RICERCA ITALIANA     

Studio della megagametogenesi e della fertilità per un aumento della produzione di qualità in Olea europaea L.

Università degli Studi di Perugia

Abstract

L’olivo è una specie molto importante dal punto di vista economico soprattutto per i paesi dell’area mediterranea, da cui proviene il 95% della produzione totale di olio d’oliva; l’Italia in particolare è uno dei maggiori produttori mondiali di olio d’oliva con una superficie investita pari all’8,7% della superficie agricola utilizzata ed un valore pari a 2 milioni di Euro. Il notevole interesse economico legato a questa specie ha stimolato numerose ricerche volte principalmente ad aumentarne e stabilizzarne la produttività. La maggior parte di queste ricerche si sono però concentrate sul periodo post-antesico e non hanno indagato quali fattori ci siano a monte della elevata caduta di fiori nel periodo preantesico e antesico; inoltre numerosi studi riguardanti l’individuazione dei fattori citologici, fisiologici e genetici coinvolti nel processo fecondativo sono stati condotti soprattutto su specie modello o su specie di importanza economica quale il mais e il frumento, mentre pochi studi sono stati fatti su Olea europaea. Nel presente progetto saranno prese in considerazione due cultivar di olivo, Dolce Agogia e Leccino, caratterizzate rispettivamente da una abbondante fioritura e scarsa fruttificazione (Dolce Agogia) e da una percentuale di allegagione più elevata (Leccino). Nell’ambito di ciascuna cultivar saranno individuate alcune piante nelle quali alcune branche saranno sottoposte a trattamenti differenziali con impiego di fitoregolatori e a pratiche agronomiche quali l'anulazione. Sulle infiorescenze poste sia sulle branche trattate che non trattate saranno condotti studi citologici al fine di identificare le fasi e i tempi dello sviluppo del fiore e della megagametogenesi. Tali studi citologici consentiranno inoltre di comprendere meglio i meccanismi alla base di eventuali alterazioni nei processi di gametogenesi. Sulle medesime branche saranno analizzati il contenuto di etilene e poliammine nelle infiorescenze oltre che misurati i flussi di Ca2+, H+ e O2 lungo l’asse principale della mignola. Al fine di identificare i geni coinvolti nei processi di gametogenesi e loro eventuali alterazioni, dal materiale vegetale sarà estratto sia il DNA che l’mRNA in concomitanza dei tempi più significativi dello sviluppo del fiore e dell’ovulo, identificati grazie allo studio citologico. Saranno quindi condotti esperimenti di differential display utilizzando primer degenerati di famiglie geniche fortemente implicate nella regolazione dello sviluppo del fiore e del frutto. Questi esperimenti potranno consentire l’identificazione di geni differenziali di cui inoltre verrà studiata l’espressione, sia tramite Real time che tramite ibridazione in situ, in condizioni normali e alle condizioni induttive di anulazione e di applicazione di fitoregolatori. Tra i geni che potrebbero essere coinvolti nel processo di fertilizzazione alcuni saranno inoltre clonati in appositi vettori e fusi con geni codificanti per proteine fluorescenti in modo da seguire in vivo la sintesi di queste proteine, seguirne la localizzazione e cercare di identificare il ruolo che potrebbero avere durante lo sviluppo del tubetto pollinico e il processo di fertilizzazione. Inoltre, saranno studiati a livello espressivo, tramite real time e ibridazione in situ, alcuni geni chiave che controllano la struttura cellulare (elEF-a1, Actina, tubulina) o il biochimismo della cellula quali cicline e ubiquitina. Questi geni saranno impiegati sia come controllo interno dell’espressione sia per determinare un "time scale" molecolare degli eventi già individuati tramite le osservazioni citologiche. Questo tipo di approccio di indagine integrato che comprende analisi di tipo citologico, fisiologico e genetico potrà consentire di approfondire le conoscenze sui meccanismi alla base della fecondazione e sviluppo del frutto fornendo utili informazioni sia dal punto di vista della ricerca di base ma soprattutto dal punto di vista applicativo. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Bruno Romano Università degli Studi di PERUGIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’olivo è una specie caratterizzata da una abbondante differenziazione di infiorescenze e fiori ma ha bassi livelli di produttività, espressa come numero di frutti. La percentuale molto bassa di allegagione è correlata alla presenza di fiori maschili, importanti per l’apporto di polline ma non destinati a formare frutti in quanto presentano un gineceo ± abortito, e alla caduta di fiori ermafrodti che si verifica durante il periodo relativamente lungo che va dalla preantesi alla post-antesi. La caduta di questi fiori può essere legata a diversi fenomeni tra cui la degenerazione di tutti i sacchi embrionali presenti nell’ovario o la mancata fecondazione, anche in presenza di ovuli con sacchi embrionali ben conformati. La degenerazione di tutti i sacchi embrionali presenti all’interno dell’ovario potrebbe essere regolata dagli stessi fattori (genici o fisiologici) che determinano la degenerazione dei tre ovuli presenti nell’ovario di ciascun fiore ma non soggetti a fecondazione; nell’olivo infatti come in tutte le specie pluriovulari ma monosperme solo in uno dei sacchi embrionali si realizza il processo fecondativo. Comprendere i motivi per cui tre dei quattro ovuli non vengono fecondati ed abortiscono oppure tutti e quattro abortiscono o infine perché moltissimi fiori ermafroditi, sebbene perfetti, abscindano precocemente sarebbe di grande utilità per programmi di miglioramento e di incrememento di una agricoltura sostenibile che permetta di sfruttare al massimo le potenzialità produttive di questa pianta.
L’obiettivo del presente progetto è di comprendere quali meccanismi citologici, fisiologici e genetici siano alla base della bassa allegagione in olivo in modo da fornire utili indicazioni per rendere economicamente più remunerativa la coltivazione di questa pianta. Lo studio citologico consentirà di evidenziare in quale momento e tramite quale alterazioni cellulari venga interrotto il regolare sviluppo del megagamentofito e conseguentemente si verifichi la degenerazione. Nell’ambito dello studio fisiologico verrà preso in considerazione l’effetto dell’apporto di nutrienti sul numero di fiori che producono giovani frutti ma anche quello di alcune sostanze quali le poliammine, l’etilene o il calcio, il cui coinvolgimento nei processi riproduttivi è stato più volte ipotizzato (de Dios et al., 2006; Chudzik and Sniezko, 2003).
Lo studio genetico ha come obiettivo, infine, l’isolamento di alcuni geni coinvolti nella regolazione della differenziazione degli organi fiorali e della gametogenesi e lo studio della loro espressione. Dato che i meccanismi di regolazione alla base di questi fenomeni sono molto conservati, i risultati ottenuti dal presente studio potrebbero fornire anche indicazioni utili per la comprensione della biologia riproduttiva in altre specie. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L'olivo (Olea europaea L.) è una specie originaria delle regioni del mediterraneo ed appartiene alla famiglia delle Oleaceae che comprende circa 20 specie delle quali solo l'olivo ha frutti commestibili. La fioritura avviene tra Aprile e Maggio con variazioni legate alla cultivar e alle condizioni climatiche. Negli ambienti mediterranei l'olivo riveste una grossa importanza economica e l'Italia in particolare è tra i maggiori produttori mondiali di olio d'oliva.
Il notevole interesse economico legato a questa specie ha stimolato numerose ricerche volte principalmente ad aumentarne e stabilizzarne la produttività.
L'Olivo, infatti, come molte altre piante monoiche è caratterizzato da un'abbondante produzione di fiori ma da una scarsa fruttificazione oltre ad avere una spiccata propensione a fenomeni di alternanza (Martin, 1990). Troncoso et al., nel 1978, hanno stimato che solo il 2% dei fiori si sviluppa in frutti maturi. Una tale ampia fioritura determina elevati costi nutritivi per la pianta, ma consente anche un soddisfacente controllo sul numero e sulla qualità dei frutti. La presenza di un numero elevato di fiori garantisce, infatti, alla pianta la possibilità di sfruttare al meglio le risorse nutritive disponibili in diverse condizioni ambientali, anche se la quantità di risorse totali e la loro distribuzione al momento dell'antesi non è prevedibile in anticipo (Stephenson, 1981).
La presenza di un così elevato numero di fiori fornisce alla pianta la possibilità di controllare la qualità dei frutti in quanto un'elevata produzione di polline intensifica la competizione tra i gametofiti maschili, in modo che solo i più vigorosi realizzino la fecondazione e quindi si producano semi qualitativamente migliori (Tangmitcharoen and Owens, 1997). L'elevato costo nutritivo di un'abbondante differenziazione di fiori viene in parte limitato dalla pianta attraverso la produzione di "fiori staminiferi" nei quali è possibile identificare un perianzio ed un androceo ben conformati ma un pistillo più piccolo e precocemente involuto (Uriu, 1959, Cuevas and Polito, 2004, Reale et al., in press). Nei fiori "staminiferi" l'aborto del pistillo può verificarsi in vari momenti della ontogenesi del fiore, ma più comunemente avviene durante la fase di rapida crescita del pistillo, circa un mese prima dell'antesi; in alcuni casi questo fenomeno diventa così marcato che il pistillo non differenzia ovuli e mostra i carpelli non completamente chiusi a formare lo stilo e lo stigma, mentre nelle antere si realizza la normale microsporogenesi. La presenza di questi fiori maschili incrementa la quantità di polline presente per la impollinazione e implica un minore dispendio per la pianta che deve differenziare unicamente le porzioni sterili del fiore e gli stami. Il rapporto numero frutti/numero fiori non è basso unicamente per la presenza di fiori staminiferi, infatti anche i fiori che non sono sede del processo fecondativo vengono persi dalla pianta nelle fasi successive all'antesi. La caduta di quest'ultimo tipo di fiori è un fenomeno facilmente comprensibile in quanto viene a mancare, in successione, l'apporto ormonale concomitante all'arrivo del polline e alla fecondazione-sviluppo dell'embrione. Nell'abscissione di fiori ermafroditi non sembra comunque essere coinvolta unicamente l'impollinazione in quanto studi condotti confrontando la produttività ottenuta con impollinazione naturale e manuale (apporto massiccio di polline) non sempre hanno evidenziato delle differenze (Stephenson, 1981), infatti molti dei fiori abscissi presentano stigmi con molti granuli di polline, inoltre i fiori ermafroditi in alcuni casi abscindono precocemente prima dell'antesi. Un indizio della degenerazione dei fiori è rappresentato dal colore anomalo assunto dall'ovario e dallo stigma oltre che dalla presenza di necrosi a livello del ricettacolo. La caduta di questi fiori potrebbe essere legata alla presenza di ovuli che non hanno differenziato sacchi embrionali perfettamente conformati o che presentano sacchi ben conformati ma successivamente degenerati. In olivo come in altre piante pluriovulate ma monosperme, dei quattro ovuli solo uno viene fecondato, originando il seme, mentre gli altri tre degenerano. Questi due fenomeni potrebbero essere tra loro correlati e condividere uno stesso pattern di regolazione. Lo sviluppo del gametofito femminile puo` essere influenzato da mutazioni sporofitiche o gametofitiche. In particolare il tessuto sporofitico che circonda il gametofito femminile potrebbe avere un ruolo nel controllare la megagametogenesi, ma al momento le basi molecolari di questo controllo sporofitico sono ancora sconosciute. Le mutazioni gametofitiche che influenzano lo sviluppo del gametofito femminile avvengono dopo la meiosi, cioe` durante la megagametogenesi e possono intaccare lo sviluppo del gametofito femminile maturo (direzionamento del tubo pollinico, fertilizzazione, induzione dello sviluppo del seme o controllo materno dello sviluppo del seme) (Yadegari and Drews, 2004; Moore et al., 1997; Drews et al., 1998; Drews and Yadegari, 2002; Page and Grossniklaus, 2002).
Ricerche condotte negli ultimi anni hanno permesso di identificare ed analizzare molti mutanti gametofitici che influenzano lo sviluppo del gametofito femminile (Christensen et al., 2002; Drews and Yadegari, 2002; Grini et al., 2002; Huck et al., 2003; Rotman et al., 2003).Tuttavia i geni coinvolti in molte delle mutazioni che avvengono in megagametogenesi non sono al momento conosciuti; ad oggi studi volti all'isolamento di tali geni sono stati condotti soprattutto su Arabidopsis e mais mentre ancora poco si conosce riguardo la regolazione di tali fenomeni in specie arboree ed in particolare in olivo.
Un ruolo importante nella regolazione degli eventi riproduttivi è svolto anche da fattori ormonali. Ulger et al. (2004) riportano che alcuni fattori ormonali risultano coinvolti in maniera determinante nelle fasi di induzione e differenziazione delle gemme. In particolare, il livello di alcuni fitoregolatori come ABA, Zeatina, GA3 e GA4 è risultato elevato in gemme in fase di differenziazione avanzata, mentre in fase di induzione è stata riscontrata una bassa concentrazione di IAA, Zeatina, GA3 e GA4. La concentrazione di IAA è risultata elevata all’inizio della differenziazione. Nel complesso il livello di GA3 risulta elevato in anni di carica, mentre in anni di scarica è emerso un elevato contenuto di IAA, Zeatina, ABA e GA4. Per GA3 gli stessi risultati sono stati osservati da Pal e Ram (1978) in mango (Mangifera indica L.) e Looney et al. (1985) hanno osservato che applicazioni esogene di GA4 su melo (Malus domestica L.) aumentano la produzione di frutti. Anche l’etilene svolge un importante ruolo di regolazione degli eventi riproduttivi essendo legato al fenomeno dell'abscissione. Lo stesso ormone è correlato alla sintesi delle poliammine (Adams et al., 1979). Recenti lavori hanno confermato il ruolo importante di queste ultime nella fertilizzazione e nel successivo sviluppo del frutto in diverse specie (de Dios et al. 2006; Liang and Lur 2002; Kushad and Yelenosky 1998) e nel prolungare la senescenza dei tessuti vegetali (Tassoni et al, 2006). In olivo, le poliammine sono coinvolte anche nella induzione a fiore, il contenuto della frazione coniugata infatti aumenta in tarda estate nelle gemme destinate a differenziarsi a fiore, periodo che coinciderebbe appunto con l’induzione a fiore (Rugini e Muganu, 2006). In questa specie il loro contenuto nei tessuti risulta essere basso se comparato con alcune altre specie arboree (Rugini 1992), infatti i trattamenti esogeni aumentano la probabilità di concretizzare certi fenomeni come la rizogenesi (Rugini, 1992) e l’allegagione (Rugini e Mencuccini , 1985). Trattamenti esogeni in pre-fioritura con putrescina aumenta l’allegagione e riduce l’abscissione delle drupe in due cultivar autoincompatibili, Pendolino e Leccino (Rugini, 1985). Effetti positivi sull’allegagione sono stati osservati anche in melo (Costa e Bagni, 1983), lasciando supporre ad una possibile attività antietilenica svolta da trattamenti esogeni con poliammine in piena fioritura (Apelbaum et al., 1981). Rugini et al. (1986) hanno comparato in olivo l’effetto della putrescina con quello di prodotti specifici capaci di ridurre drasticamente la sintesi di etilene, ed hanno osservato che con i prodotti antietilenici hanno diminuito la sua produzione a cui però non è corrisposto un significativo incremento dell’allegagione. Nei trattamenti con la putrescina, sebbene la riduzione della sintesi dell’etilene sia stata inferiore, ha significativamente incrementato l'allegagione. In base a questi risultati è ipotizzabile che le poliammine in olivo agiscano in diverso modo piuttosto che attraverso la sola inibizione della biosintesi dell’etilene. Ulteriori indagini sono quindi necessarie per approfondire le conoscenze dei meccanismi d’azione della putrescina anche nella vitalità e qualità delle cellule del sacco embrionale, infatti sono state rilevate differenti concentrazioni di poliammine in organi sterili e fertili. Il meccanismo attraverso cui le poliammine regolano lo sviluppo del fiore non è ancora noto, mentre è più documentata l'influenza di questi composti sullo sviluppo del polline, infatti Gou et al. (2003), hanno proposto che bassi livelli di poliammine in piante maschio-sterili influenzano la divisione e la distensione cellulare, determinando un anomalo sviluppo e una bassa vitalità del polline; Bagni et al., (1981) hanno invece indicato che la biosintesi delle poliammine si verifica prima dell'emergenza del tubetto pollinico. Riguardo l'influenza delle poliammine sullo sviluppo del pistillo è stata invece evidenziata la loro capacità di aumentare la vitalità dell'ovulo e di prolungare il periodo di recettività stigmatica (Crisosto et al., 1988).
Tra i fattori coinvolti nella fertilizzazione ed in particolare nello sviluppo del tubetto pollinico e nella fusione dei gameti, un ruolo importante è svolto dal calcio. Durante la crescita del tubo pollinico il calcio, mobilizzato dagli stores cellulari interni, puo` facilitare la fusione delle vescicole secretorie con la membrana plasmatica, dove possono essere secrete importanti molecole implicate nell’attrazione del tubo pollinico. Il calcio, inoltre, fa parte di quegli essudati micropilari la cui presenza è un fattore discriminate tra ovuli sterili e fertili (Herrero, 2000)
Un importante ruolo nella regolazione degli eventi riproduttivi è svolto anche dalla competizione per le sostanze nutritive tra organi vegetativi e riproduttivi (Sachs e Hackett, 1983). Fontanazza et al. (1987) hanno osservato che potature consistenti riducono considerevolmente l'allegagione e che trattamenti con ABA aumentano l’allegagione per effetto di un temporaneo arresto dello sviluppo vegetativo a favore dell’attività riproduttiva (Rugini et al., 1993).
È possibile favorire l’allegagione e la persistenza sul ramo dei frutti attraverso alcune pratiche agronomiche, quali l’anulazione, in grado di aumentare la disponibilità di carboidrati, in quanto l'incremento di sostanze nutritive ha determinato in molte piante un aumento del numero di frutti allegati (Stephenson, 1981). In olivo, in particolare, la disponibilità di risorse sembra in grado di controllare più che la quantità di fiori in grado di produrre frutti nell'ambito di un'infiorescenza, il numero totale delle infiorescenze (Reale et al., in press). Le ricerche finora svolte per comprendere la biologia fiorale dell'olivo hanno preso in considerazione solo uno degli aspetti qui considerati, mentre uno studio integrato che comprenda analisi citologiche, fisiologiche e genetiche potrebbe fornire un quadro più completo ed esaustivo consentendo lo sviluppo di tecniche o anche di programmi di miglioramento genetico utili a incrementare la produzione e quindi la redditività di questa specie. <<<