RICERCA ITALIANA     

Architetture molecolari basate su DNA e peptidi per applicazioni nanotecnologiche.

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Lo studio e la conoscenza delle proprietà strutturali e dinamiche del DNA e delle proteine, a parte l'importanza intrinseca per l'interpretazione e la regolazione dei processi biologici ed evolutivi, costituiscono la base per la progettazione ed applicazioni nanotecnologiche. Le bio-nanotecnologie utilizzano, infatti, le proprietà di costrutti polinucleotidici o polipeptidici naturali e sintetici per diversi scopi: elettronica molecolare, nanosensori, diagnostica molecolare, veicolazione di farmaci, nanosistemi funzionali, nanomacchine, biocatalizzatori nanostrutturati, nanolitografia, membrane molecolari ultrasottili, interfacce tra sistemi sintetici e biologici e chimica supramolecolare.
Questo programma di ricerca mira alla progettazione ed alla realizzazione di nuovi sistemi nanotecnologici autoassemblanti di DNA e di poli-a-amminoacidi che non sono basati soltanto su processi di riconoscimento che agiscono su scala molecolare locale, ma anche su meccanismi collettivi in scala nanometrica.
Il progetto si articola in linee di ricerca tradizionali delle due unità coinvolte e da alcuni anni condotte in collaborazione integrando vantaggiosamente le proprie esperienze scientifiche:

a) Costruzioni molecolari e nanodispositivi basati sul DNA.

b) Analisi e modellizzazione delle interazioni del DNA con superfici cristalline.

c) Sintesi e proprietà di peptidi con sequenze enantiomeriche regolari: un'ampia classe di architetture modulari auto-assemblanti per applicazioni nanotecnologiche.

a) Nel caso dei costrutti e dei nanodispositivi basati su sequenze nucleotidiche, il meccanismo di autoassemblaggio è controllato dall'accoppiamento selettivo, via legami idrogeno, delle basi del DNA che permette la costruzione di nuove architetture statiche e dinamiche su diverse scale nanometriche (B. Samorì, G. Zuccheri, DNA codes for nanoscience. Angewandte Chemie Int. Ed., 44 (2005) 1166-1181).

b) Recentemente, l'analisi statistica delle immagini AFM di DNA palindromi ha condotto i proponenti del progetto a scoprire la presenza di interazioni collettive tra sequenze nucleotidiche e superfici cristalline inorganiche che portano ad un adsorbimento selettivo delle facce di DNA curvi fino a rapporti prochirali di 25/1 (B. Sampaolese, A. Bergia, A. Scipioni, G. Zuccheri, M. Savino, B. Samorì, P. De Santis, Recognition of the DNA sequence by an inorganic crystal surface. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 13566-13570). Una linea del progetto è dedicata ad approfondire e modellare teoricamente il meccanismo di riconoscimento.

c) Sequenze regolari enantiomeriche di amminoacidi possiedono una forte propensione a formare ciclopeptidi che si autoassemblano in nanotubi modulari attraverso sistemi di legami idrogeno (P. De Santis, S. Morosetti, R. Rizzo, Conformational Analysis of Regular Enantiomeric Sequences Macromolecules 7 (1974) 52-58). Tale proprietà, prevista circa 30 anni fa, è stata verificata sperimentalmente in numerosi lavori condotti nell'unità di Roma ed in altri laboratori. Una linea del progetto è dedicata alla sintesi ed allo studio della struttura e delle proprietà di nanotubi peptidici autoassemblanti stabilizzati da complessi metallici ricorrenti. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Pasquale De Santis Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Le nanoscienze costituiscono un'area scientifica caratterizzata da una forte interdisciplinarietà in grande sviluppo anche per le molteplici applicazioni nanotecnologiche che sono state progettate e realizzate. La maggior parte di queste utilizza strumenti culturali e tecnologici propri delle discipline chimiche. Le nanoscienze infatti studiano le proprietà della materia in scala nanometrica in cui le grandezze meccaniche molecolari e d'insieme contengono effetti quantomeccanici e fluttuazioni statistiche significative dall'equilibrio termodinamico. Queste caratteristiche sono al confine con le proprietà chimiche delle molecole ed in particolare delle macromolecole biologiche. Queste ultime sono una fonte importante di ispirazione per la ricerca e stanno acquisendo un ruolo centrale nel progetto e nella realizzazione di applicazioni nanobiotecnologiche. Le bionanotecnologie utilizzano infatti le proprietà di costrutti polinucleotidici o polipeptidici naturali e sintetici per diversi scopi.
Gli obiettivi del progetto possono essere sinteticamente descritti da tre linee di ricerca che integrano vantaggiosamente le esperienze e le potenzialità scientifiche delle due unità coinvolte e in parte comprendono ricerche da alcuni anni condotte con successo in collaborazione. Queste linee di ricerca si basano sulla proprietà delle sequenze nucleotidiche e peptidiche programmate di auto-organizzarsi utilizzando la formazione selettiva di legami idrogeno ed interazioni non covalenti. L'auto-organizzazione è infatti la soluzione che la natura utilizza per costruire le complesse strutture biologiche a partire da componenti, amminoacidi e nucleotidi, che sono di diversi ordini di grandezza più piccoli.

a) Costruzioni molecolari e nanodispositivi basati sul DNA.

Un obiettivo del progetto di ricerca è la costruzione di un tipo bidimensionale di architettura supramolecolare basato sull'assemblaggio di "piastrelle" a forma di parallelogramma piatte e rigide, come proposto inizialmente da Seeman e coll. (C. Mao, W. Sun and N. C. Seeman, J. Am. Chem. Soc. 121 (1999) 5437-5444). Ciascuna "piastrella" si auto-assembla in un'unica possibile struttura grazie all'interazione progettata tra sei differenti oligonucleotidi, (vedere figura 1 progetto UBO). I singoli parallelogrammi saranno assemblati con la stessa procedura messa a punto precedentemente per la costruzione di polimeri lineari (M. Brucale, G. Zuccheri, B. Samorì, TIBS, in stampa) e il risultante polimero sarà visualizzato mediante AFM. Questo studio renderà possibile lo sviluppo di una classe di polimeri supramolecolari di differenti forme e dimensioni con un grande controllo strutturale ed inoltre con la possibilità di adattarsi in risposta a stimoli esterni interconvertendosi tra alcuni dei possibili stati.
Il DNA può essere usato anche per la costruzione di nanodispositivi molecolari, capaci di muovere nano-oggetti come risposta ad un impulso esterno (C. M. Niemeyer, M. Adler, Angew. Chem., Int. Ed. 41 (2002) 3779-3783). Per essere adatta a questo tipo di applicazione, una transizione conformazionale del DNA deve essere sufficientemente veloce e deve essere in grado di rispondere in maniera efficace, senza mostrare variazioni in rendimento o degradazione, quando viene ripetutamente indotta.
La variazione conformazionale da doppia a tripla elica costituisce un sistema ideale per generare un moto controllato in nanoscala (M. Brucale, G. Zuccheri, B. Samorì, Org. Biomol. Chem. 3 (2005) 575-577). La tripla elica è formata da una doppia elica bersaglio contenente una opportuna sequenza omopurinica legata ad un "triplex-forming-oligonucleotide" (TFO) omopirimidinico. La formazione di questo tipo di triplex è altamente dipendente dalla protonazione del gruppo imminico delle citosine del TFO e perciò può essere controllato dinamicamente variando il pH. Per studiare il comportamento dinamico e la riproducibilità di questa transizione abbiamo progettato e ci proponiamo di realizzare una struttura di DNA capace di assumere alternativamente due conformazioni grazie alla formazione e alla rottura intramolecolare della tripla elica controllata dal pH. La dinamica di questo dispositivo sarà studiata in collaborazione con URO mediante simulazioni di dinamica molecolare.

b) Analisi e modellizzazione dei meccanismi di riconoscimento tra sequenze di DNA e superfici cristalline inorganiche.

La scoperta, fatta in collaborazione dai due gruppi di ricerca, che sequenze di DNA caratterizzate da superstrutture curve possono essere riconosciute da una superficie cristallina è un primo passo nella direzione dell'utilizzazione nanotecnologica del riconoscimento tra sequenza nucleotidica e superfici inorganiche (G. Zuccheri, A. Scipioni, V. Cavaliere, G. Gargiulo, P. De Santis, B. Samorì Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (2001) 3074-3079; B. Sampaolese, A. Bergia, A. Scipioni, G. Zuccheri, M. Savino, B. Samorì, P. De Santis Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99 (2002) 13566-13570; A. Scipioni, C. Anselmi, G. Zuccheri, B. Samorì, P. De Santis Biophys. J., 83 (2002) 2408-2418).
Uno degli scopi del progetto è di chiarire la natura chimico-fisica di questi meccanismi che renderà possibile utilizzare le due differenti gerarchie di informazioni contenute nella catena di DNA, quella basata sul riconoscimento selettivo tra le basi su scala molecolare e quella basata sul riconoscimento collettivo di tratti di sequenza da parte di superfici su una più ampia scala nanometrica.
Una parte importante di questo programma sarà la modellizzazione del meccanismo di riconoscimento. Risultati preliminari di URO indicano che la selettività dell'interazione è legata al campo elettrostatico radiale associato alla struttura del DNA modulato dalle distribuzioni differenziali della carica elettronica sulle differenti basi. Un altro contributo alla comprensione del meccanismo di riconoscimento sarà ottenuto da misure di forza di adesione a livello molecolare da parte di UBO.

c) Architetture modulari auto-assemblanti basate su peptidi con sequenze enantiomeriche regolari.

Il notevole interesse nelle nanoscienze e nanotecnologie verso nanotubi di carbonio ed inorganici ha rinnovato l'attenzione verso le associazioni tubolari organiche durante gli ultimi dieci anni. Tra le strategie sviluppate per il progetto e la realizzazione di nanotubi organici, quelli caratterizzati da sequenze di a-amminoacidi con alternanza regolare di enantiomeri si stanno dimostrando particolarmente interessanti. Sequenze regolari enantiomeriche di amminoacidi possiedono una forte propensione a formare ciclopeptidi che si autoassemblano in nanotubi modulari attraverso sistemi di legami idrogeno (P. De Santis, S. Morosetti, R. Rizzo 7 (1974) 52-58). Tale proprietà, prevista circa 30 anni fa da URO, è stata verificata sperimentalmente da numerosi lavori condotti da URO ed in altri laboratori. La natura polare della superficie interna dei nanotubi peptidici rappresenta un carattere importante per progettare canali ionici transmembrana che hanno permesso in passato di evidenziare eventi di conduzione di singole molecole. Un obiettivo di questo progetto sarà quello di costruire architetture modulari transanulari per potenziali applicazioni nanotecnologiche utilizzando la grande versatilità chimica delle catene laterali degli amminoacidi. Tra le altre, in particolare, sulla base dell'esperienza precedente di URO, utilizzeremo ciclopeptidi con sequenze enantiomeriche alternanti della lisina per ottenere architetture autoassemblanti modulari di policomplessi metallici di nanotubi peptidici con potenziali proprietà magnetiche ed alta rigidità strutturale, utili per la costruzione di nanocircuiti (vedi progetto URO). Questi costrutti saranno studiati in soluzione con tecniche spettroscopiche e dopo deposizione orientata su opportune superfici, mediante tecniche AFM in collaborazione tra le due unità di ricerca. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

a) Proprietà strutturali e dinamiche di sequenze di DNA su scala nanometrica.

L'attuale era post-genomica vede ogni giorno accumularsi nelle banche-dati un grande numero di sequenze di DNA che contengono miliardi di elementi informazionali. E', quindi, sempre più sentita la necessità di tradurre l'informazione lineare contenuta nella sequenza nucleotidica in elementi funzionali.
Molte delle funzioni del DNA sono guidate da deviazioni dalla sua regolarità strutturale. Queste deviazioni sono proprietà collettive della sequenza e sono riconosciute ed amplificate dall'associazione con proteine. Una parte importante del contenuto di informazione del DNA non è quindi localizzata nelle regioni codificanti ma sembra essere piuttosto in relazione con le caratteristiche stereochimiche ed elastiche di lunghi tratti di sequenze, cioè con le proprietà nano-meccaniche del DNA. Un tipico esempio di associazione DNA-proteine, in cui la dipendenza da tratti di sequenza è particolarmente evidente, è il nucleosoma, l'associazione fra il DNA e le proteine istoniche che governa la regolazione genica e l'impacchettamento e l'organizzazione superstrutturale del genoma eucariotico.
Una rappresentazione utile di queste proprietà superstrutturali è convenientemente espressa in funzione della curvatura e della flessibilità, che sono coinvolte nei meccanismi che governano sia la stabilità e la dinamica a livello nanometrico dei sistemi biologici, sia i processi di riconoscimento di proteine strutturali e regolative.
Recentemente, l'unità di Roma (URO) ha sviluppato un metodo analitico per studiare gli effetti di sequenza sulla superstruttura tridimensionale del DNA che si basa sull'integrazione delle piccole perturbazioni conformazionali delle diverse unità dinucleotidiche presenti lungo la sequenza che erano state precedentemente valutate teoricamente (1-5). URO ha quindi sviluppato un modello meccanico statistico che è in grado di prevedere la mobilità elettroforetica, le costanti termodinamiche delle reazioni di circolarizzazione di tratti di DNA (6-9) e le transizioni di "writhing" da forme circolari rilassate a superavvolte in funzione della sequenza, anche quando sono presenti proteine che inducono curvatura o svolgimento della doppia elica (10). Più recentemente, l'approccio meccanico statistico basato sulla curvatura statica e dinamica in funzione della sequenza è stato adottato per prevedere la stabilità termodinamica dei nucleosomi in ottimo accordo con i dati sperimentali (11-23).
In questi ultimi anni, le due unità di ricerca in collaborazione hanno proposto un nuovo metodo che consente di ottenere la curvatura e la flessibilità di tratti di DNA dall'analisi di immagini di microscopia a forza atomica (AFM) e fatto significativi passi in avanti nella caratterizzazione delle proprietà meccaniche del DNA dipendenti dalla sequenza. L'AFM, infatti, è una tecnica che fornisce direttamente le immagini delle singole molecole e può seguirne, inoltre, l'evoluzione nel tempo in cella liquida (24). Un'analisi più attenta della distribuzione statistica della curvatura lungo il profilo delle molecole palindrome di DNA ha messo in evidenza che la mica, di solito utilizzata negli esperimenti AFM, è in grado di riconoscere le piccole differenze tra le sequenze di basi complementari sui due filamenti di B-DNA ed interagire selettivamente con una delle due facce dei tratti curvi di DNA (25-28). La strategia adottata dei DNA palindromi permette infatti di definire le proprietà statiche e dinamiche del DNA in funzione della sequenza nucleotidica indipendentemente dal verso di digitalizzazione delle immagini che appaiono come linee sottili in AFM. I risultati ottenuti sono in accordo con il modello teorico di curvatura e flessibilità proposto precedentemente da URO(25-30) e hanno permesso implicitamente di scoprire l'esistenza di un riconoscimento prochirale a carattere collettivo tra sequenze di DNA e superfici cristalline inorganiche che può raggiungere rapporti 25/1 tra le due facce complementari del DNA.

b) Costruzioni molecolari e nanodispositivi basati sul DNA.

L'autoassemblaggio gerarchico è la soluzione che la natura utilizza per costruire strutture complesse a partire da componenti che sono di diversi ordini di grandezza più piccoli (31). Il principio dell'autoassemblaggio di piccoli oggetti per costruire strutture complesse (bottom-up) è molto promettente nel campo delle nanotecnologie. L'assemblaggio molecolare, guidato da un contenuto informazionale programmabile, ed avente la risoluzione del nanometro può potenzialmente avere un fortissimo impatto sul futuro sviluppo tecnologico ed è attualmente il principale obiettivo in molti campi di ricerca quali, in particolare, chimica supramolecolare, scienze dei materiali, ingegneria elettronica e sviluppo di biosensori.
Sono stati sviluppati diversi metodi per ottenere materiali nano-struturati di varia natura chimica (32); tra questi i metodi basati sul DNA offrono possibilità non riscontrate nei metodi basati su altre molecole. Nel campo delle nanotecnologie il DNA può essere considerato come il mattone supramolecolare con il più alto contenuto di informazione. Il codice di complementarietà di Watson e Crick può essere sfruttato per organizzare l'autoassemblaggio inter- o intra-molecolare di un numero arbitrario di molecole naturali o sintetiche (33). Inoltre una molecola di DNA può essere facilmente modificata con estrema precisione e versatilità tramite la chimica di sintesi o sfruttando l'ampia gamma di enzimi naturali e facilmente funzionalizzata con specie differenti, come nanoparticelle metalliche, proteine, nanotubi di carbonio o coloranti organici (34-38), fornendo quindi un metodo efficiente per organizzare una vasta gamma di nano-oggetti in strutture definite.
La nanotecnologia strutturale del DNA nasce nel 1982 ad opera di Seeman (39), che utilizzando la strategia di giunzioni Holliday (vedi Figura 1 dell'unità di Bologna (UBO)) ha progettato e in parte realizzato nanostrutture di grande complessità (40, 41).
Gli sforzi fatti nell'indagine dei principi dell'autoassemblaggio nella nanotecnologia del DNA hanno portato alla creazione di un grande numero di diversi motivi strutturali, che possono essere combinati per creare architetture nanometriche definite. Due esaustive reviews su tutti i principali motivi utilizzati fino ad ora nelle nanotecnologie del DNA sono presenti in letteratura (42, 43).
Il DNA può essere usato anche per la costruzione di nanodispositivi molecolari, capaci di muovere nano-oggetti seguendo un impulso esterno (44). Le più comuni strategie per ottenere movimenti controllati delle nanostrutture di DNA usano equilibri di scambio di filamento competitivo, che originano diverse topologie (45-50) e utilizzano la capacità intrinseca del DNA di assumere dinamicamente differenti conformazioni in risposta a variazioni ambientali.
UBO ha impiegato recentamente la variazione conformazionale da doppia elica a tripla elica per generare un moto controllato su scala nanometrica (51). La formazione di questo tipo di triplex è altamente dipendente dalla protonazione del gruppo imminico delle citosina e può essere controllato dinamicamente dalla variazione di pH (vedi figura reportata sotto).



Grande sforzo è attualmente profuso nel comprendere come le capacità delle molecole biologiche possano essere combinate con sistemi inorganici in processi di autoassemblaggio e nell?identificare le appropriate compatibilità e combinazioni di macromolecole biologiche con materiali inorganici. La recente scoperta, da parte dei due partner di questo progetto, URO e UBO, che la sequenza del DNA può essere riconosciuta nella nanoscala dalla superficie di un cristallo di mica, è un primo passo verso questo obiettivo (25,26).

c) Peptidi con sequenze enantiomeriche regolari: un'ampia classe di architetture modulari auto-assemblanti per applicazioni nanotecnologiche.

Il notevole interesse delle nanotecnologie verso i nanotubi di carbonio ed inorganici ha, di recente, rinnovato l'attenzione sulle associazioni tubolari organiche. Tra le strategie sviluppate per il progetto e la realizzazione di nanotubi organici, quelli caratterizzati da sequenze con alternanza regolare di enantiomeri si stanno dimostrando particolarmente interessanti. Circa trenta anni fa URO ha formulato i principi generali che regolano la stabilità conformazionale di sequenze enantiomeriche (52). La formazione di tali strutture è il risultato della equivalenza conformazionale delle unità monomeriche, un principio generale che associa all'equivalenza chimica l'equivalenza stereochimica lungo una catena polimerica. Ciò dà luogo a strutture elicoidali nel caso di sequenze omoconfigurazionali, mentre produce strutture cicliche per sequenze enantiomeriche alternanti con simmetria, Sn.
Nel caso di DL a-amminoacidi con sequenze alternate l'unità URO ha previsto teoricamente la loro tendenza intrinseca a formare strutture cicliche autoassemblanti o elicoidali a basso passo caratterizzate da conformazioni beta e dalla presenza di superfici interne polari che permettono una interazione transiente con un flusso attivato di ioni specifici. La natura polare della superficie interna dei nanotubi rappresenta una prpprietà importante per progettare canali ionici transmembrana che imitano i sistemi biologici. In effetti, i nanotubi peptidici hanno proprietà simili ad alcuni antibiotici peptidici e depsipeptidici coinvolti nel trasporto ionico permeoselettivo attraverso membrane biologiche.
Le previsioni teoriche sono state concretizzate attraverso la sintesi del polipeptide (L-Ala-D-Val)n e dei corrispondenti oligopeptidi Cbz(L-Ala-D-Val)nOCH3 (dove n=3, 4) e lo studio delle loro conformazioni mediante spettroscopia NMR e CD (53). La sintesi del polipeptide (L-Pro-D-Pro)n ha permesso di verificare sperimentalmente le proprietà di conduttore ionico a canale attraverso membrane molecolari lipidiche mettendo in evidenza eventi di conduzione di singole molecole (in figura è mostrata una parte del profilo di conducibilità in cui si riconoscono gli eventi di apertura e chiusura di singoli canali e, in alcuni casi, di due e tre canali) (54).



Lo studio della struttura e delle proprietà di alcuni oligomeri della poliprolina DL e di loro complessi cationici condotto mediante spettroscopia NMR e CD (55, 56) ci ha permesso di confermare il modello di conduzione a canale.
Studi successivi hanno mostrato la formazione di strutture a doppia elica beta per gli octapeptidi lineari alternanti DL della valina e della fenilalanina (57, 58).
Venti anni dopo queste ricerche sulla formazione e sulla stabilità di architetture transanulari auto-assemblanti basate su oligomeri ciclici di residui di amminoacidi con configurazioni alternate, Ghadiri e coll. hanno pubblicato una serie di eleganti lavori che confermano le previsioni teoriche (59-69).
Alcune applicazioni e prospettive nanotecnologiche di nanotubi peptidici sono state proposte da parte di diversi autori. Queste utilizzano la grande versatilità chimica delle catene laterali degli amminoacidi per stabilizzare mediante ponti chimici moduli ciclopeptidici adiacenti ottenendo nanotubi utili per potenziali applicazioni nanotecnologiche (70-72). <<<