molecole immobilizzate.
1.c – Sviluppo di microarray proteici basati sull’uso di anticorpi attraverso l’ottimizzazione dei protocolli di immobilizzazione e di ibridazione nonché marcatura con ligandi di ioni metallici per il successivo impiego dell’ICP-MS.
1.d – Preparazione e caratterizzazione di colonne monolitiche HPLC ad elevata porosità per pre-concentrare on line miscele peptidiche da sottoporre a cromatografia bidimensionale.
L’insieme di queste tecniche separative consentirà di affrontare in maniera innovativa il complesso delle problematiche di preparazione del campione. Lo sviluppo di queste metodologie separative è, infatti, assolutamente rilevante nello studio del proteoma “reale” perché gli obiettivi previsti riguardano la realizzazione e la messa a punto di processi separativi degli analiti di natura proteica quando sono presenti in matrici di particolare complessità.
Per quanto poi concerne lo sviluppo e la messa a punto di metodi innovativi per l’identificazione e la quantificazione delle proteine, gli obiettivi riguarderanno:
2.a – Sviluppo di metodi quantitativi in multiplex attraverso l’analisi delle specie metalliche analizzabili in ICP-MS dopo opportuna marcatura delle proteine.
2.b – Nuovi sistemi di marcatura di residui post-traduzionalmente modificati utilizzando derivati del cloruro di dansile e dell’iTRAQ per l’identificazione selettiva e la quantificazione delle proteine modificate mediante l’impiego di MS3.
2.c – Realizzazione di nuovi tag di natura sulfonil-aromatica, facilmente marcabili con isotopi pesanti, che, con l’impiego di nuove matrici, consentano l’analisi, anche quantitativa, utilizzando il MALDI-TOF/TOF.
Questi obiettivi sono intesi a valorizzare le enormi potenzialità delle nuove strumentazioni recentemente introdotte in commercio con la messa a punto e lo sviluppo di derivatizzazioni chimiche funzionali alle possibilità tecnologiche e strumentali finora non adeguatamente sfruttate. E’ da sottolineare come l’ICP-MS sia stato pochissimo utilizzato negli studi di proteomica, come l’uso della trappola lineare sia stato spesso limitato all’analisi in MS2 laddove le potenzialità analitiche di analisi in MSn sono rilevanti ai fini degli studi di proteomica, come non siano state ancora sviluppate matrici per la ionizzazione, in relazione ad opportune derivatizzazioni degli analiti, specifiche per le potenzialità di analisi che il MALDI-TOF/TOF può offrire.
Per poter valutare in itinere l’efficacia delle metodologie strumentali messe a punto ci si rivolgerà alla soluzione di problemi relativi all’analisi di proteomi in matrici particolarmente complessi di interesse chimico-clinico che riguardano:
1. Il profiling del siero umano mediante HF FlFFF e MALDI-TOF con l’obiettivo di identificare marcatori molecolari di stati patologici attraverso la separazione e l’analisi delle componenti meno rappresentate (LAP) e delle lipoproteine in particolare.
2. Il profiling di cellule intere, in particolare di batteri patogeni, per definire le proteine caratteristiche di specifiche linee cellulari.
3. La caratterizzazione di proteine implicate in processi infettivi virali usando come sistema modello il Parvovirus B19.
4. L’analisi qualitativa e quantitativa di allergeni “nascosti” in prodotti alimentari per evidenziare in matrici particolarmente complesse proteine allergeniche presenti in tracce in conseguenza di contaminazioni incrociate.
5. L’analisi del profilo di espressione di proteine cardiache e muscolo-scheletriche in relazioni a patologie cardiache e muscolari ed a condizioni di stress.
Per i raggiungimento degli obiettivi sarà necessario un intenso lavoro di coordinamento per favorire le integrazioni ed ottimizzare le sinergie sia in termini di competenze che di strumentazioni. Il lavoro di coordinamento sarà realizzato per mezzo di rapporti interni trimestrali e riunioni semestrali che si terranno ai mesi 0, 6, 12 e 18 dall’inizio delle attività. In tali riunioni verranno programmati anche gli stages di giovani ricercatori presso UO diverse da quelle di appartenenza per favorire l’acquisizione e la disseminazione di conoscenze metodologiche e strumentali. Infine si prevede di presentare, al termine del progetto, i risultati conseguiti mediante l’organizzazione di una giornata di studio sul ruolo della chimica analitica nello sviluppo della proteomica alla comunità nazionale interessata alla chimica del proteoma. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La sfida che la proteomica, la nuova frontiera della ricerca biologica e medica, pone alla comunità scientifica è fondata essenzialmente sulle metodologie proprie della “chimica analitica”. Lo studio del proteoma, infatti, si basa sulla separazione e sulla successiva analisi qualitativa e quantitativa di popolazioni di analiti di natura proteica, ponendo al centro la metodologia di più rilevante impatto sulla moderna chimica analitica: la spettrometria di massa (MS). E’ ben noto che la proteomica, nata da poco più di un decennio, si è essenzialmente basata su tecniche di separazione e su metodologie MS in gran parte mature. Nonostante gli sviluppi tecnologici e metodologici nel decennio trascorso, la proteomica è ancora lontana dall’aver raggiunto quel livello di elevata processività che la ricerca biologica e medica, in conseguenza della sempre maggiore utilizzazione delle conoscenze genomiche, ormai richiede (1). Gli aspetti di maggiore criticità riguardano la preparazione del campione e, conseguentemente, le tecnologie separative, le metodologie di analisi quantitative in relazione alle potenzialità offerte dagli MS di nuova generazione. In relazione agli obiettivi del progetto vengono di seguito delineati le basi scientifiche nazionali ed internazionali.

1. Metodi di separazione e di screening
1,a - Frazionamento in campo-flusso e colonne monolitiche
Le metodiche separative oggi comunemente applicate nel campo proteomico si basano essenzialmente su elettroforesi bidimensionale su gel (2D-gel) e sulla cromatografia bidimensionale (2D-HPLC). Entrambi gli approcci offrono notevoli vantaggi e costituiscono oggi metodologie “mature” per l’analisi proteomica. Tuttavia, queste metodologie pur con gli indubbi vantaggi mostrano notevoli limitazioni. In particolare la 2D-gel evidenzia difficoltà nella separazione di proteine con valori di pI e pesi molecolari estremi, di proteine idrofobiche e di membrana, nell’analisi quantitativa e presenta problemi nella riproducibilità e nella automazione. Anche la 2D-HPLC, sebbene accoppiata a moderne metodologie di MS, mostra limitazione intrinseche quando viene applicata all’analisi di interi proteomi. Inoltre, le analisi 2D-HPLC forniscono un’enorme numero di dati che richiedono una gestione molto complessa e sono difficili da controllare (2,3).
Esiste pertanto una precisa esigenza di nuove tecniche di pre-frazionamento e di separazione. Per far fronte a tali esigenze si sono affacciate sulla scena due metodologie separative basate su concezioni estremamente innovative: i) il frazionamento in campo di flusso (FFF); ii) la cromatografia su colonne monolitiche.
i) Le tecniche FFF sono una famiglia di tecniche di separazione che solo recentemente sono state rivolte all’analisi e la caratterizzazione di proteine intatte e di complessi proteici (4). Una variante FFF impiega un flusso secondario di fase mobile come campo perpendicolare (FlFFF) (5). La FlFFF mostra vantaggi intrinseci per l’analisi di proteine intere in forma nativa: (i) la separazione avviene in un canale privo di fase stazionaria e le forze di frizione esercitate sulle molecole delle proteine sono scarse o nulle; (ii) la versatilità nella scelta della fase mobile evita possibili degradazioni delle proteine, e non influenzare la ionizzazione nella successiva analisi MS; (iii) è più selettiva nell’analisi di proteine ad alto peso molecolare; (iv) le differenze nei tempi di ritenzione variano in relazione alla geometria ed alla conformazione dei complessi proteici. Per queste caratteristiche peculiari, la FlFFF si dimostra molto efficace per la separazione “soft” e per la successiva caratterizzazione di proteine ad alto peso molecolare ed oligomeri proteici (6). Inoltre il recente sviluppo di una variante prototipo a microcolonna della FlFFF (HF FlFFF) offre il vantaggio di un ridotto volume del canale (dell’ordine di 100 µL). rendendo questa tecnica potenzialmente disponibile ad un eventuale accoppiamento diretto con la MS per l’analisi di proteine (7).
ii) Le convenzionali colonne capillari impaccate con particelle di gel di silice (diametro medio delle particelle 3 - 5 µm), in genere devono essere utilizzate a pressioni molto alte per consentire il passaggio della fase mobile. Esse inoltre non sono adatte ad analisi rapide infatti, date le basse velocità di flusso compatibili, danno luogo a separazioni relativamente lente. Questi problemi possono essere risolti utilizzando fasi stazionarie monolitiche, che permettono di condurre analisi con la stessa, efficienza e con contropressioni tre volte più basse. Inoltre, le basse contropressioni permettono di aumentare molto la velocità di flusso, fornendo un più rapido trasferimento di massa grazie ad una più efficiente diffusione degli analiti (8).
Le colonne monolitiche sono costituite da un unico blocco di materiale macroporoso ottenuto attraverso la polimerizzazione “in situ” del monomero. La risultante struttura reticolata dei pori produce un elevato sviluppo superficiale ed una funzionalità che ne permette l’utilizzo in diverse tipologie di separazione. Inoltre, poiché la struttura è strettamente legata alle pareti interne del capillare, le colonne monolitiche non richiedono “frit” di contenimento. Le colonne monolitiche hanno trovato applicazione in diversi campi, per esempio come fibre per la microestrazione in fase solida (9), colonne separative per HPLC e CEC (10-11), colonne con biomolecole incapsulate ed immobilizzate (12). L’utilizzo di colonne monolitiche a base di silice porosa bimodale sta diventando di crescente interesse anche nel campo della proteomica (13). Inoltre la disponibilità in commercio di un’ampia gamma di reagenti per la funzionalizzazione del gel di silice potrebbe rendere ancora più vasta l’applicazione della cromatografia monolitica alle problematiche in campo proteomico.

1.b–Microarray proteici
Gli array di proteine sono stati inizialmente proposti per selezionare librerie di DNA relative a cloni di proteine ricombinanti in Escherichia coli (14).La successiva miniaturizzazione ha portato a microarray costituiti da un insieme di proteine immobilizzate su un chip in una griglia bidimensionale (15). Le due classi di microarray di proteine attualmente disponibili sono costituite dai microarray di tipo analitico e dai microarray di tipo funzionale (16). I primi rappresentano una delle tecnologie di rivelazione di proteine in multiplex più potenti, mentre i secondi sono crescentemente applicati allo studio di interazioni di proteine (ad es. interazioni proteina-proteina, proteina-lipidi, proteina-DNA, proteina-farmaci, e proteina-peptidi), di attività biochimiche, e di risposte immunologiche (17).
Nell’ambito dei microarray di tipo analitico, la classe più rappresentativa prevede l’uso di anticorpi, disposti in serie su una superficie di vetro, che utilizzano meccanismi altamente specifici per il riconoscimento di proteine in campioni biologici (18). Questo tipo di array è progettato per l’identificazione delle proteine di interesse con alta specificità e affinità per uno screening ad elevata produttività. Nei microarray basati sull’uso di anticorpi, sono state proposte varie strategie per la generazione e l’amplificazione del segnale, quali la colorimetria, la radioattività, la fluorescenza, la chemiluminescenza, l’uso di nanoparticelle o di enzimi immobilizzati (19). Tuttavia, nonostante il numero crescente di promettenti applicazioni di questo tipo di microarray, attualmente sono disponibili anticorpi ben caratterizzati solo per un numero limitato di proteine marker. Inoltre, la reattività incrociata degli anticorpi con più di una proteina “bersaglio” può determinare un numero elevato di falsi positivi (20).
Le tecniche di rivelazione usate nella tecnologia dei protein microarray, sono basate su strategie di marcatura con reagenti fluorescenti, cromogeni e radioattivi per la rivelazione di bersagli immobilizzati. Alternativamente sono stati sviluppati metodi basati sulla spettrometria di massa in cui le molecole di proteine legate sono rivelate mediante MALDI-TOF. Quest’ultima tecnica, nota con il termine di Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization (SELDI), sfrutta una piastra per l’analisi MALDI modificata con ligandi in grado di legare per affinità le proteine di interesse. La superficie “bersaglio” può quindi essere introdotta direttamente nello spettrometro di massa per la rivelazione. I chip possono altresì essere analizzati mediante tecnica MALDI per la caratterizzazione delle proteine legate (21). La tecnica SELDI presenta potenzialità per il confronto quantitativo in termini relativi di serie di proteine. Infine sono disponibili metodi di rivelazione basati sui biosensori SPR (Surface Plasmon Resonance imaging, Biacore) messi a punto per applicazioni di protein microarray recentemente integrati con strumenti MALDI-TOF MS (22-23).

2. Identificazione e quantificazione delle proteine mediante spettrometria di massa.

2.a–Impiego dell’ ICP-MS in proteomica.
La “Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS)” è una potente tecnica analitica, di relativa recente acquisizione, per la determinazione di elementi in tracce (24). La ICP-MS può offrire potenzialità estremamente promettenti per l’analisi di proteine: infatti, oltre alla classica determinazione di elementi quali il fosforo e lo zolfo, l’analisi della composizione elementare di un elemento (“tag”) coniugato ad un campione proteico può fornire una strada semplice e selettiva per l’analisi quantitativa in proteomica (25). La tecnica ICP-MS presenta caratteristiche analitiche che la rendono complementare ai protocolli convenzionali ed ha numerosi vantaggi quali: (i) elevata precisione; (ii) bassi limiti di rivelazione; (iii) un più basso rumore di fondo; (iv) ampio intervallo dinamico per ogni antigene; (v) minori effetti matrice derivanti da altri componenti del campione biologico (ad es. proteine interferenti presenti nel campione non hanno alcun effetto sull’analisi elementare); (vi) indipendenza di un fondo non specifico e della risposta analitica del metallo dai tempi di incubazione e dai processi successivi (la degradazione delle proteine non influenza infatti l’analisi dell’elemento legato; (vii) maggiore potenzialità in analisi simultanea (potenzialmente fino a circa 150 isotopi); (viii) eccellente risoluzione spettrale che consente determinazioni di elementi in tracce e a più alte concentrazioni (26). La combinazione di queste prestazioni con la marcatura delle proteine con metalli può aprire nuove interessanti prospettive per la proteomica di nuova generazione.
Uno degli approcci proposti in letteratura per la marcatura di anticorpi con metalli per la successiva determinazione ICP-MS è basato sul legame di appropriate nanoparticelle elementari a molecole biologiche. Sebbene questo saggio immunologico con rivelazione ICP-MS possa aprire nuove possibilità per l’analisi quantitativa simultanea di analiti di interesse biologico (27), questa strategia è limitata dalle dimensioni variabili delle nanoparticelle coniugate e dal rapporto tra le particelle e la proteina di interesse che dovrebbe essere determinato in modo indipendente.

2.b–Metodi per l’analisi selettiva e l’analisi quantitative in proteomica.
Una procedura oramai consolidata per la semplificazione del proteoma prevede la possibilità di marcare selettivamente i peptidi in cui siano presenti particolari amminoacidi (Cys, His, Met, Trp, etc) o dei frammenti N- o C-terminale, e la successiva purificazione dei soli peptidi marcati con metodi cromatografici (28). Con simili strategie è possibile isolare anche i peptidi che contengono PTMs (29-30). Sono stati infatti sviluppati metodi indirizzati alla specifica selezione di PTMs, in genere rivolti alla fosforilazione sebbene recentemente siano stati proposte strategie rivolte allo studio della glicosilazione e della nitrazione delle tirosine (31-37).Tuttavia questi metodi sono obbligati all’utilizzazione di più passaggi cromatografici con conseguenze sulle rese finali di peptide da identificare mediante analisi MS/MS. L’introduzione delle trappole lineari consente di analizzare con una discreta sensibilità anche i frammenti in MS/MS/MS. Pertanto se la marcatura si realizza con un gruppo funzionale che forma ioni frammento stabili (reporter ion tags) è possibile evitare almeno un passaggio cromatografico, perché la separazione in HPLC in fase inversa viene seguita attraverso il segnale prodotto in MS/MS/MS che caratterizza e seleziona il peptide bersaglio. La validità di questo approccio è stato dimostrato recentemente mediante l’uso di derivati del dansile per la caratterizzazione selettiva dei residui fosforilati (38).
Come corollario ai sistemi di marcatura sopra descritti sono stati suggeriti metodi di analisi quantitativa basati sull’uso di MS e di isotopi stabili che consentono di determinare le variazioni relative nell’ammontare delle proteine (39-40). Il principio alla base di questi metodi consiste nell’incorporazione di un reattivo contenente un isotopo stabile nelle proteine provenienti da uno dei due stati che si vuole esaminare. Certamente il metodo dell’ isotope-coded-affinity tags (ICAT) (39) ha riscosso il maggiore interesse da parte degli studiosi del proteoma. Questo reattivo marca specificamente i residui di cisteina per la presenza di un gruppo iodoacetato e consente la purificazione selettiva dei peptidi marcati per il fatto di possedere un’unità di biotina che viene riconosciuta da colonne di affinità con avidina legata. La differente espressione proteica in due campioni tra loro correlati (per esempio cellule normali e modificate) è effettuata paragonando le intensità ioniche dei peptidi marcati isotopicamente con marcatori leggeri o pesanti (39). Comunque , il sistema ICAT richiede stadi di cromatografia di affinità e di scambio ionico, dopo la marcatura e prima dell’analisi LC/MS. Durante l’analisi cromatografia si risente l’effetto isotopico. Inoltre il legante avidinico ha un’affinità limitata per il bersaglio biotina. Lavaggi più drastici possono portare alla perdita di alcuni peptidi, riducendo così la sensibilità del metodo, mentre in condizioni più blande, componenti non contenenti cisteina possono contaminare il set di peptidi “etichettati” e confondere i risultati. Recentemente è stato introdotto un sistema in fase solida per l’etichettatura di massa (MS), basato sulla metodologia della sintesi dei peptidi col metodo Fmoc (41). In tale metodo, viene introdotto un sito reattivo per la cisteina. Poiché i peptidi sono legati covalentemente alla resina, l’uso di lavaggi ripetuti non comporta i problemi prima descritti. Comunque il frazionamento cromatografico bi-, tri-dimensionale risulta indispensabile prima dell’analisi mediante spettrometria di massa (42).
Infine reattivi del tipo estere della metilpiperazina acetato con la N-idrossisuccinimide, con il nome commerciale di iTRAQ, sono stati introdotti per l’analisi quantitativa in quadruplex (43). Questi reattivi sono rappresentati da quattro reagenti isobari che sono amino-specifici e portano a peptidi marcati identici in massa, e quindi identici nella modalità MS, ma che producono abbondanti, diagnostici ioni marcatori a bassa massa, mediante MS/MS, permettendo di eseguire l’analisi quantitativa di quattro campioni simultaneamente.
Attualmente tuttavia, non sono disponibili metodi universali di marcatura selettiva capaci di quantificare contemporaneamente l’espressione proteica e le PTMs (44). Perciò in campo analitico un enorme interesse è rivolto allo sviluppo di strategie per la caratterizzazione di PTMs. In quest’ambito, procedure di marcatura chimica selettiva usate in combinazione con marcatori contenenti isotopi pesanti e tecniche avanzate di spettrometria di massa quali MS3 possono fornire maggiore affidabilità nell’identificazione di PTMs in un approccio di proteomica di nuova generazione. <<<