RICERCA ITALIANA     

Struttura e biogenesi di proteine di trasporto dei mitocondri

Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"

Abstract

Il presente progetto di ricerca è inteso a studiare la struttura, le relazioni struttura-funzione e la biogenesi dei carrier mitocondriali. Mediante una stretta collaborazione di 3 unità di ricerca con specifiche competenze, questo progetto utilizzerà una combinazione di tecniche biochimiche e biofisiche mirate a definire le caratteristiche strutturali-dinamiche-funzionali, nonchè a definire i meccanismi di import nei mitocondri, dei trasportatori mitocondriali e in particolare del carrier del chetoglutarato (OGC) e del citrato ( CIC) .
L’unità di Bari mutagenizzerà amminoacidi singoli di carrier mitocondriali come l’OGC allo scopo di identificare i residui che sono essenziali per l’attività di trasporto, preparerà inoltre plasmidi e mutanti (singoli-Cys, doppi-Cys, mutanti contenenti un triptofano e una cisteina) che saranno messi a disposizione delle altre unità partecipanti a questo progetto per studi spettroscopici e di biogenesi. Tutti i mutanti saranno espressi in E. coli, purificati, incorporati in liposomi ed analizzati per l’attività di trasporto. I mutanti singoli-Cys ricostituiti nei liposomi saranno saggiati per loro sensibilità a reagenti SH permeabili e impermeabili, in presenza o assenza di substrati o inibitori. Inoltre, sarà misurato il legame di [14C]N-etilmaleimide ai mutanti in presenza o assenza di altri reagenti SH, substrati o inibitori. L’unità di Roma effettuerà misure di EPR del nitrossido legato selettivamente ad una singola cisteina introdotta con mutagenesi sito-diretta nel C-less OGC, in presenza ed in assenza di “perturbanti” paramagnetici idrofobici o idrofilici. Tutti i mutanti singoli-Cys dei domini transmembrana saranno studiati tramite EPR per identificare la struttura secondaria di ciascun dominio. I mutanti doppi-Cys saranno utilizzati dall’unità di Roma per incorporare sonde fluorescenti contenenti un gruppo di pirene a livello delle due cisteine e studiare la loro capacità di formare dimeri (eccimeri). Saranno inoltre effettuati esperimenti di fluorescenza di carriers aventi un singolo triptofano e di trasferimento di energia tra un triptofano ed un pirene introdotto in una specifica posizione della proteina per valutare la distanza tra vari residui presenti nella proteina. Simulazioni di dinamica molecolare verranno inoltre effettuate per meglio interpretare I dati sperimentali e per individuare le zone di maggior flessibilità al fine di formulare ipotesi sul meccanismo di trasporto. L’unità di Lecce studierà la biogenesi dei carrier mitocondriali, in particolare i segnali di targeting e di sorting anche mediante l’uso di mutanti. L’unità valuterà inoltre l’importanza della presequenza e di possibili fattori addizionali nel modulare la solubilità dei carriers. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giuseppe Rotilio Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata"

Obiettivo del Programma di Ricerca

La struttura secondaria e terziaria dei carrier mitocondriali, è solo parzialmente definita e di conseguenza, il livello di comprensione a livello molecolare del loro meccanismo di funzionamento è molto scarso, a dispetto dell’importante ruolo svolto da questa classe di proteine. Anche il processo di “import” dei carrier mitocondriali dal citoplasma ai mitocondri (biogenesi) è poco noto.
L’obiettivo di questo progetto di ricerca è di acquisire informazioni strutturali sui carrier mitocondriali, in particolare sui loro domini transmembrana, studiare alcune importanti relazioni struttura-funzione e chiarire il processo di biogenesi dei carrier mitocondriali. Si perseguirà questo obiettivo tramite una stretta collaborazione tra tre unità di ricerca, dislocate in diverse università italiane, che hanno specifiche competenze ed hanno già collaborato tra loro. I risultati finora ottenuti da queste unità rappresentano il punto di partenza delle attività di ricerca del presente progetto, i cui scopi dettagliati per i prossimi 2 anni sono:
- identificazione degli amminoacidi strutturalmente e funzionalmente importanti nei trasportatori mitocondriali, in particolare nel carrier del chetoglutarato (OGC);
- localizzazione degli amminoacidi importanti dei trasportatori mitocondriali in relazione alla parte idrofobica della membrana, al percorso o via (idrofilica) di traslocazione del substrato (canale) tra i domini transmembrana, e al sito di legame di substrati o inibitori;
- determinazione della struttura dei domini transmembrana dei carrier mitocondriali,;
- misura delle distanze fra i vari domini transmembrana nei monomeri o nei dimeri dei trasportatori mitocondriali e in particolare dell’OGC; ;
- costruzione di modelli strutturali di membri della famiglia dei carrier mitocondriali mediante procedure di "homology modeling";
- identificazioni di regioni flessibili e di aminoacidi perno tramite simulazioni di dinamica molecolare
- identificazione del ruolo della presequenza dei carrier mitocondriali nel processo di trasferimento degli stessi dal citoplasma ai mitocondri (import);
- identificazione dei requisiti strutturali per la biogenesi (import) dei trasportatori mitocondriali
- importanza della presequenza nel determinare la solubilità dei trasportatori mitocondriali. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Più di un quinto di tutte le proteine sono proteine transmembrana, che attraversano varie volte la membrana con la loro catena polipeptidica. Le proteine transmembrana sono responsabili di molte importanti funzioni, tra le quali quelle di trasportare molecole verso l'interno e l'esterno di cellule o organuli cellulari. Nonostante la loro importanza, solo in pochissimi casi è nota la loro struttura ad alta risoluzione e di conseguenza, la comprensione a livello molecolare del loro meccanismo è molto scarsa. Questa situazione dipende dal fatto che le proteine di membrana in genere, e le proteine di trasporto in particolare, sono molto difficilmente cristallizzabili e caratterizzabili strutturalmente, a causa della loro idrofobicità e in molti casi della loro natura metastabile. La completa caratterizzazione di proteine di membrana è uno dei principali obiettivi della biologia della prossima decade e richiede uno sforzo comune che unisca insieme conoscenze diverse come il clonaggio, la purificazione,la ricostituzione, l’ applicazione di tecniche spettroscopiche e la modellazione computazionale.


I trasportatori o carrier mitocondriali (CM) sono una famiglia di proteine di membrana che sono localizzate, con qualche eccezione, nella membrana interna dei mitocondri (1). La loro comune funzione è quella di collegare il citoplasma e i mitocondri catalizzando il passaggio di un gran numero di soluti attraverso la membrana mitocondriale. Questo legame è indispensabile, perché molti processi fisiologici richiedono la partecipazione di reazioni enzimatiche sia intra che extramitocondriali. I substrati trasportati dai carrier mitocondriali (CM) variano molto per struttura e per grandezza, dal più piccolo, il H+, a più grandi e caratterizzate dalla presenza di più cariche come l'ATP. La maggioranza dei substrati sono anioni, ma alcuni sono cationi o zwittezioni. Alcuni carrier sono presenti in quasi tutti i tessuti, mentre altri sono tessuto-specifici e hanno una limitata distribuzione, in rapporto alla loro importanza in particolari funzioni. I CM sono proteine codificate dal DNA nucleare e devono essere trasferite dal citoplasma nella membrana interna dei mitocondri mediante un processo che è ancora in gran parte sconosciuto.
Tutti i CM di funzione nota hanno una caratteristica struttura primaria; contengono 3 domini omologhi ripetuti di circa 100 amminoacidi, e ogni dominio contiene due segmenti idrofobici e un motivo di sequenza abbastanza bene conservato (1). I CM, come molte proteine di membrana, sono difficilmente cristallizzabili, infatti, è stata determinata solo la struttura di una particolare configurazione (inattiva) del carrier dell’ADP/ATP cristallizzato in presenza dell’inibitore carbossiatractiloside (2). Di conseguenza, il meccanismo catalitico dei CM è poco conosciuto. Fino a quando altri CM non saranno cristallizzati, la determinazione della loro struttura dipenderà dall'applicazione di tecniche biochimiche e biofisiche, che utilizzano sonde specifiche incorporate in posizione strategiche delle proteine in seguito a mutazioni sito-dirette. Queste tecniche sono state e si stanno applicando con successo a molte proteine di trasporto (3-5) e sono proposte, in questo progetto, come metodi utili per la determinazione della struttura, e quindi per la comprensione del meccanismo catalitico di trasporto a livello molecolare, dei carriers mitocondriali.

Uno dei CM più studiati è il carrier del chetoglutarato (OGC), che catalizza il trasporto del 2-chetoglutarato in scambio con malato o altri acidi dicarbossilici attraverso la membrana mitocondriale (6) ed è essenziale in vari processi metabolici come il ciclo del malato/aspartato, il ciclo del chetoglutarato/isocitrato e la gluconeogenesi da lattato (7). Il OGC è stato purificato all'omogeneità dai mitocondri (8,9) e ricostituito in forma attiva in liposomi (8-10). Nel sistema ricostituito è stato trovato che il OGC funziona con un meccanismo cinetico simultaneo-sequenziale, e quindi nel suo ciclo catalitico è coinvolto un complesso ternario formato da due substrati e dalla proteina di trasporto (10).
La sequenza aminoacidica del OGC è stata dedotta dalla sequenza del cDNA di cuore di bue (11). Un unico gene codifica il OGC nell' uomo, nel bue e nel ratto (12, 13), e il gene umano è localizzato sul cromosoma 17p13.3 (14). Il OGC bovino è costituito da 313 aminoacidi. Come tutti gli altri CM (1, 15), l'OGC ha una struttura tripartita formata da tre segmenti omologhi di circa 100 aminoacidi. Ciascun segmento ripetuto contiene due regioni idrofobiche, separate da un'estesa regione idrofilica, e un caratteristico motivo di sequenza abbastanza ben conservato (11). La somiglianza strutturale tra la struttura primaria di queste proteine indica che si sono evolute da un gene ancestrale comune e che esse hanno strutture tridimensionali e meccanismi catalitici di trasporto simili. Sulla base del profilo idropatico e di risultati ottenuti mediante proteasi e anticorpi peptido-specifici, è stato proposto un modello di ripiegamento del OGC nella membrana mitocondriale (16) in base al quale la catena polipeptidica del OGC presenta 6 domini transmembrana, corrispondenti alle 2 regioni idrofobiche dei 3 segmenti ripetuti, che attraversano la membrana a zig-zag (domini transmembrana I-VI). Le estremità N e C del OGC sporgono dal lato citosolico della membrana mitocondriale interna. Le 3 lunghe regioni idrofiliche che uniscono i domini transmembrana di ogni segmento ripetuto sporgono dal lato della matrice e sono chiamati "loops" (A, B e C oppure loop I-II, loop III-IV e loop V-VI). Le due regioni idrofiliche più brevi che uniscono i tre segmenti ripetuti sono orientati verso l' esterno e sono chiamati a e b.

Il OGC è stata la prima proteina mitocondriale (e la prima proteina delle membrane degli eucarioti) ad essere espressa in E. coli e rinaturata (17). Procedure simili sono state poi usate per l'espressione di altre proteine di trasporto in E. coli (18-33). La tecnica dell'espressione eterologa è largamente utilizzata perché permette la produzione di proteine normali e mutate in grandi quantità per studi strutturali e funzionali.

Tutti gli studi di mutagenesi sito-diretta del OGC, condotti fino ad ora, sono stati effettuati nei laboratori delle unità proponenti questo progetto e sono qui riassunti. Ciascuna cisteina nativa del OGC (Cys 184, Cys 221 e Cys 224) è stata mutata singolarmente o simultaneamente, e sono state studiate le proprietà di trasporto e i parametri cinetici di questi mutanti (34). I risultati ottenuti dimostrano che i residui di cisteina del OGC non sono essenziali per l'attività di trasporto. Inoltre, e cio' è più rilevante per il presente progetto di ricerca, la caratterizzazione del mutante privo di cisteina (C-less OGC) rappresenta la base di ulteriori studi nei quali la sostituzione di aminoacidi con residui di cisteina, combinata a marcatura con sonde specifiche rilevabili con EPR o fluorescenza, può essere usata per ottenere informazioni sulla struttura secondaria e terziaria del OGC. I mutanti di OGC contenenti mutazioni R/L di ognuna delle 4 arginine localizzate nei domini transmembrana II, IV e VI sono inattivi, indicando l'importanza delle cariche positive dei domini transmembrana nel trasporto di chetoglutarato da parte del OGC (34). Ogni aminoacido nel dominio transmembrana IV (da T179 a S205) è stato sostituito individualmente con cisteina (35). Solo i mutanti G183C, R190C, Q198C sono completamente inattivi e quindi essenziali per il meccanismo di trasporto. Il chetoglutarato protegge i residui di cisteina nelle posizioni 187, 191 e 194 dall'inibizione da N-etilmaleimide. Tutte queste posizioni risiedono sulla stessa faccia dell'elica transmembrana IV, che probabilmente delimita una parte di una cavità o canale accessibile all'acqua esistente tra le eliche del OGC (35). Anche i residui dei domini transmembrana II e VI da I80 a V104 e da L-278 a Q-302, rispettivamente, sono stati sostituiti individualmente con cisteina. Solo i mutanti G83C, R90C, Y94C, R98C e R288 sono completamente inattivi. Anche questi residui delimitano una cavità o canale accessibile all'acqua esistente tra le eliche del OGC (Stipani et al. J. Biol. Chem. 2006, submitted). Inoltre un lavoro di spettroscopia EPR effettuato in collaborazione tra l’unità di Bari e l’unità di Roma ha dimostrato, che il dominio transmembrana IV dell'OGC ha una struttura ad alfa-elica (36). Ancora, misure di fluorescenza e di attività di trasporto dei mutanti C184W, L199W, R190W e L199W-K122C effettuate in collaborazione tra l’unità di Roma e di Bari hanno dimostrato che il chetoglutarato induce cambiamenti conformazionali dell'OGC che aumentano la distanza della lisina 122 dal triptofano 199 (37). I dati sono stati interpretati sulla base di un modello tridimensionale ottenuto per homology modeling ( 37 ) usando la struttura del carrier dell'ADP/ATP legato alla carbossiatractiloside ( 2 ) come templato. Su quest’ultimo trasportatore un recente studio di dinamica molecolare effettuato in presenza ed assenza dell’inibitore ha individuato due possibili conformazioni del trasportatore e ha suggerito che i residui di prolina localizzati nei motivi conservati delle eliche I, III e V permetterebbero I cambiamenti conformazionali agendo come perni piegando e raddrizzando le eliche dispari (38).
Per quanto riguarda la biogenesi dell'OGC, è stato trovato che nell'import dell'OGC è coinvolto il recettore Tom 70 e non Tom 20 indicando l'esistenza di vie specifiche di “import” per i CM (39). Un aspetto importante riguardante i trasportatori mitocondriali è che essi sono generalmente sintetizzati nel citosol senza presequenza. AAC di lievito, ad esempio, è privo di presequenza proteolizzabile e possiede segnali interni di targeting e di sorting che indirizzano la proteina ai mitocondri e la smistano verso la membrana interna (40-42). Sono noti pochi esempi di carrier mitocondriali dotati di presequenza, ed uno di questi è rappresentato dal carrier del fosfato di cuore di bue (43). Utilizzando proteine ibride è stato dimostrato che il carrier del fosfato di cuore di bue possiede anche segnali interni di targeting, e che la presequenza svolge soltanto un ruolo stimolante durante il processo di import (44). Esperimenti recenti hanno rivelato che la corta presequenza del carrier del citrato di fegato di ratto (CIC) non è richiesta per il targeting di questa proteina ai mitocondri isolati (45). Il CIC di fegato di ratto è il primo esempio di una preproteina mitocondriale contenente una presequenza che non è assolutamente richiesta sia per il targeting ai mitocondri, sia per l’inserimento nella membrana interna. La presequenza di CIC, invece, facilita la solubilità della preproteina ed influenza il suo stato di folding, senza determinare alcuna variazione del percorso e dei meccanismi molecolari di import della preproteina nei mitocondri (45,46). <<<