RICERCA ITALIANA     

Materiali Polimerici Bioattivi per Applicazioni in Ingegneria Tissutale e Medicina Rigenerativa

Università di Pisa

Abstract

Il progetto di ricerca che si intende sviluppare con l’apporto tecnico-scientfico di cinque unità di ricerca da cinque Università Italiane è focalizzato su una tematica che richiede la convergenza di competenze multidisciplinari per un settore relativo alla preparazione di materiali polimerici per applicazioni biomediche mirate al settore emergente dell’Ingegneria Tissutale e Medicina Rigenerativa. Le Unità di Ricerca coinvolte vantano una consolidata esperienza nella scienza e tecnologia dei materiali polimerici biocompatibili e comprendono ricercatori con competenze di chimica macromolecolare, tecnologia farmaceutica, biologia cellulare ed ingegneria biomedica. Alcune delle unità operative hanno inoltre attive collaborazioni con ricercatori di medicina, veterinaria, bioinformatica, biologia molecolare e mutagenesi e differenziamento.
Il progetto che si propone di realizzare sistemi polimerici micro-nanstrutturati per la somministrazione controllata e mirata di agenti bioattivi ad alto e basso peso molecolare e per la realizzazione di supporti microscolpiti per la crescita, proliferazione e differenziamento cellulare, presenta tutte le premesse, alla luce della tipologia ed entità della forza lavoro e delle competenze in gioco, per il raggiungimento dei seguenti obiettivi con un margine di confidenza elevata.
1. Realizzazione di nuovi formulati (miscele e compositi) a matrice polimerica di origine sintetica o semisintetica o ibrida biocompatibili con caratteristiche di biodegradabilità o biostabilità convertibili in fase di polimerizzazione o da formulati di post-polimerizzazione in nanoparticelle e nanofibre di dimensioni comprese tra 10 e 500 nm e superfici micro- nanoscolpite.
2. Caratterizzazione strutturale dei materiali polimerici preparati e morfologico dimensionale delle micro- nanoparticelle ottenute dagli stessi.
3. Utilizzazione dei sistemi micro- nanostrutturali al punto 1 per la realizzazione di sistemi di rilascio controllato o mirato di agenti bioattivi principalmente a carattere oligomerico e polimerico di natura proteica o peptidica (nutrienti e fattori di crescita).
4. Valutazione della tossicità in vitro dei materiali e relativi sistemi micro- nanoparticellari non caricati mediante interazione con colture cellulari immortalizzate e native di varia natura.
I risultati ottenuti costituiranno l’oggetto di comunicazioni a convegni, pubblicazioni scientifiche su periodici nazionali ed internazionali, rapporti tecnici confidenziali ed eventuali brevetti.
5. Valutazione della bioattività in vitro ed in vivo con tecniche non invasive (NMR imaging) di sistemi di rilascio nanostrutturato (nanoparticelle e nanofibre) preparati nella prima fase.
6.Realizzazione di supporti micro-nanostrutturati principalmente da materiali polimerici biodegradabili/bioerodibili in assetti bidimensionali e tridimensionali. Tali supporti saranno strutturati in maniera tale da contenere nanoparticelle caricate con fattori di nutrizione, di crescita e differenziamento per le colture cellulari di elezione. Materiali polimerici multifunzionali strutturati per promuovere la vascolarizzazione dei supporti seminati con le cellule di elezione saranno utilizzati per garantire la vitalità e la funzionalità delle colture cellulari. L’attenzione in particolare sarà rivolta al settore della rigenerazione di tessuti molli e duri con particolare riferimento a quelli cartilaginei, epatici ed ossei rispettivamente che in prima istanza si presentano più facilmente gestibili da un punto di vista sia fondamentale che applicativo.
I risultati ottenuti costituiranno l’oggetto di comunicazioni a convegni nazionali ed internazionali, pubblicazioni scientifiche su periodici nazionali ed internazionali, rapporti tecnici confidenziali a scadenza semestrale ed eventuali brevetti.
I criteri di valutazione per l’intero progetto si possono pertanto assommare all’ottenimento di risultati attesi sopraindicati con una confidenza del 80-90%. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Emo Chiellini Università degli Studi di PISA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il progetto di ricerca da svolgere nell'ambito del PRIN 2006 con l’eventuale cofinanziamento da parte del MIUR, rientra nell'area della scienza ed ingegneria dei materiali polimerici specificamente progettati per applicazioni biomediche a fronte di tematiche intimamente connesse di ingegneria tissutale e somministrazione mirata di agenti bioattivi. Il progetto, che prevede il contributo di 5 unita' di ricerca da 5 diverse Universita' investe una problematica di notevole rilevanza fondamentale ed applicata e di attualità innovativa nel settore dell’Ingegneria Tissutale e della Medicina Rigenerativa.
I principi informatori e le metodologie che saranno utilizzate per lo sviluppo del progetto di ricerca saranno basati sulla progettazione e preparazione di nuovi formulati a matrice polimerica idonei ad essere convertiti, sia in fase di polimerizzazione che in processi di trasformazione post-polimerizzazione, in sistemi micro-nanostrutturati progettati come supporti in grado di sostenere la crescita e la proliferazione cellulare.
La stretta connessione tra gli obbiettivi fondamentali alla base del progetto di ricerca e’ suggerita dall'importanza che sistemi polimerici micro-nanostrutturati (nanoparticelle, nanofibre e superfici micro-nanoscolpite), possono ricoprire ruoli strutturali e funzionali di primaria importanza nella nuova area multidisciplinare dell'ingegneria tissutale e medicina rigenerativa. Le metodologie adottate attualmente nei trapianti d'organo possono essere paragonate allo spostamento di un edificio dal suo sito originario ad una nuova sede con tutti gli inconvenienti di stabilita’ strutturale e funzionale dell'edificio stesso e rilevanti costi socio economici. Una tecnica molto piu’ sicura ed affidabile consisterebbe nell'affidarsi ad architetti ed ingegneri e costruire dalle fondamenta l'immobile nella localita’ prescelta.
Ad oggi, i ricercatori coinvolti nella disciplina dell'ingegneria tissutale si sono orientati verso quest'ultima opzione costruttiva ed hanno prodotto supporti di base dove si insiedano ed auspicabilmente si differenziano e si moltiplicano cellule autologhe. Questo approccio risulta adatto e soddisfacente per la produzione di porzioni relativamente modeste di tessuti viventi in assetto bidimensionale, mentre si riscontrano serie difficolta’ nel realizzare organi vitali in assetti tridimensionali. La tendenza piu’ attuale nel campo della chirugia riparativa o sostitutiva di tessuti ed organi danneggiati mira pertanto alla realizzazione di trapianti autologhi di organi generati in vitro e di tessuti assemblati su supporti o substrati di materiali polimerici bioattivi che svolgano la funzione di supporti temporanei innocui sia per quanto riguarda la loro struttura iniziale che per ogni eventuale intermedio o metabolita finale da essi derivante.
A questo proposito, le diverse tipologie di micro-nanoparticelle polimeriche formulate per il rilascio controllato e mirato di principi bioattivi si integrano perfettamente nella ricerca e sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici, come la somministrazione di principi attivi di natura macromolecolare (peptidi, proteine, oligo e polinucleotidi per la medicina rigenerativa, terapia genica, terapia del cancro, immuno-deficienza, inibizione substrato-mimetica etc).
Il gruppo di ricerca si avvarra’ dei contributi trasversali per la validazione sperimentale delle micro-nanostrutture preparate sia in vitro che in vivo, ottenibili grazie alle tecniche non invasive avanzate e basate su NMR - imaging e spettroscopia allo stato solido.
I sistemi micro-nanoparticellari preparati cosi’ come alcune delle nuove matrici polimeriche saranno analizzate per la capacita’ di inglobare principi attivi e nutrienti necessari per la stimolazione della crescita, differenziamento e proliferazione di cellule in coltura monotipica o in co-coltura con particolare riferimento a tessuti molli (cartilagine e fegato) e duri (osso). L'effetto morfogenetico delle strutture molecolari su scala micro-nanoscopica sara’ valutato sia in base alla natura della matrice polimerica che delle geometrie prodotte al fine di definire le condizioni ottimali per mantenere la massima funzionalita’ di colture cellulari in bioreattori. A tale proposito, l'attivita’ di ricerca sara’ diretta a fornire soluzioni alle problematiche esistenti nei campi del fegato artificiale cosi’ come nella ricrescita di osso e cartilagini. All'occorrenza sara’ investigata la possibilita’ di progettare e produrre materiali polimerici multifunzionali, bioerodibili e/o biodegradabili suscettibili di stimolare la crescita di vasi sanguigni (vascolarizzazione) che possano garantire il trasporto di ossigeno e dei nutrienti necessari a mantenere la vitalita’ delle cellule assemblate su supporti in assetto tridimensionale.
Lo sviluppo del presente progetto di ricerca si propone come fine ultimo di fornire l'opportunita’ di costruire un forum di competenze interuniversitarie che rientrano a pieno titolo in progetti di ricerca cooperativi quali la Rete di Eccellenza "Novel Therapeutic Strategies for Tissue Engineering of Bone and Cartilage Using Second Generation Biomimetic Scaffolds - EXPERTISSUES" e “Nanostructured and Functional Polymer-Based Materials and Nanocomposites – NANOFUN-POLY” finanziate dalla Comunita’ Europea nel VI Programma Quadro in cui il Coordinatore del presente progetto partecipa con ruolo di “key partner” come responsabile di sottoprogetti relativi alla preparazione di formulati polimerici biodegradabili/bioerodibili.
I punti sottoriportati possono essere pertanto considerati, in sequenza temporale, come indicatori del successo del progetto derivanti da un soddisfacente raggiungimento degli obbiettivi proposti:
1. Preparazione di nuovi materiali polimerici bioattivi idonei ad essere trasformati, in situ o mediante post formulazione, in micro-nanoparticelle capaci di promuovere intrinsecamente la proliferazione cellulare in strutture tridimensionali ed incorporare agenti attivi di natura macromolecolare, in modo da permetterne il rilascio controllato e mirato. Verifica mediante relazioni interne ai mesi 6 e 12.
2. Valutazione della biocompatibilita’ in vitro mediante colture cellulari e della capacita’ intrinseca a promuovere vascolarizzazione. Verifica mediante relazioni interne ai mesi 6, 12, e 18.
3. Valutazione, sia in vitro che in vivo, dei profili cinetici di rilascio dei principi attivi di natura macromolecolare da nanoparticelle caricate utilizzando tecniche specifiche non invasive. Verifica mediante relazioni interne ai mesi 12 e 18.
4. Microfabbricazione di substrati microstrutturati a partire dai materiali polimerici preparati e valutazione della loro capacita’ di sostenere la crescita, proliferazione ed eventualmente la differenziazione di linee cellulari diverse (epatociti, condrociti, cellule staminali). Verifica mediante relazioni interne ai mesi 18 e 24.
5. Capacita’ di alcuni formulati polimerici ad inglobare epatociti nel quadro di una indagine mirata alla produzione di un bioreattore capace di esplicare funzioni epatiche primarie. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L'ingegneria tissutale si basa sull'utilizzo di cellule viventi per il recupero, il mantenimento o il miglioramento delle funzioni di tessuti e organi. L'importanza di questo settore di ricerca deriva dal fatto che in futuro l'utilizzo di tessuti ingegnerizzati potrebbe ridurre la necessita’ della sostituzione di organi cosi’ come accelerare lo sviluppo di nuovi farmaci favorendo cosi’ l'eliminazione dei trapianti di organo che e’ una pratica chirurgica estrema e con ragguardevoli costi sociali [1, 2]. In effetti, ogni anno una larga parte della spesa sanitaria dei paesi occidentali viene dirottata verso l'assistenza medica di pazienti affetti da alterazioni e scompensi a livello di organi e tessuti. In genere questi problemi vengono affrontati mediante l'uso di impianti e protesi, anche se spesso questi sistemi danno luogo a notevoli complicazioni sanitarie quali la perdita di resistenza meccanica, la degradazione fisica, l’infiammazione tissutale e la formazione di trombi. Nel caso dell'Italia, statistiche attendibili parlano di 3,5 miliardi di Euro spesi nel 2004 per l'impianto in vivo di protesi e di altri sistemi biomedici. A tal riguardo, importanti ospedali come quello di Pisa, che forniscono assistenza chirurgica di elevata specialita’ a livello di trapianti d'organo e riparazione del sistema nervoso, devono sostenere costi d'esercizio superiori a 15 milioni di euro l'anno. Altri paesi sviluppati forniscono dati ancora piu’ impressionanti; ad esempio, da una statistica recente, negli Stati Uniti sono stati spesi nel 2004 per sostituzioni ortopediche e nel 2005 per trapianti di organi e tessuti, 15 bilioni di dollari.
Allo scopo di ingegnerizzare in vitro tessuti viventi, le cellule vengono cresciute su supporti bioattivi e biodegradabili in grado di fornire informazioni fisico-chimiche tali da guidare il differenziamento e la proliferazione cellulare in tessuti tridimensionali. L'aggregazione di cellule per formare tessuti e’ un insieme altamente coordinato di eventi che richiede in termini di tempo da qualche secondo a settimane, e da un punto di vista dimensionale intervalli compresi tra 1 mm e 10 cm.
La possibilita’ di ottenere tessuti funzionali da cellule e’ il punto cruciale che deve essere sviluppato tenendo conto di fattori come la sicurezza, il costo, le leggi governative e l'approvazione sociale. L'approccio piu’ promettente dell'ingegneria tissutale propone l'impianto di tessuti assemblati in vitro a partire da cellule e supporti. I supporti sono strutture porose e degradabili preparate sia con materiali di origine naturale che con polimeri sintetici. Sebbene tali matrici possano presentare caratteristiche molto diverse, in teoria tutti i supporti utilizzati per applicazioni di ingegneria tissutale dovrebbero, dopo il loro impianto, degradare o bioerodere lentamente ed essere sostituiti da tessuto neoformato. I materiali utilizzati per questi supporti devono essere progettati in modo tale da stimolare una risposta cellulare specifica a livello molecolare. In particolare, e’ auspicabile la loro interazione con recettori cellulari come le integrine e permettere quindi alle cellule di aderire, proliferare, differenziarsi e produrre matrice extracellulare. Per raggiungere tale obiettivo e’ necessario attuare un controllo attento sia della topografia superficiale che della microstruttura chimica del materiale [3-5].
Tali sistemi dovrebbero essere in grado di stimolare una vascolarizzazione capillare suscettibile di trasportare ossigeno e nutrienti alle cellule in crescita in modo da garantire la loro vitalita’ e specifica funzionalita’. Tessuti artificiali di tipo epiteliale, connettivo e nervoso sono stati preparati a partire da linee cellulari appropriate e differenti tipi di substrati [6]. Gruppi di ricerca formati da chimici dei materiali, biologi cellulari, ingegneri e medici si sono focalizzati sullo studio dello sviluppo di bioreattori progettati per ricreare un ambiente organotipico capace di far proliferare e differenziare cellule in strutture tridimensionali. Al fine di ottimizzare il processo di adesione le cellule sono stimolate a crescere su nuovi supporti tissutali e su biomateriali prescelti. I nuovi tessuti cosi’ generati potranno essere successivamente impiantati [7].
La scelta dei biomateriali, che devono sostanzialmente sostituire la matrice extracellulare e lo stroma di tessuti e organi, rappresenta un punto chiave per il successo di una applicazione di ingegneria tissutale [8].
In qualsiasi approccio sperimentale, la biocompatibilita’ della matrice extracellulare artificiale costituisce una caratteristica di primaria importanza per i trapianti autologhi. Infatti l'utilizzo esclusivo di strutture molecolari tipiche dei tessuti ingegnerizzari puo’ evitare una risposta immunitaria da parte dell'organismo ospite. A tal proposito biomatrici e supporti in grado di sostenere uno sviluppo cellulare ottimale sono necessari per lo sviluppo ed il differenziamento in vitro di specifici fenotipi cellulari. Negli ultimi cinquanta anni sono stati messi a punto diversi metodi per l'isolamento di cellule da tessuti animali e umani [9]. Attualmente, la moltiplicazione di cellule viene ottenuta in condizioni statiche in piastra da coltura in presenza di terreni contenenti fattori di crescita, siero fetale bovino o siero autologo dei pazienti. In queste condizioni sperimentali si puo’ osservare la tendenza delle cellule a proliferare, ma allo stesso tempo, anche la perdita delle caratteristiche fenotipiche cellulari [10, 11].
Ad esempio, condrociti primari isolati e mantenuti in coltura statica tendono a perdere la capacita’ di produrre cartilagine e acquistano un fenotipo mesenchimale. In coltura, le cellule parenchimali epatiche perdono la loro tipica polarizzazione e di conseguenza il loro ruolo nella detossificazione e’ fortemente limitato. Analogamente le cellule tubulari prossimali dei reni perdono i bordi ciliati e riducono la capacita’ di trasporto [10] cosi’ come le cellule tubulari perdono la loro tipica polarita’ e funzionalita’ [12].
Queste caratteristiche sono fondamentali non solo per i tessuti embrionali ma anche per i tessuti adulti e per la generazione di vasi sanguigni, stroma e parenchima funzionale [13].
La possibilita’ di realizzare bioreattori in grado di mimare tutti gli aspetti strutturali, morfologici e funzionali degli organismi viventi e dei tessuti rappresenta una sfida futura della complessa tecnologia dell'ingegneria tissutale. A tal proposito, la competenza di chimici organici polimeristi, unitamente a quella di biologi cellulari e tecnologhi farmaceutici, acquisita negli anni con la progettazione, sintesi e caratterizzazione di nuovi materiali polimerici specifici per applicazioni biomediche, offre un grande potenziale per affrontare gli aspetti della tecnologia emergente dell'ingegneria tissutale, proponendosi di trovare adeguate soluzioni. In particolare nuovi materiali polimerici bioattivi/biocompatibili saranno impiegati per la preparazione di:
1) micro-nanostrutture sotto forma di particelle o sfere in grado di funzionare come vettori per il rilascio mirato e controllato di agenti bioattivi (fattori di crescita, proteine, peptidi, polinucleoditi, ormoni, antibiotici e nutrienti cellulari convenzionali). [14]
2) Architetture macromolecolari micro-nanostrutturate da utilizzare come supporti morfogenetici in grado di garantire una proliferazione cellulare adeguata, il mantenimento del patrimonio fenotipico di cellule autologhe e la capacita’ di vascolarizzazione capillare indispensabile al mantenimento della vitalita’ e funzionalita’ cellulare [15].
Ambedue i punti indicati rappresentano gli aspetti di interesse del programma di ricerca che si intende sviluppare nella presente proposta. La tecnologia del rilascio controllato di principi attivi e’ stata oggetto di studio per molti anni ed ha trovato applicazioni sia nel campo terapeutico che in quello agroindustriale [16-21]. E' quindi ragionevole pensare che questa tecnologia possa fornire un valido supporto per lo sviluppo dell'ingegneria tissutale.
Agenti bioattivi rilasciati in siti specifici di organi o tessuti possono determinare la sopravvivenza e la funzionalita’ di cellule danneggiate o fornire segnali in grado di promuovere una proliferazione e migrazione cellulare regioselettiva. Ad esempio, il rilascio controllato del Fattore di Crescita Neurale (NGF) previene la degenerazione dei neuroni colinergici del cervello [22, 23]. Analogamente l'immissione sostenuta del Fattore di Crescita Epiteliale (EGF) si e’ rivelata in grado di stimolare la proliferazione dei precursori neuronali nel cervello di animali adulti, indicando cosi’ che un rilascio controllato di EGF puo’ portare alla generazione di nuovi neuroni nel cervello adulto [24].
I fattori di crescita sono una classe di agenti che potrebbero essere rilasciati in modo produttivo nei nuovi tessuti in sviluppo. Sono stati descritti diversi tipi di fattori di crescita e l'attivita’ di molti di questi e’ stata testata sull'uomo. Tuttavia altre classi di agenti bioattivi potrebbero essere buoni candidati per il rilascio controllato nell'ingegneria tissutale [25, 26]. Tra questi si possono citare i fattori in grado di potenziare la risposta immunitaria o di modificare in modo regioselettivo l'espressione genica. I fattori di trascrizione che si legano a specifiche sequenze di DNA identificate come "amplificatori", modulando cosi’ l'espressione genica, costituiscono un'altra classe di sostanze per le quali e’ auspicabile un rilascio controllato e/o mirato. Infatti, i fattori di trascrizione sono responsabili del controllo dell'espressione genica che caratterizza lo stato differenziato delle cellule e quindi rappresentano un fattore di controllo fondamentale nella fase di sviluppo di un nuovo tessuto.
Alla luce delle problematiche e delle necessita’ descritte che si riscontrano nello sviluppo della tecnologia dell'ingegneria tissutale, l'attivita’ sinergica di chimici dei polimeri, ingegneri, medici, biologi e farmacologi risulta di primaria importanza per lo sviluppo di un programma di ricerca focalizzato alla preparazione di nuovi sistemi polimerici nano e microstrutturati mirati alla progettazione e preparazione di organi bioartificiali.
Il gruppo di ricerca impegnato nell’attivita’ di ricerca presentata in questa proposta e’ costituito da cinque unita’ di ricerca appartenenti a cinque diverse universita’ italiane. I gruppi in oggetto sono stati gia’ coinvolti in precedenti progetti di ricerca funanziati dal MIUR e vantano una consolidata e proficua propensione allo svolgimento di attivita’ di ricerca integrate. Il presente progetto puo’ essere considerato il naturale avanzamento delle attività intraprese nel settore, in grado di validarne i risultati gia’ intrapresa e ripagare l’impegno in potenziale umano e di risorse economiche investite dal MIUR, dalle istituzioni affiliate e dalla Comunita Europea.
I risultati raggiunti hanno fornito una visibilita’ a livello sia nazionale che internazionale ed hanno contribuito all'acquisizione di un ruolo chiave per la partecipazione ed il successo delle Reti di Eccellenza focalizzate sull'Ingegneria Tissutale Expertissue "Novel Therapeutic Strategies for Tissue Engineering of Bone and Cartilage using Second Generation Biomimetic Scaffolds" e sulla Produzione di Sistemi Polimerici Nanostrutturati Nanofun-poly “Nanostructured and Functional Polymer-Based Materials and Nanocomposites” che sono state finanziate dalla Commissione Europea con riconoscimento di progetti altamente meritevoli "top rank".
La presente proposta di ricerca puo’ pertanto profittare di una piattaforma di conoscenze di alto livello con amplificazione delle possibilita’ di successo del progetto stesso ed integrazione delle competenze in uno scenario altamente competitivo e di notevole valenza per la formazione di giovani ricercatori coinvolti nel progetto.
E' pertanto estremamente raccomandabile che questa proposta venga valutata positivamente ed ammessa al finanziamento da parte del MIUR onde offrire i mezzi e gli strumenti di minima necessari per il potenziamento e l'avanzamento delle conoscenze in un settore di ricerca di frontiera di notevole impatto non solo socio-economico, ma anche geopolitico [27, 28]. La creazione e sostentamento di una "task-force" tecnico-scientifica di valenza europea in settori di ricerca di avanguardia previste nelle Piattaforme Tematiche del 7PQ dalla Comunità Europea non è più un'opzione ma una necessità!
Una serie di recenti riferimenti bibliografici relativi al lavoro svolto dai gruppi di ricerca coinvolti nella proposta di progetto sono riportate a garanzia del coinvolgimento di tutti i partner in argomenti di ricerca di interesse specifico della presente proposta. <<<