RICERCA ITALIANA     

SINTESI E CARATTERIZZAZIONE FARMACOLOGICA DI NUOVE MOLECOLE SELETTIVE PER IL RECETTORE BENZODIAZEPINICO PERIFERICO UTILI PER LA MODULAZIONE DELLA NEUROSTEROIDOGENESI, PER LA DIAGNOSI DI MALATTIE NEURODEGENERATIVE E PER IL DIREZIONAMENTO DI FARMACI ANTITUMORALI

Università degli Studi di Cagliari

Abstract

Studi recenti hanno dimostrato che il recettore periferico per le benzodiazepine (PBR) svolge diversi ruoli fondamentali a livello cellulare tra cui la regolazione della sintesi di steroidi. Distinto dal recettore “centrale” per le benzodiazepine (CBR), il PBR è espresso sulla membrana mitocondriale, dove controlla la traslocazione del colesterolo nel compartimento interno del mitocondrio, sia a livello centrale (cellule gliali e neuroni) che in organi periferici prevalentemente a funzione endocrina. I composti steroidei, derivati dal metabolismo del progesterone e definiti “neurosteroidi”, come l’allopregnanolone e il THDOC, sono noti indurre marcati effetti antistress e ansiolitici, dovuti alla loro azione di membrana che si esplica attraverso una facilitazione della neurotrasmissione inibitoria rapida mediata dai recettori per l’acido gamma-aminobutirrico di tipo A (GABA-A) nel Sistema Nervoso Centrale. Fluttuazioni fisiologiche e/o patologiche delle concentrazioni di neurosteroidi potrebbero avere un ruolo determinante nella modulazione degli stati emozionali, così come nei meccanismi omeostatici e di plasticità neuronale che intervengono per attenuare e regolare un eccessivo livello di eccitazione scatenato da vari stimoli quali ad esempio uno stress acuto. Altri studi hanno dimostrato che l’espressione dei PBR può essere aumentata drammaticamente in diverse condizioni fisiologiche e patologiche, come in alcune malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e quello di Huntington. Inoltre, livelli elevati di espressione di PBR sono stati riscontrati in tessuti neoplastici e in linee di cellule tumorali, suggerendo che questa caratteristica potrebbe essere utilizzata a fini diagnostici o come target per il rilascio sito-specifico di farmaci antitumorali specialmente a livello cerebrale.
Sulla base di queste considerazioni, sono bene evidenti le implicazioni cliniche rappresentate dalla possibilità di poter modulare, attraverso ligandi dotati di elevata affinità e selettività con profilo di agonisti o di antagonisti, la funzione del PBR e conseguentemente di manipolare farmacologicamente la sintesi di steroidi neuroattivi sia nel cervello che in tessuti periferici.
Lo scopo di questo progetto di ricerca, che è da considerarsi una prosecuzione di precedenti ricerche condotte in collaborazione dalle Unità di ricerca proponenti, è quello di sintetizzare e caratterizzare biologicamente una nuova serie di composti derivati dalla struttura imidazopiridinacetammidica che presentano alta affinità e selettività per il PBR, e che sono dotati di azione agonista o antagonista sulla sintesi di steroidi neuroattivi. Alcune di queste molecole verranno utilizzate per la preparazione di coniugati con farmaci antitumorali in modo da permettere una maggiore biodisponilità e un rilascio sito-specifico del principio attivo antitumorale, quali la citarabina (Ara C) e il metotrexato. Infine, dal momento che, come già citato, l’espressione del PBR è marcatamente aumentata nei tessuti neoplastici o in seguito a patologie neurodegenerative, un ulteriore obiettivo sarà quello di sintetizzare e caratterizzare un’altra serie di derivati imidazopiridinacetammidici che saranno radiomarcati alfine di essere utilizzati come sonde per la visualizzazione dei PBR tramite PET.
Queste nuove molecole ad alta affinità e selettività per il PBR potrebbero rappresentare importanti strumenti non solo per la ricerca scientifica di base ma anche nella pratica clinica sia per quanto riguarda la diagnostica di tumori o patologie neurodegenerative sia come agenti terapeutici in differenti patologie che coinvolgono alterazioni nella sintesi di steroidi neuroattivi. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Enrico Sanna Università degli Studi di CAGLIARI

Obiettivo del Programma di Ricerca

I recettori periferici per le benzodiazepine (PBR) sono recettori distinti dai recettori centrali per le benzodiazepine (CBR), associati al recettore GABA-A, e sono localizzati sulla membrana mitocondriale di cellule gliali e neuronali e di cellule di organi perferici come surrene, testicolo, ovario, polmone, fegato, cuore, nonché nelle piastrine, linfociti e glubuli rossi. Il PBR è coinvolto in numerose funzioni cellulari come la regolazione della proliferazione cellulare, risposta immunitaria, trasporto del colesterolo, trasporto di porfirina e biosintesi dell’eme, processi ossidatiti e morte cellulare programmata. In aggiunta, un altro ruolo fisiologico importante del PBR è la promozione della steroidogenesi sia a livello centrale che periferico. Infatti, questi recettori sono capaci di promuovere la traslocazione del colesterolo dai siti di deposito e di sintesi intracellulare verso la membrana mitocondriale interna, dove questo precursore viene ossidato a pregnenolone, dal cui successivo metabolismo originano gli altri steroidi. Quindi questo processo costituisce la tappa limitante della sintesi degli steroidi. Due metaboliti del progesterone, allopregnanolone e THDOC sono noti indurre, attraverso un’azione modulatoria positiva sui recettori GABA-A, effetti simili a quelli delle benzodiazepine e dei barbiturici, suggerendo che questi ormoni possono esser tra le molecole endogene più importanti nel controllo degli stati emozionali. Si ritiene inoltre che variazioni fisiologiche dei livelli cerebrali e plasmatici di questi ormoni potrebbero determinare attraverso la loro influenza sui recettori GABA-A, alterazioni nelle manifestazioni comportamentali associate alla sfera emotiva ed affettiva. Infatti, essendo il GABA il neurotrasmettitore inibitore più abbondante nel sistema nervoso centrale dei mammiferi, alterazioni nella sintesi e secrezione centrale e periferica di questi ormoni steroidei potrebbe costituire uno dei più importanti meccanismi neurochimici capaci di modificare l’attività di differenti sistemi neuronali coinvolti nel controllo delle emozioni e nella regolazione del tono dell’umore. Risultano quindi evidenti l’importanza e le eventuali ricadute cliniche della possibilità di poter controllare farmacologicamente, sia positivamente che negativamente, la funzione di questo recettore e di conseguenza la steroidogenesi sia nel cervello che in periferia attraverso l’utilizzo di ligandi selettivi per il recettore periferico per le benzodiazepine ad azione agonista o antagonista,.
Altri studi hanno inoltre dimostrato che l’espressione del PBR può essere regolata in risposta a variazioni sia fisiologiche sia patologiche, come disturbi neurodegenerativi quali la malattia di Alzheimer, malattia di Huntington e il morbo di Parkinson. Studi microautoradiografici hanno dimostrato che l’aumento della densità dei PBR riflettono un’attivazione della microglia in seguito al danno neuronale, e questo potrebbe costituire un marker per la diagnosi di malattie neurodegenerative. Inoltre, livelli elevati di espressione del PBR sono stati osservati nel tessuto neoplastico e in linee di cellule tumorali, suggerendo quindi che questa caratteristica up-regulation potrebbe rappresentare un utile indice diagnostico o come target per il rilascio sito-specifico di farmaci antitumorali specialmente a livello cerebrale.
Considerando l’estesa esperienza dei laboratori costituenti le due Unità di ricerca proponenti nella ricerca di nuovi ligandi imidazopiridinici per il PBR, l’obiettivo del presente progetto di ricerca è quello di sintetizzare e valutare l’attività biologica di una serie di nuovi potenziali ligandi agonisti e antagonisti del PBR, ottenuti mediante modificazione della struttura imidazopiridinacetammidica introducendo gruppi polari e ionizzabili nell’anello fenilico in posizione 2 o 8 del nucleo eterociclico. Questi composti verranno studiati sia dal punto di vista chimico-fisico sia da quello farmacologico, per la loro affinità e selettività nei confronti del PBR, e per la loro capacità di modulare la steroidogenesi. Applicando inoltre un’analisi elettrofisiologica mediante il patch clamp su preparazioni di membrane di mitocondri si studierà l’azione di questi composti nella modulazione di canali ionici accoppiati al PBR. Questo studio potrebbe essere utile per l’identificazione di molecole ad azione sia agonista sia antagonista del PBR. I nuovi composti con migliori caratteristiche recettoriali e farmacologiche potranno servire, oltre che per la modulazione farmacologica della steroidogenesi, anche per preparare coniugati con farmaci antitumorali, quali la citarabina (AraC) ed il metotrexato, i quali sono caratterizzati da bassa biodisponibilità a livello cerebrale in quanto idrofili e/o substrati della nota Glicoproteine P che ne determina l’efflusso a livello della barriera emato-encefalica. Di questi coniugati verrà valutata, nel laboratorio del Prof Gallo, anche la loro citotossicità per un effetto combinato con la possibile apoptosi generata dagli stessi ligandi. Un altro obiettivo sarà quello di sintetizzare ligandi selettivi per il PBR da utilizzare per la visualizzazione e la localizzazione di questi recettori. Alcuni dei composti sintetizzati potranno infatti servire come strutture di partenza per la radiosintesi finalizzata all’ottenimento dei corrispondenti [C-11]O-metil-derivati che potrebbero essere utilizzati per sviluppare marcatori del PBR mediante tomografia per emissione di positroni (PET). La possibilità di poter disporre di detti ligandi assume evidentemente una certa rilevanza in considerazione delle eventuali ricadute cliniche nella diagnostica per immagine di nuova generazione nel caso di patologie tumorali oltre che malattie neurodegenerativa quali la malattia di Alzheimer.
Perciò, l’obiettivo di questo progetto è quello di identificare nuove molecole dotate di alta affinità e selettivita per il PBR che, con le loro differenti applicazioni, potrebbero rappresentare importanti strumenti non solo per la ricerca scientifica in questo particolare settore, ma anche in campo clinico, come marcatori selettivi e ad alta affinità, a fini diagnostici come nel caso di patologie tumorali, e come efficaci strumenti terapeutici che trovano applicazione in patologie che coinvolgono alterazioni della sintesi di steroidi. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il recettore periferico per le benzodiazepine (PBR), scoperto originariamente in quanto capace di legare la benzodiazepina diazepam con un’affinità relativamente elevata (1), è strutturalmente e funzionalmente distinto dal recettore centrale delle benzodiazepine (CBR), il quale è un sito associato al complesso recettoriale GABAA localizzato principalmente nel Sistema Nervoso Centrale (SNC). Dal punto di vista strutturale, il PBR è un complesso multimerico composto da tre differenti subunità proteiche. Una proteina recettore di 18-kDa, la cui sequenza aminoacidica (169 AA) presenta un grado di omologia dell’80% tra le diverse specie analizzate (umana, bovina, murina); l’analisi idropatica della sequenza primaria aminoacidica rivela la presenza di 5 segmenti transmembrana, un terminale amminico orientato verso lo spazio intermembranale mitocondriale ed un terminale carbossilico orientato verso il citoplasma cellulare. Questa subunità (18-kDa) è associata con due proteine, una delle quali avente massa molecolare di 32-kDa e che forma un canale anionico voltaggio-dipendente (VDAC) necessario per il legame delle BZ, e una seconda di 30-kDa trasportatrice di nucleotidi adeninici con funzione sconosciuta (2,3). Il VDAC è un canale ad alta conduttanza e scarsa selettività ionica, localizzato nella membrana mitocondriale esterna, in prevalenza nei siti di contatto di questa con la membrana mitocondriale interna. Il trasportatore di nucleotidi adeninici è invece localizzato sulla membrana mitocondriale interna.
Sebbene il PBR sia presente nella maggior parte dei tessuti esaminati (es. polmone, cuore, muscoli scheletrici, piastrine, linfociti, eritrociti), esso è particolarmente abbondante nei tessuti che producono steroidi (es. surrene, testicolo, ovario), localizzato nella membrana mitocondriale esterna (2,3), più abbondante nei siti di contatto tra membrana mitocondriale esterna e interna (4).
Il PBR differisce sostanzialmente dal CBR anche sotto il profilo farmacologico. Vi sono molecole ansiolitiche e ipnotiche come il diazepam, il flunitrazepam, lo zolpidem e l’alpidem, che, oltre a possedere elevata affinità per i recettori centrali, possono legarsi anche ai recettori periferici con buona affinità (Ki 10-20 nM). Inoltre, esistono molecole come la benzodiazepina Ro5-4864, il derivato isoquinolinico PK11195, l’indolacetamide FGIN-1, e alcuni derivati imidazopiridinici della serie CB (questi ultimi sintetizzati e caratterizzati dalle due Unità di ricerche proponenti questo progetto), i quali si legano selettivamente con alta affinità (Ki 1-5 nM) solo al PBR.
Sebbene il ruolo fisiologico del PBR non sia stato ancora chiarito completamente, diverse evidenze sperimentali suggeriscono un suo coinvolgimento nella regolazione di importanti e fondamentali funzioni cellulari come, per esempio, l’omeostasi del calcio, l’ossidazione mitocondriale, il metabolismo lipidico, la crescita e il differenziamento cellulare, la proliferazione di cellule tumorali, processi immunitari, il trasporto di porfirina e la biosintesi dell’eme, e la regolazione della morte cellulare programmata o apoptosi (2,3). Tuttavia, in accordo con gli alti livelli di espressione nei tessuti che sintetizzano steroidi, studi “in vitro” e “in vivo” hanno dimostrato che il PBR è coinvolto nella regolazione del trasporto di colesterolo dalla membrana mitocondriale esterna a quella interna, che costituisce il passaggio velocità-limitante nella biosintesi di steroidi (2). Nella membrana mitocondriale interna il colesterolo viene convertito in pregnenolone dall’enzima citocromoP450 “side chain cleavage” (P450scc) che catalizza una serie di reazioni che coinvolgono la formazione degli intermedi 22R-OH-colesterolo e 20,22R-OH-colesterolo, seguita dalla scissione del legame fra C20 e C22 del colesterolo (5). Il pregnenolone lascia quindi il mitocondrio per essere trasformato enzimaticamente nel reticolo endoplasmatico portando alla formazione di prodotti steroidei finali.
Esperimenti di ricostituzione “in vitro” dimostrano che la proteina di 18-kDa lega con alta affinità sia le molecole ligando, quali il Ro5-4964 e il PK11195, sia il colesterolo (6,7). A concentrazioni nanomolari, i ligandi del PBR aumentano la formazione di pregnenolone e di steroidi neuroattivi (2). Studi “in situ” e “in vitro” hanno indicato che nelle cellule steroidogeniche il trasporto di colesterolo indotto dalla proteina di regolazione acuta della steroidogenesi (StAR) nei mitocondri è regolato dai PBR della membrana mitocondriale esterna (8), indicando che un’interazione funzionale tra StAR e PBR è necessaria per il rilascio di colesterolo nel mitocondrio e per la successiva formazione di steroidi.
Nella ricerca della specificità tissutale dell’espressione del PBR, è stato mostrato che gli alti livelli di espressione di PBR nelle cellule steroidogeniche sono dovuti, almeno in parte, all’espressione dei fattori di trascrizione Sp1/Sp3 (9). Quindi, l’espressione di specifici fattori di trascrizione risulta in una sovra-espressione del PBR e nell’aumento del trasporto di colesterolo nei mitocondri associato alla steroidogenesi. In altri tessuti, l’espressione del PBR potrebbe essere parte dei processi di biogenesi della membrana mitocondriale coinvolti nell’aumento della proliferazione cellulare (cancro, gliosi) e nel riparo tissutale (danno nervoso e danno da ischemia-riperfusione) dove i livelli di PBR sono stati mostrati essere elevati (10-13).
E’ noto che gli ormoni agiscono mediante la regolazione dell’espressione genica, inducendo processi cellulari come la crescita e il differenziamento nei tessuti steroide-sensibili. Gli effetti degli steroidi sono mediati attraverso proteine membri della superfamiglia dei recettori per gli ormoni, un gruppo di fattori intracellulari di trascrizione (14). Gli steroidi hanno anche effetti rapidi, non-genomici, particolarmente nel cervello, descritti per la prima volta negli anni ’40 (15,16). Queste attività non-genomiche sono caratterizzate da effetti estremamente rapidi, da millisecondi a minuti, e non necessitano di interazioni con i recettori per gli ormoni (17). Nel SNC, questi effetti sono ritenuti coinvolgere la modulazione da parte degli steroidi dei recettori di membrana per i neurotrasmettitori (18,19), inclusi il recettore GABAA, i recettori glutammatergici NMDA, e i recettori sigma (20,21). In particolare, i metaboliti 3alfa,5alfa-ridotti del progesterone, come il 3alfa-idrossi-5alfa-pregnan-20-one (allopregnanolone), sono tra i più potenti ed efficaci modulatori positivi dei recettori GABAA, i quali mediano in buona parte la neurotrasmissione inibitoria rapida a livello del SNC. I recettori GABAA svolgono un ruolo cruciale nel controllo dell’eccitabilità neuronale e mediano l’azione ansiolitica, sedativo-ipnotica e anticonvulsivante di farmaci quali le benzodiazepine, i barbiturici, le imidazopiridine, i ciclopirroloni e le pirazolopirimidine. La somministrazione sistemica o intracerebroventricolare di allopregnanolone induce una serie di risposte comportamentali e farmacologiche (effetto ansiolitico, anticonvulsivante, sedativo-ipnotico) del tutto simili a quelle indotte dai sopraccitati farmaci. Un effetto ansiolitico si ottiene nell’uomo e nell’animale in seguito ad un aumento del contenuto di allopregnanolone endogeno dopo somministrazione sistemica del suo precursore progesterone.
Gli steroidi neuroattivi sono stati studiati intensamente negli anni recenti a causa del grande interesse su di loro come potenziali farmaci per il trattamento di numerose condizioni neuropatologiche e cliniche (22,25). A causa della loro struttura lipofilica, gli steroidi possono diffondere facilmente attraverso la barriera emato-encefalica se somministrati perifericamente. Inoltre, la quantità di steroidi necessaria per indurre variazioni nell’attività neuronale è estremamente bassa, solitamente dell’ordine nanomolare. Il termine “neurosteroidi” fu inizialmente usato da Baulieu e Robel (26) per designare gli intermedi degli ormoni steroidei, diidroepiandrosterone e pregnenolone o la loro forma solfato, che potevano essere misurati nel cervello a concentrazioni indipendenti dalle sorgenti periferiche conosciute, come le ghiandole surrenali o le gonadi (27,28).
Risulta quindi evidente che la possibilità di controllare e modulare farmacologicamente la funzione del PBR e di conseguenza la sintesi di ormoni steroidei attraverso l’utilizzo di ligandi selettivi ad azione agonista o antagonista, assume una notevole rilevanza e potrebbe avere profonde ricadute dal punto di vista clinico.
Nel cervello, il PBR è principalmente espresso nelle cellule gliali e, a livelli più bassi, nei neuroni (29). L’espressione basale di PBR è sovra-regolata in diverse neuropatologie, inclusi i glomi (30,31), disturbi neurodegenerativi come il morbo di Alzheimer (32-34), così come varie forme di danno cerebrale e infiammazione (13,35) indotti da neurotossine o cuprizone (35,36-38). Una caratteristica tipica dei disturbi neurodegenerativi così come del danno cerebrale è l’attivazione della microglia e l’infiammazione, che portano alla gliosi. Considerando l’alto livello di espressione del PBR nella glia così come nell’aumentata proliferazione di glia nella gliosi, è evidente che il PBR potrebbe servire come indice diagnostico per la progressione dello stato patologico. Infatti, in aggiunta alla patologia e ai danni citati sopra, i livelli aumentati di PBR sono stati osservati nella sclerosi multipla (39), nel morbo di Parkinson (33) e nel morbo di Huntington (32,40) così come in modelli animali di epilessia (41-43). Livelli aumentati di PBR nell’astroglia sono stati associati anche con l’encefalopatia epatica, una condizione dove è stato proposto un ruolo per la disfunzione degli astrociti indotta da ammonio (44). Il PBR è stato anche implicato nella degenerazione e rigenerazione dei nervi periferici (11) dove la densità del PBR e i livelli di ligando endogeno del PBR, il polipeptide “diazepam binding inhibitor” (DBI) e i suoi metaboliti, sono aumentati in seguito a danno dei nervi periferici. Una volta che la rigenerazione del nervo periferico si è completata, i livelli di PBR e di DBI tornavano a quelli di controllo. Il ruolo preciso del PBR nella neurodegenerazione non è noto. Tuttavia, considerando un bisogno aumentato di biogenesi mitocondriale necessario per sostenere l’accelerata proliferazione cellulare che si osserva nei gliomi o durante la gliosi, è possibile che l’aumento dei livelli di PBR sia necessario per un aumento del trasporto di colesterolo (45) e di proteine (8,46) richiesti per la biogenesi della membrana mitocondriale interna. In aggiunta alla comprensione del ruolo del PBR in differenti neuropatologie, gli studi riportati sopra hanno dimostrato un consistente e specifico aumento di PBR durante la neurodegenerazione e nel danno cerebrale suggerendo che i ligandi del PBR siano utili marcatori per il “brain imaging” (47-50).
Nell’ambito di questi studi, le Unità di ricerca proponenti hanno intrapreso in questi ultimi anni un intenso progetto di ricerca mirato alla sintesi e caratterizzazione di nuove molecole attive sul PBR. I risultati di queste ricerche hanno portato all’identificazione di una serie di derivati 2-fenil-imidazo[1,2]piridinacetammidici che hanno mostrato infatti capacità di legarsi con alta affinità e selettività col PBR e di stimolare efficacemente la biosintesi di steroidi nel cervello e in organi periferici (51-54).
In questo nuovo progetto di ricerca, ci proponiamo di sintetizzare una nuova serie di derivati ottenuti con sostituenti polari o con gruppi ionizzabili in posizione 2 e 8 della struttura imidazopiridinacetammidica (per le strutture, si veda il Modello B dell’Unità di Bari) e di valutarne, dal punto di vista farmacodinamica, gli effetti di sulla funzione di canali ionici mitocondriali accoppiati al PBR nonché l’efficacia nella stimolazione della steroidogenesi,. L’obiettivo sarà quello di identificare e caratterizzare l’attività farmacologica di nuovi ligandi selettivi e ad alta affinità per il PBR che potranno essere utilizzati per la modulazione farmacologica delle funzioni regolate dal PBR, in particolare la steroidogenesi, per ottenere coniugati con farmaci antitumorali, e per la preparazione di composti radiomarcati da utilizzare come possibili marcatori del PBR mediante tomografia per emissione di positroni (PET) per la diagnosi di diverse malattie neurodegenerative.

Elementi e i criteri proposti per la verifica dei risultati raggiunti
Sintesi chimica e caratterizzazione di nuove molecole a potenziale utilizzo nel settore della ricerca biomedica e nel campo clinico, sia come agenti terapeutici, capaci di modulare la biosintesi di steroidi neuroattivi di veicolare il rilascio di farmaci ad azione antitumorale, che come marcatori a scopo diagnostico per diverse patologie tumorali e neurodegenerative.
Pubblicazioni scientifiche su riviste internazionali qualificate. <<<