RICERCA ITALIANA     

Le cistatine nelle patologie neurodegenerative. Basi molecolari e modelli sperimentali

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

La famiglia delle cistatine comprende numerosi peptidi che agiscono come inibitori delle proteasi a cisteina. Tali proteine sono state studiate dal punto di vista biochimico, sono state cristallizzate e caratterizzate nella loro attività enzimatica. La massa di informazioni accumulata presenta elementi contraddittori che suggeriscono l'esistenza di funzioni addizionali, diverse dall'attività di antiproteasi. In particolare, il coinvolgimento della cistatina C in una patologia neurodegenerativa e la presenza delle cistatine A, B o C nelle placche amiloidi di alcune patologie suggeriscono che questa famiglia proteica ha un ruolo nell'insorgenza e/o nella progressione dei processi neurodegenerativi. Lo scopo di questo progetto è lo studio del possibile intervento delle cistatine nelle patologie neurodegenerative caratterizzate dalla presenza di depositi amiloidi. La linea sperimentale proposta prevede i seguenti punti:
1. l'analisi comparativa dell'espressione delle cistatine A, B e C in linee cellulari diverse e in colture primarie di cellule neuronali.
2. l'identificazione e la caratterizzazione degli interattori proteici delle tre cistatine. Le proteine saranno isolate mediante immunoprecipitazione e studiate tramite spettrometria di massa. I siti d'interazione tra le cistatine e i loro interattori saranno analizzati studiando mutanti simili a quelli naturali dei pazienti affetti da patologie con deficit o accumulo di cistatine, e mutanti costruiti in laboratorio. E' interessante chiarire se diversi membri della famiglia delle cistatine sono coespressi nello stesso tipo cellulare e quali siano le loro relazioni funzionali. Vogliamo anche stabilire se le tre cistatine interagiscono con le stesse o con diverse proteine e caratterizzarle.
3. il chiarimento dell'organizzazione funzionale delle cistatine nelle cellule di diverse linee cellulari e in colture primarie di neuroni.
5. lo studio comparativo dell'iperespressione delle cistatine A e C in cellule cistatina B meno ottenute da topi knock-out. Analizzeremo anche l'espressione e la localizzazione cellulare delle cistatine per correlarle ai profili d'espressione dei loro interattori.
6. lo studio del ruolo delle cistatine in modelli in vitro di neurodegenerazione causata da agenti neurotossici. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Gabriella Tocco Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Nell'ambito dei nostri studi sulla cistatina B in relazione all'epilessia mioclonica di tipo 1 (EPM1), abbiamo trovato numerose evidenze di funzioni della cistatina, diverse dall'inibizione delle proteasi (19). Riteniamo di grande interesse il fatto che le proteine della famiglia delle cistatine sembrano implicate nelle malattie neurodegenerative. Proponiamo perciò di analizzare quali funzioni delle cistatine possano correlarsi con i fenomeni neurodegenerativi.
Scopo del progetto è:
1. l'analisi comparativa dell'espressione delle cistatine A, B e C in linee cellulari in coltura e in colture primarie di cellule neurali;
2. l'identificazione e la caratterizzazione dei possibili partner delle tre cistatine;
3. il chiarimento della loro organizzazione e funzione cellulare;
4. lo studio comparativo degli effetti dell'espressione e della iperespressione delle cistatine in modelli cellulari di processi di degenerazione neurale; particolare attenzione sarà rivolta a un modello di ALS, rappresentato da linee di neuroblastoma umano con sovraespressione dell’enzima SOD1 mutato;
5. lo studio comparativo della iperespressione di cistatine in cellule cistatina B meno ricavate da topi knock-out.
La famiglia delle cistatine, che raccoglie numerose proteine che inibiscono le proteasi a cisteina della superfamiglia delle catepsine, è molto conservata dall'uomo a Drosophila, C. elegans e alla sanguisuga (5, 33, 35, 40, 54, 67). Sebbene la funzione antiproteasica sia riconosciuta, emerge con sempre maggior evidenza che questa non è la sola funzione delle cistatine. L'indicazione si ricava principalmente dal coinvolgimento delle cistatine in diverse malattie. Infatti è stata descritta la presenza di cistatine nelle placche amiloidi di pazienti affetti da neurodegenerazione. D'altronde, ora siamo consapevoli che molte malattie sono originate da mutazioni che alterano la stabilità conformazionale delle proteine (36, 45). L'alterata stabilità può causare la denaturazione della proteina colpita e il suo coinvolgimento in legami intermolecolari che producono aggregati intracellulari dannosi. E' noto che l'aggregazione di proteine con conformazione modificata è una caratteristica di molte malattie neurodegenerative, tra cui le encefalopatie di tipo spongiforme (11). Nelle placche senili associate al morbo di Alzheimer e Parkinson e nelle placche dei pazienti affetti da demenza senile, le cistatine A e B sono spesso presenti e abbondanti e potrebbero avere una struttura amiloide. Tali osservazioni sono coerenti con gli studi sulle cistatine di Staniforth et al. (61). Questi autori hanno usato come modello di amiloidogenesi le cistatine A e C umane e la cistatina di pollo e hanno dimostrato che in vitro, a concentrazioni fisiologiche, queste proteine scambiano domini formando dimeri, tetrameri e ottameri molto stabili. La modificazione conformazionale della cistatine ne consente l'assemblaggio in fibrille (11). Una patologia correlata alle mutazioni per perdita di funzione del gene della cistatina B è l'Epilessia Mioclonica Progressiva del tipo Unverricht-Lundborg (EPM1), una malattia neurodegenerativa ereditaria a progressione devastante, che colpisce a partire dai 6-15 anni. Il fenotipo EPM1 è generalmente attribuito all'apoptosi dei neuroni scatenata dalle catepsine in assenza dell'inibitore cistatina B. Usando la tecnica del doppio ibrido di lievito abbiamo recentemente isolato diverse proteine che legano specificamente la cistatina B e non sono proteasi (19). Sono proteine citoplasmatiche e coinvolte nella regolazione delle funzioni del citoscheletro (19). Almeno due di queste sono espresse soltanto nelle cellule del sistema nervoso, principalmente nei neuroni. La beta-spettrina cerebrale è una proteina citoscheletrica che appartiene alla superfamiglia delle spettrine (74) e NF-L (27) è un elemento strutturale che appartiene alla famiglia dei filamenti intermedi. Un'altra proteina identificata mediante il sistema del doppio ibrido è il recettore RACK-1 che media l'interazione tra membrana cellulare e Proteina Kinasi C (PKC) attivandola (60). Abbiamo inoltre dimostrato che, nel cervelletto di ratto e in diverse linee cellulari, la cistatina B interagisce con le stesse proteine formando un complesso che comprende anche altre proteine citoscheletriche (19; Elena Cipollini e Marialuisa Melli, risultati non pubblicati). Poiché è ormai chiaro che la maggioranza delle proteine non agisce isolatamente, ma è assemblata in complessi che svolgono funzioni specifiche, riteniamo che la cistatina B sia parte di un complesso multiproteico a funzione ancora sconosciuta (19, 26). In conclusione, proponiamo:
1 L' analisi delle basi molecolari della funzione della cistatina B in cellule neuronali, e l'identificazione e caratterizzazione dei possibili partner coinvolti nella formazione del complesso.
2 L’analisi della interazione tra le proteine che sarà studiata avvalendosi sia dei mutanti naturali derivati da pazienti di EPM1, sia di mutanti generati in laboratorio. Analisi simili saranno parallelamente svolte sulle cistatine A e C, entrambe implicate in diversi tipi di neurodegenerazione. Infatti, non sappiamo ancora se membri diversi della famiglia siano coespressi nello stesso tipo cellulare né quale possa essere la loro relazione funzionale.
3 Lo studio del ruolo delle cistatine in modelli in vitro di neurodegenerazione causata da diverse sostanze tossiche e in un modello sperimentale di ALS, costituito da linee di neuroblastoma umano con sovraespressione di forme mutate della SOD1 . <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La famiglia delle cistatine include peptidi ubiquitari che inibiscono le proteasi a cisteina della famiglia delle catepsine (5, 33, 35, 54, 67). Le cistatine, filogeneticamente molto conservate, derivano da un unico peptide ancestrale (10), sono in genere acide e contengono 4 residui di cisteina che formano legami disolfuro. La struttura cristallina della cistatina B umana legata alla papaina è stata descritta da Stubb et al. (63). Strutturalmente le cistatina B presenta un foglietto beta a cinque tratti avvolto attorno ad un'alfa elica con cinque avvolgimenti e da una coda carbossiterminale sul lato convesso del foglietto beta. Gli elementi strutturali evolutivamente conservati sono le anse A e B, la sequenza PW (loop II) e la sequenza QVVAG (consenso QxVxG, loop I). Quest'ultima e la glicina in posizione 4 rappresentano il sito catalitico col quale la cistatina B lega la catepsina e inibisce la proteolisi (35, 63). Tuttavia la sostituzione di singoli aminoacidi della sequenza QVVAG o la delezione dei 4 aminoacidi aminoterminali non cambia i valori di Ki della interazione, suggerendo che la notevole conservazione evolutiva di questi domini sia in relazione a un ruolo della cistatina diverso dalla attività antiproteasica, ma altrettanto rilevante (22, 48, 53). Cio' pone il problema della natura di tale funzione.
Iperespressione delle Cistatine e Patologia.
Alti livelli di cistatine sono presenti in diversi tumori maligni, ma il significato non è chiaro. Una relazione potrebbe essere proposta se le cistatine fossero coinvolte nella crescita cellulare. L'aumento dei livelli di cistatina A e B è stato proposto come marcatore prognostico positivo del carcinoma a cellule squamose del collo e della testa (62). Zhang et al. (78) hanno descritto un aumento di 6 volte della cistatina B nel glioblastoma multiforme rispetto al tessuto nervoso normale e propongono la cistatina B come marcatore prognostico negativo e funzionale (resistenza multipla ai farmaci, invasività) di questo tumore. Peraltro, livelli elevati di inibitori extracellulari di proteasi a cisteina nei pazienti di carcinoma colorettale sono uno indice prognostico negativo (37). Nell'insieme, questi dati suggeriscono un ruolo delle cistatine nella progressione dei tumori. Un altro ruolo della cistatina B, indipendente dalla sua attività di inibizione, è l'attivazione del rilascio di biossido d'azoto da parte di macrofagi attivati da interferone-gamma, proporzionale alla concentrazione di cistatina B nel terreno. La saturazione del sito catalitico della cistatina B con la papaina non interferisce con l’attivazione ora descritta, dimostrando che il sito catalitico della cistatina B non interviene in questa risposta fisiologica (69). Lefebvre et al. (40) hanno dimostrato che la cistatina B è coinvolta anche nella risposta immunitaria innata ai batteri da parte della sanguisuga Theromyzon tessulatum, nella quale, la cistatina B, tra altre proteine, si dereprime in seguito all'infezione. Le cistatine sono state chiamate in causa in numerose malattie. La cistatina C, in particolare, si trova in tutti i tessuti e fluidi dei mammiferi e riveste numerosi ruoli, e.g. assorbimento osseo, inibizione dell'attività delle proteasi a cisteina extracellulari, modulazione della risposta infiammatoria (9, 41, 70) fino a proliferazione dei fibroblasti e delle cellule mesangliali glomerulari (64, 66). La sua funzione nel cervello non è chiara, sebbene la modulazione dell'attivazione e degradazione dei neuropeptidi (3), la crescita neuritica e la protezione e la sopravvivenza dei neuroni (30, 39) siano state associate nel sistema nervoso centrale con altre attività antiproteasiche. E' stato dimostrato che gli inibitori, specifici e non, delle proteasi svolgono un'azione protettiva nell'ischemia cerebrale (30, 55). Sembra inoltre che la cistatina C intervenga sull'attività mitogenica del FGF basico su cellule staminali neurali (65).

Mutanti delle cistatine e patologia.
Una variante della cistatina C è il maggior componente dei depositi amiloidi nel cervello dei pazienti di angiopatia amiloide ereditaria da cistatinaC (49). Nell’amiloidosi "islandese" si trova spesso la sostituzione L68Q (42). Indicazioni sul meccanismo di aggregazione amiloide (2) vennero dalla scoperta che le cistatine umane C (21), A (34) e B (76), in condizioni pre-denaturanti tendono a formare dimeri inattivi. Inoltre la variante L68Q della cistatina C in parte dimerizza già a condizioni fisiologiche (61). Nelle placche dei pazienti con morbo di Alzheimer (AD) e di Parkinson, e dei pazienti di demenza senile si trovano spesso elevate quantità delle cistatine A e B, suggerendole come componenti amiloidi. Catepsine e cistatine si trovano entrambe associate alle placche senili, ai depositi amiloidi cerebrovascolari e ai “tangles” neurofibrillari dell'AD (7,12) e un evento precoce nei neuroni "a rischio" dei pazienti di AD è la alterazione del sistema lisosomale (8, 14), pur non essendo chiaro il rapporto tra meccanismi proteolitici e insorgenza e/o successivo decorso della malattia. Sarebbe interessante sapere come queste molecole siano strutturate nel contesto delle placche amiloidi e se vi si trovino sotto forma di polimeri. Un'altra famiglia di inibitori delle proteasi, le serpine, è caratterizzata da una transizione conformazionale che porta alla polimerizzazione, che può provocare serpinopatie simili alle amiloidosi, alle encefalopatie prioniche e ai morbi di Hungtinton e di Alzheimer (45). In questo ambito, si consideri che Staniforth et al. (61) hanno usato le cistatine umane A e C e la cistatina di pollo come modelli per studiare l'amiloidogenesi, dimostrando che a concentrazioni fisiologiche si formano dimeri stabili mediante lo scambio di un dominio; l'ansa I rompe i suoi legami non covalenti col resto della molecola e interagisce ad alta affinità con la stessa porzione di una seconda molecola (20, 58, 75). La transizione a dimero richiede il cambiamento di conformazione a causa dell'idrofobicità delle superfici che interagiscono. Lo svolgimento parziale della cistatina permette la conversione a forme alternative e l'associazione in fibrille (11). Nel mutante I66Q, equivalente nel pollo alla variante L68Q della cistatina C umana (agente causale di una malattia amiloide) si osserva dimerizzazione spontanea (1). La dimerizzazione è inibita da due mutazioni che sostituiscono i residui idrofobici vicini alla superficie d'interazione con residui carichi. La cistatina che contiene le sostituzioni V55D (nell'ansa I) o I102K (nell'adiacente ansa II) resta monomerica. L'ansa I non è indispensabile per l'attività antiproteasica delle cistatine, ma è essenziale per la dimerizzazione. Se la polimerizzazione delle cistatine avviene in vivo, l'ansa I può essere importante per funzioni diverse dall'attività d'inibizione delle proteasi.

Assenza di cistatina B e EPM1.
L'Epilessia Mioclonica Progressiva del tipo Unverricht-Lundborg (EPM1) é correlata alle mutazioni per perdita di funzione del gene della cistatina B, di cui sono state descritte diverse mutazioni. Lalioti et al. (38) hanno identificato una trasversione G/C nell'esone 1 con sostituzione gly4arg. Pennacchio et al. (50) hanno descritto una trasversione G/C nell'ultimo nucleotide dell'introne 1. Altra mutazione trovata dagli stessi autori è il cambiamento CGA/TGA, con arresto della traduzione alla posizione amminoacidica 68. Alakurtti et al. (4) hanno descritto una mutazione Gln71Pro che, non permette l'associazione ai lisosomi. Tra tutti i mutanti naturali descritti solo la sostituzione in posizione 4 altera il sito catalitico della molecola. Pennacchio et al. (51) hanno dimostrato che il knock-out del gene per la cistatina B nel topo genera un quadro neurologico con sintomi molto simili a quelli dei pazienti EPM1, fornendo così un modello animale di questa malattia, la cui base molecolare non è ancora chiara. Il fenotipo EPM1 è generalmente attribuito all'apoptosi innescata dalle catepsine in assenza del loro inibitore cistatina B. Houseweart et al. (32) hanno vagliato la possibilità che le catepsine attivino segnali proapoptotici con la via di segnalazione mediata da BID. Essi hanno incrociato topi cistatina B- con topi BID-, dimostrando che le catepsine promuovono l'apoptosi in assenza di BID e concludendo che la catepsina induce apoptosi attraverso una via di segnalazione indipendente da BID. Houseweart et al.(31) hanno anche studiato gli effetti della cistatina/catepsina sul fenotipo EPM1. Essi hanno incrociato topi cystB meno con topi catepsina B, L, ed S meno. La rimozione delle catepsine S e L dal contesto cistatina B meno non migliora i fenotipi EPM1-simili dei topi e la rimozione del gene della catepsina B consente un ripristino solo parziale del fenotipo. Questi risultati suggeriscono che l'apoptosi osservata nei topi cistatina B meno non è dovuta all'attività antiproteasi della cistatina B e che, oltre alla catepsina B, esistano altre molecole responsabili della patologia.

Ruoli Alternativi delle Cistatine.
In questo ambito concettuale, abbiamo cercato interattori della cistatina B mediante la tecnica del doppio ibrido di lievito e isolato diverse proteine che legano la cistatina B e non sono proteasi, ma proteine citoplasmatiche coinvolte nella regolazione di funzioni citoscheletriche (19). Almeno due di esse sono espresse esclusivamente nel SN. La beta spettrina cerebrale (74), appartenente alla superfamiglia delle spettrine è legata alla membrana cellulare dei neuroni tramite un'anchirina. NF-L appartiene alla famiglia dei filamenti intermedi, con un ruolo nella determinazione della citoarchitettura e della citodinamica (27, 56). Un'altra proteina identificata con la tecnica del doppio ibrido è il recettore RACK-1 che attiva alcune isoforme della PKC e media l'interazione tra kinasi attivata e membrana cellulare (60). RACK-1 interagisce anche col dominio citoplasmatico della subunità beta dell'integrina, intervenendo nell'interazione tra membrana plasmatica e citoscheletro (43) ed è abbondante nella proliferazione e differenziamento cellulari. L'interazione tra cistatina B e NF-L, beta spettrina e RACK-1 è stata confermata da esperimenti di coimmunoprecipitazione di estratti proteici di cervelletto di ratto. La dimensione delle proteine che interagiscono con la cistatina B va da circa 30 a più di 200 Kd e la cistatina B è una piccola proteina di circa 12 Kd. Sembra perciò improbabile che tutte queste proteine interagiscano in modo diretto con la cistatina B contemporaneamente, a meno che la cistatina B non si trovi in forma dimerica o polimerica (77). Nel cervelletto di ratto queste proteine sono localizzate, sia durante lo sviluppo che nell'animale adulto nelle cellule del Purkinje e nella glia di Bergmann. Il complesso multi proteico che abbiamo identificato contiene almeno le quattro proteine sopra descritte, ma può contenere anche altri peptidi che interagiscono direttemente o indirettamente con la cistatina B. Recentemente Gavin et al. (26) hanno dimostrato che in molte funzioni cellulari la grande maggioranza delle proteine non agisce singolarmente, ma è associata in complessi che definiscono funzioni specifiche. Analogamente nel cervelletto la cistatina B può esser parte di un complesso specifico a funzione sconosciuta (19). Da quanto discusso è chiaro che un eccesso o carenza di cistatina può alterare funzioni cellulari, suggerendo almeno un altro ruolo della cistatina diverso dall'inibizione delle proteasi e il possibile coinvolgimento in patologie neurodegenerative. Su questa base, ci sembra importante lo studio delle basi molecolari e cellulari della funzione delle cistatine nei processi neurodegenerativi.

Sclerosi laterale amiotrofica: esempio di malattia neurodegenerativa
La Sclerosi Laterale Amiotrofica (ALS) é una patologia neurodegenerativa molto grave, che colpisce i motoneuroni corticali, bulbari e spinali, con conseguente paralisi progressiva e morte dovuta a blocco respiratorio (6). Malgrado la malattia sia nota dal 1874, ne rimane ancora oscura la patogenesi. La malattia si manifesta con una forma sporadica (SALS) e una forma familiare (FALS), che rappresenta il 10% dei casi. I sintomi sono sostanzialmente simili nei due casi, con un inizio più precoce nella FALS. Da quest’ultima sono venute alcune indicazioni sulle possibili basi molecolari del processo neurodegenerativo, poichè mutazioni dell’enzima antiossidante SOD1 sono stati descritti nel 20% dei casi di FALS (57). Il ruolo di queste mutazioni nella ridotta sopravvivenza dei neuroni non é ancora chiara, tuttavia queste osservazioni hanno offerto l’opportunità di sviluppare sistemi sperimentali per chiarire le basi molecolari del processo neurodegenerativo. Nell’ALS é stata descritta una alterata organizzazione dei neurofilamenti (16), accumulo di neurofilamenti e mutazioni della subunità pesante (18). Infine topi transgenici con sovraespressione di NF normali o mutati presentano un fenotipo di malattia dei motoneuroni (17, 73). D’altro canto topi transgenici che esprimono Una SOD1 umana mutata presentano degenerazione di motoneuroni (28). Interessante notare che enzimi mutanti tendono a formare aggregati insolubili (68).
La tendenza di mutanti sia della SOD1 che della cistatina a formare aggregati é di notevole interesse. Partendo da queste considerazioni linee cellulari e topi transgenici che esprimono SOD1 mutate appaiono come possibili sistemi modello per analizzare una possibile cooperazione tra le due proteine, in grado di alterare la sopravvivenza dei neuroni. Infine é noto che la calpaina é tra le proteasi inibite dalla cistatina, e a sua volta interagisce con la calcineurina (44), che defosforila la proteina Tau; è anche noto che la calcineurina é diminuita in modelli di ALS (24)

Modelli Sperimentali e Sistemi in vitro
Lo studio del possibile ruolo delle cistatine nelle malattie neurodegenerative è reso molto difficile dalla varietà delle popolazioni neuronali coinvolte e dalla complessità organizzativa del sistema nervoso. Già nel 1907 Harrison (29) ideò un semplice procedimento per dimostrare la genesi delle fibre nervose. Più recentemente sono state messe a punto condizioni per il mantenimento in coltura di neuroni e cellule gliali sia primarie che stabili (23). Esistono anche procedimenti che permettono l'immortalizzazione delle cellule con tecniche di trasduzione di oncogeni (15) o di ibridazione somatica (52). In questo programma noi proponiamo di studiare le cistatine in sistemi modello di processi neurodegenerativi ottenuti trattando colture neuronali primarie o stabilizzate con sostanze tossiche di vario tipo che inducono alcune delle alterazioni tipiche dei processi neurodegenerativi, come descritto nella sezione successiva. Colture di neuroni mesencefalici, ottenuti da ratti trattati con 6OHDA, sono utilizzate come modelli di degenerazione dopaminergica del Parkinson (72). Un altro modello in vitro per lo studio della neurotossicità della proteina beta amiloide è stato ottenuto trattando col peptide beta amiloide colture di neuroni di ippocampo di ratto (25,46). Inoltre, modelli animali e colture cellulari sono stati usati per studiare il meccanismo di neurotossicità associato al diabete e all'uso in chemioterapia di derivati del platino, che producono neuropatie periferiche. Modelli simili sono usati anche per studiare la possibile attività neuroprotettiva di vari farmaci (47,59). Per quanto riguarda il diabete è interessante ricordare che Watanabe et al. (71) hanno dimostrato che le cellule beta delle isole del pancreas di ratto esprimono cistatina B. Infine un sistema di notevole interesse é costituito da una linea di neuroblastoma umano, SH-SY5Y, trasfettata con SOD1 normale e mutata, che sono state usate come modello sperimentale per l’ALS (13). <<<