RICERCA ITALIANA     

Proprieta’ strutturali e attivita’ funzionale di un complesso proteico modificante la cromatina nell’uomo

Università degli Studi di Milano

Abstract

Il nucleosoma, l'unità fondamentale che costituisce la cromatina, è una particella compatta composta da un filamento di DNA in doppio filamento, avvolto attorno al cuore istonico; i residui N-terminali degli istoni sono bersaglio di molteplici modificazioni post-traduzionali (metilazione, acetilazione, fosforilazione e SUMOilazione). Tali modifiche agiscono in modo combinatoriale e sequenza-dipendente, costituendo una sorta di vocabolario per la regolazione di processi della trascrizione genica (il “codice istonico”). L’epigenetica studia i meccanismi che permettono la trasmissione di un particolare fenotipo dalla cellula madre alle cellule figlie senza alterare il genotipo, ed i modi in cui l’espressione genica cambia durante il differenziamento cellulare. La comprensione di questi processi può avere un profondo impatto sulle nostre capacità di analizzare l’insorgenza e lo sviluppo di malattie, di tumori, dell’invecchiamento e del funzionamento delle cellule staminali, come evidenziato dal crescente interesse per “terapie epigenetiche” e “farmaci epigenetici". In particolare, inibitori della metilazione del DNA e della deacilazione degli istoni sono in uno stadio avanzato di sperimentazione clinico-oncologica. Pertanto, la comprensione del ruolo svolto da proteine coinvolte nella generazione dei percorsi epigenetici costituisce il razionale per lo sviluppo di strategie su cui basare terapie nuove ed efficaci.
La proposta qui introdotta è focalizzata sullo studio di un complesso multi-proteico coinvolto in processi di rimodellamento della cromatina e della trascrizione genica, caratterizzato dalla presenza delle proteine “C-terminal binding protein” (CtBP) e denominato “complesso CtBP” (ca. 1.5 MegaDa). In particolare, la recente scoperta dell’attività di co-repressore trascrizionale delle CtBP è stata messa in relazione con la loro capacità di agire come centro di aggregazione nella formazione di tale complesso, di cui fanno parte fattori essenziali per il riconoscimento di geni e per la modificazione coordinata degli istoni. Si ritiene che il complesso CtBP sia ancorato ad uno specifico promotore grazie alla sua interazione con un repressore trascrizionale che lega il DNA e che, allo stesso tempo, recluta gli enzimi che agiscono sulle code istoniche della cromatina trascrizionalmente attiva. L’azione concertata del riconoscimento e delle modificazioni enzimatiche converte la cromatina in una forma piu’ compatta e meno accessibile all’apparato trascrizionale.
I tre gruppi proponenti (due all’Universita’ di Milano, uno all’Universita’ di Pavia) intendono studiare il complesso CtBP sia da un punto di vista strutturale che funzionale, focalizzandosi sugli aspetti biochimici, meccanicistici e di riconoscimento, fondamentali in un campo con evidenti implicazioni biomediche e attualmente oggetto di vivace competizione internazionale. L’attività di ricerca si centrerà su due proteine chiave di tale complesso: una (CtBP) con un ruolo di assemblaggio strutturale e di reclutamento di partners, l’altra (LSD1) con un ruolo enzimatico di demetilazione degli istoni. Le proprietà molecolari e funzionali di questi e di altri potenziali componenti del complesso CtBP (per esempio TULP3) saranno investigate utilizzando approcci di biologia cellulare, biochimica, enzimologia, biofisica e biologia strutturale. La proposta si fonda sui risultati di recenti attività di ricerca, svolte sia in modo indipendente che congiunto nei tre laboratori proponenti. Queste ricerche preliminari hanno portato alla scoperta delle proprietà strutturali di CtBP, alla determinazione dell’attività istone-demetilasica di LSD1, e all’identificazione di TULP3 come possibile componente del complesso CtBP. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Martino Bolognesi Università degli Studi di MILANO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Scopo principale di questa proposta è stabilire consocenze avanzate relative alle basi strutturali e alla funzione di complessi proteici implicati nella regolazione della trascrizione tramite modifiche della cromatina. Sulla base di recenti studi condotti in collaborazione tra le UO proponenti, il progetto di ricerca pone domande specifiche sul ruolo e sulle proprietà di due proteine nucleari (CtBP e LSD1) coinvolte nella modifica degli istoni, quindi della cromatina. Su una scala di tempi più estesa, la serie di indagini proposta mira ad una comprensione approfondita dei processi epigenetici che sempre più risultano alla base di sviluppo, differenziamento e tumorigenesi.
Le attività specifiche svolte dalle tre UO (UNIMI-1, UNIPV-2, UNIMI-3) sono dettagliate nei Mod.B associati. Il progetto scaturisce da una precedente collaborazione scientifica tra UNIPV-2 e UNIMI-3, supportata da un progetto PRIN-2004, che ha portato alla scoperta dell’enzima LSD1. La ovvia connessione con le linee di ricerca attive presso UNIMI-1, riguardanti la caratterizzazione del complesso CtBP, ha suggerito la costituzione del network che presenta questa domanda. Collaborazioni scientifiche precedenti tra UNIMI-1 e UNIPV-2 sono ampiamente documentate in letteratura (v. www.rcsb.org/pdb).

Obiettivo_1. Strutture tridimensionali di Carboxyl-terminal binding proteins (CtBPs). Le CtBP sono proteine multifunzionali coinvolte nella regolazione genica, nella ristrutturazione del Golgi e nella formazione del ribbon sinaptico (Schaeper et al., 1995). Le CtBP localizzate nel nucleo agiscono da co-repressori della trascrizione reclutando, su specifiche sequenze geniche, proteine che legano il DNA ed enzimi che modellano la cromatina. Sono noti più di 20 fattori di trascrizione contenenti la sequenza Pro-X-Asp-Leu-Ser (PXDLS), attraverso la quale si legano a CtBP. L’attività co-repressiva di CtBP e’ regolata da NAD(H) (Zhang et al., 2002). Sono note strutture 3D di forme troncate di CtBP1 e di CtBP3 (t-CtBP, prive di 80 residui sul C-ter) (Kumar et al., 2002; Nardini et al., 2003). Intendiamo isolare, caratterizzare dal punto di vista biofisico, e determinare le strutture 3D di mutanti specifici di t-CtBP e della proteina intera, considerato che la zona C-ter contiene siti di modificazione post-traduzionale (SUMOilazione e fosforilazione) e di interazione con il dominio PDZ della nNOS. Scopo di queste indagini è la comprensione dei principi per il riconoscimento di cofattori e peptidi che regolano l’attività co-repressoria, assieme ai principi che determinano le transizioni ordine/disordine conformazionale e le modifiche nel dominio C-ter (Kagey et al., 2003; Zhang et al., 2003; 2005; Lin et al., 2003).

Obiettivo_2. Determinare la struttura 3D di CtBP in complesso con partner proteici. Si ritiene che l’attività co-repressiva di CtBP dipenda dalla sua capacità di oligomerizzare, agendo quindi da supporto per la formazione di un grosso complesso nucleare (ca. 1.5 x 10**6 Da) contenente tutti gli elementi per l’indirizzamento verso geni specifici, per la repressione della trascrizione (es. CoREST), e per la modifica coordinata di istoni (es. la proteina Zn-finger ZNF217, le istone deacteilasi 1 e 2, l’istone metiltrasferasi C9a, e l’istone demetilasi LSD1 - Shi et al., 2003). Nostro scopo primario è definire in dettaglio le basi molecolari dell’associazione di CtBP con partners cellulari proteici coinvolti nella regolazione e repressione della trascrizione e nella regolazione di CtBP (HIPK2, nNOS PDZ). Verranno svolte analisi cristallografiche su complessi di t-CtBP con partners selezionati, o con peptidi sintetici che mimino le proprietà di associazione a CtBP (Nardini et al., 2003). L’identificazione e caratterizzazione dei partners, precedente le indagini cristallografiche, verrà svolta con metodi biofisici (es. Biacore e microcalorimetria).

Obiettivo_3. Identificazione di nuovi target del complesso di co-repressione trascrizionale CtBP. Per studiare le molteplici funzioni del CtBP-complex abbiamo utilizzato come sonda molecolare CoREST (uno dei componenti proteici) allo scopo di identificare nuovi fattori di trascrizione che possano ricapitolare il ruolo del CtBP-complex in meccanismi di tumorigenesi e di crescita cellulare. Grazie ad un saggio di Due Ibridi in Lievito, abbiamo isolato il nuovo fattore di trascrizione TULP3 (Ikeda et al., 2002), e ne abbiamo dimostrato l’interazione con CoREST in vivo mediante un saggio di co-immunoprecipitazione in cellule di mammifero. TULP3 svolge un ruolo critico nello sviluppo del sistema nervoso, agendo come fattore di trascrizione che, localizzato sulla membrana plasmatica, migra nel nucleo in risposta a stimoli extracellulari (Santagata et al., 2001). Il nostro interesse è volto alla caratterizzazione dell’interazione tra TULP3 e CoREST, e altri componenti del complesso, in particolare CtBP. TULP3 contiene, infatti, la tipica sequenza consenso PXDLS riconosciuta da CtBP, il che rende il suo ruolo nel CtBP-complex ancora più significativo.

Obiettivo_4. Determinazione della struttura tridimensionale della istone demetilasi lisina-specifica (LSD1) umana. La scoperta della prima istone demetilasi ha rivoluzionato il concetto di metilazione degli istoni, che era considerata una modifica epigenetica statica e permanente (Bannister e Kouzarides, 2005). LSD1 demetila in modo specifico la Lys4 dell’istone H3 e la sua attività è modulata dalle varie modifiche epigenetiche presenti sul substrato istonico (Shi et al., 2004; Forneris et al., 2005a). Una tappa fondamentale verso la comprensione di queste proprietà funzionali è la determinazione della struttura tridimensionale della proteina. L’analisi cristallografica rivelerà gli elementi strutturali responsabili dell’elevata specificità di substrato che permette alla LSD1 di “interpretare” il codice istonico. Nei nostri laboratori abbiamo sviluppato protocolli per l’espressione della proteina ricombinante e per la sua cristallizzazione.

Obiettivo_5. Approfondimento dei nostri studi biochimici sulla LSD1 focalizzati sulla specificità di substrato e proprietà catalitiche della proteina. Gli aminoacidi N-terminali dell’istone H3 sono oggetto di varie modifiche epigenetiche (Jenuwein e Allis, 2001) e LSD1 è inattiva su peptidi istonici fosforilati su Ser10, e iperacetilati sulle lisine (Forneris et al, 2005b; Shi et al., 2005). Intendiamo verificare se la metilazione di residui di arginina (altro tipo di modifica epigenetica) influisce sulla attività della LSD1. L’enzima catalizza la demetilazione mediante un processo ossidativo flavina-dipendente che richiede un accettore di elettroni (Forneris et al., 2005a). Intendiamo studiare la cinetica della semi-reazione ossidativa di LSD1 utilizzando ossigeno e altri potenziali ossidanti, con lo scopo di chiarire la natura del substrato fisiologico che agisce come accettore di elettroni.

Obiettivo_6. Identificazione di inibitori di LSD1. Abbiamo scoperto che il peptide demetilato prodotto dalla reazione è un buon inibitore della LSD1 (Forneris et al., 2005b), e intendiamo perseguire studi mirati all’individuazione di peptidi inibitori. Un primo approccio sarà la sostituzione della Lys4 con aminoacidi in grado di migliorare l’affinità di legame e/o di reagire con il cofattore flavinico funzionando come inibitori covalenti. Un secondo approccio utilizzerà librerie chimiche per identificare piccole molecole in grado di fungere da composti guida per studi di “drug design”. Gli inibitori saranno analizzati mediante saggi in vitro (Forneris et al., 2005a) e saggi cellulari che rilevano alterazioni nell’attività di repressione di LSD1 e nella struttura della cromatina. La scoperta di inibitori avrà un forte impatto in quanto permetterà di verificare l’effetto dell’inibizione dell’attività demetilasica in vivo sia a livello di colture cellulari sia in modelli animali. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L’epigenetica si identifica con lo studio dei cambiamenti nella funzionalità del genoma che si realizzano senza modifiche del DNA e che permettono di trasmettere “pattern” di espressione genica da una cellula madre alle cellule figlie durante i processi di differenziamento. La particella nucleosomale è costituita da un assemblaggio compatto di DNA attorno all’ottamero istonico. Gli aminoacidi N-terminali degli istoni protrudono dal nucleosoma, formando delle code flessibili che sono bersaglio di varie modifiche epigenetiche post-traduzionali, quali metilazioni, fosforilazioni, acetilazioni e SUMOilazioni (Grunstein, 1997; Spotswood e Turner, 2002). Queste modifiche agiscono in modo combinatoriale formando una sorta di vocabolario cellulare per la regolazione dell’espressione genica (Jenuwein e Allis, 2001). Ciascun tipo cellulare è contraddistinto dal proprio pattern di modifiche epigenetiche che formano il cosiddetto “codice epigenetico”.
L’epigenetica ha un impatto formidabile su moltissimi aspetti della medicina molecolare (specialmente sul cancro e l’invecchiamento); per questi motivi si registra un crescente interesse per le terapie e i farmaci cosiddetti “epigenetici” (solo nei primi mesi del 2006 sono stati pubblicate due “review” importanti su questi argomenti; Yoo e Jones, 2006; Inche e La Thangue, 2006). Una prova del potenziale terapeutico dell’epigenetica è data dall’efficacia di inibitori che agiscono su vari processi di modifica della cromatina. In particolare, molecole che interferiscono con la metilazione del DNA e con le istoni deacetilasi sono in fase avanzata di valutazione clinica per il trattamento di tumori solidi. In questo ambito, è evidente che la comprensione delle funzioni specifiche degli enzimi coinvolti nei processi di rimodellamento e modifica della cromatina è essenziale per l’ideazione di nuovi ed efficaci approcci farmacologico-terapeutici che hanno come bersaglio i processi epigenetici.
Il presente programma di ricerca si centra sullo studio di un complesso multiproteico di dimensioni ragguardevoli coinvolto nel rimodellamento della cromatina (Shi et al., 2003). Le nostre attività mirano ad analizzare le proprietà strutturali e funzionali di questo complesso, migliorando le nostre conoscenze su un argomento di evidente rilevanza biomedica che è al centro di ricerche molto competitive a livello internazionale. Due proteine fondamentali di questo complesso, una funzionante nel suo assemblaggio (CtBP), e una nella modifica enzimatica degli istoni (LSD1), sono bersagli specifici della nostra ricerca. Le proprietà biologico-molecolari di CtBP e LSD1 e dei loro partner proteici (es. TULP3) sono introdotte e riassunte nei prossimi paragrafi.

UN COMPLESSO NUCLEARE PER LA MODIFICA DELLA CROMATINA
La recente scoperta dell’attivita’ co-repressiva delle Carboxyl-terminal binding protein (CtBP) nella trascrizione è stata correlata alla capacità della proteina di agregare in omo- o etero-dimeri, agendo quindi da supporto per la formazione di un complesso multiproteico (il CtBP-complex, 1.5 MegaDa). Il complesso raccoglie i componenti essenziali per l’indirizzamento a specifici geni e per la modifica coordinata degli istoni, garantendo così la repressione della trascrizione di geni specifici (Turner and Crossley, 2001; Chinnadurai, 2002, 2003; Shi et al., 2003). Approcci biochimici e proteomici hanno dimostrato che il CtBP-complex è costituto da almeno 22 proteine, raggruppabili in 4 classi funzionali principali: fattori di legame al DNA, enzimi per la modifica degli istoni (es. la istone demetilasi LSD1 (Forneris et al, 2005a, 2005b; Shi et al., 2004), le istone deacteilasi e metil-trasferasi), co-repressori della trascrizione (es. CoREST), e proteine contenenti cromo-domini (Shi et al., 2003). Si ritiene che, basandosi sull’insieme di queste attività, CtBP venga ancorata a specifici promotori tramite repressori che legano il DNA. Il CtBP-complex quindi recluta le diverse classi di enzimi in prossimità del sito di legame, agendo sulle estremità degli istoni presenti nella cromatina attiva. L’azione concertata dei diversi enzimi (e possibili altri fattori) converte la cromatina in una forma (compatta) tipica di uno stato represso dal punto di vista trascrizionale. Pertanto, CtBP svolge sia un ruolo strutturale, quale supporto e componente fondamentale del CtBP-complex, sia un ruolo di reclutatore, tramite il legame di proteine partner specifiche a siti definiti della propria superficie molecolare (Nardini et al., 2003).
La istone demetilasi-1 Lys-specifica (LSD1) è una componente del CtBP-complex, tipicamente associata a CoREST (una proteina co-repressore) e alle istone deacetilasi 1 e 2, a formare un modulo proteico conservato negli eucarioti superiori (Ballas et al., 2001; Battaglioli et al., 2002). Negli utlimi due anni sono stati identificati almeno otto complessi co-repressori della trascrizione contenenti il modulo LSD1/CoREST/HDAC1-2; una recente panoramica indica che questa nuova classe di complessi co-repressori agisce su una vasta serie di bersagli genici nell’uomo (http://bioinformatics.leeds.ac.uk/group/online//RE1db/re1db_home.htm ; Bruce, 2004). Il loro coinvolgimento nella trasformazione cellulare e’ sottolineato dalla associazione con fattori proteici codificati da oncogeni e soppressori di tumori (Humphrey et al., 2001).

a) PROPRIETA’ MOELCOLARI DI BASE DI CtBP
Dal punto di vista strutturale le CtBP sono composte da tre domini distinti (Nardini et al., 2003). Il domino di legame del substrato (ca. 155 residui, prevalentemente N-ter) è coinvolto nel legame di repressori della trascrizione tramite il riconoscimento della sequenza consenso PXDLS presente nei fattori stessi (Turner and Crossley, 2001). Il dominio di legame del nucleotide (ca. 195 residui) lega una molecola di NAD(H), che regola l’attività co-repressiva in funzione dell’equilibrio redox della cellula. Questa proprietà può avere un ruolo importante in cellule maligne, ove lo stato di ipossia (definente i livelli di NADH) può contribuire allo sviluppo di metastasi e all’evasione dai meccanismi di morte cellulare (Zhang et al., 2002; Fjeld et al., 2003). Il dominio C–ter di CtBP (ca. 90 residui), ritenuto svolgere un ruolo regolatorio, è bersaglio di modificazioni post-traduzionali. La fosforilazione di Ser422 nel dominio C-ter, da parte di HIPK2 attivata da UV, indirizza CtBP alla degradazione proteasomale. I bassi livelli di CtBP risultanti, similmente alla risposta cellulare all’attivazione di p53 ad opera di HIPK2, indirizzano le cellule verso l’apoptosi (Zhang et al., 2003; Zhang et al., 2005). La SUMOilazione al residuo Lys428 promuove la localizzazione nucleare di CtBP (Kagey et al., 2003); la SUMOilazione di CtBP è inibita dal legame del dominio PDZ di nNOS (Lin et al., 2003). Studi paralleli hanno dimostrato che nel citosol la isoforma CtBP3 partecipa alla frammentazione del complesso del Golgi durante la mitosi (Weigert et al., 1999; Hidalgo Carcedo et al., 2004), e al traffico intracellulare (Bonazzi et al., 2005).

b) PROPRIETÀ DI RICONOSCIMENTO MOLECOLARE DI CtBP
Finora sono state risolte le strutture tridimensionali di una forma troncata di CtBP1 umana e di CtBP3 di ratto (t-CtBP), entrambe costituite da due domini, chiamati “substrate-binding domain” e “nucleotide-binding domain” (Kumar et al., 2002; Nardini et al. 2003). Al contrario, la struttura della proteina completa, comprendente anche il dominio C-terminale (circa 80 residui) non è ancora stata caratterizzata strutturalmente. Un’analisi bioinformatica ed esperimenti di NMR, CD e SAXS sulla proteina CtBP3 di ratto (Nardini et al., 2006) hanno rivelato che la regione C-terminale della proteina è intrinsecamente disordinata, proprietà questa che potrebbe essere funzionale per il riconoscimento di differenti partners molecolari. Precedenti risultati da noi ottenuti sulla struttura di t-CtBP (Nardini et al., 2003) hanno dimostrato come i due domini di cui è composta (Fig. 1) definiscono, alla loro interfaccia, il sito di legame per il cofattore NAD+/NADH.


Il legame del cofattore stabilizza una struttura “chiusa” della proteina, che è fondamentale per la formazione della struttura quaternaria della proteina. Il dominio N-terminale ospita sulla superficie una tasca idrofobica dove si lega il peptide consenso PXDLS, presente in vari repressori di trascrizione, come dimostrato dalla struttura cristallografica da noi determinata di CtBP3 in complesso con il peptide sintetico PIDLSKK (Fig. 2). Un dimero di CtBP mostra due siti di legame per il peptide consenso PXDLS che, localizzati da parti opposte del dimero, facilitano l’interazione con fattori che legano il DNA e con enzimi che modificano la cromatina, entrambi dotati del peptide PXDLS.
c) CtBP-COMPLEX E TULP3
Il CtBP-complex svolge molteplici funzioni biologiche grazie alla coesistenza al suo interno di diverse attività enzimatiche e alla diversità dei fattori di trascrizione che lo impiegano per regolare la trascrizione di singoli geni target o di clusters di geni (Lunyack et al., 2002). Tra gli elementi del complesso sono stati identificati almeno due fattori coinvolti in interazioni con fattori di trascrizione: la stessa CtBP e CoREST. Allo scopo di studiare la funzione fisiologica del complesso, in particolare nel sistema nervoso, cerchiamo nuovi fattori di trascrizione che reclutino il CtBP-complex grazie ad un’interazione diretta con CoREST. Abbiamo analizzato una libreria di cDNA derivante da tessuto di cervello umano adulto utilizzando come sonda molecolare CoREST in un Saggio dei Due Ibridi in Lievito e abbiamo identificato, tra gli altri, un clone che contiene l’intera sequenza del gene che codifica per Tubby-like-protein 3, TULP3. TULP3 appartiene ad una nuova famiglia di fattori di trascrizione chiamata tubby (TUB and TULPs 1-3), che svolge un ruolo importante nel sistema nervoso (Ikeda et al., 2002). Mutazioni a carico del gene TULP1 nell’uomo sono associate a retinite pigmentosa (Hagstrom et al., 1998; Gu et al., 1998). La delezione di TULP3 causa letalità embrionale in topi che mostrano gravi difetti di chiusura del tubo neurale (NTD) e morte di cellule neuroepiteliari (Ikeda et al., 2001).
Le proteine della famiglia “Tubby” appartengono ad una nuova classe di fattori di trascrizione che è associata ai meccanismi di segnalazione delle proteine G (Boggon et al., 1999). In particolare, per TUB e TULP3 è stato dimostrato che sono ancorate alla membrana plasmatica grazie ad un legame diretto con il fosfatidil inositolo 4-5 bifosfato. L’attivazione di recettori associati a proteine della famiglia Galphaq induce la traslocazione delle proteine TUB e TULP3 dalla membrana plasmatica al nucleo mediante l’azione della fosfolipasi B-beta (Santagata et al., 1999). Tutte le caratteristiche fin qui descritte e le proprietà funzionali di TULP3, suggeriscono che la sua associazione con il CtBP-complex possa essere un sistema estremamente interessante ed unico per lo studio dei meccanismi di comunicazione tra l’esterno della cellula e la regolazione della trascrizione mediante variazioni della struttura della cromatina.

d) LSD1 E I SUOI PARTNER PROTEICI
La metilazione delle lisine è uno degli elementi che definiscono il codice istonico, essendo correlata sia ad attivazione sia a repressione in funzione del sito di metilazione (Biel et al., 2005). L’apparente stabilità di questa modifica post-traduzionale negli estratti nucleari portò alla convinzione che la metilazione degli istoni fosse una modifica permanente. La ricerca di un enzima in grado di catalizzare la demetilazione degli istoni cominciò più di 40 anni fa (Kim et al., 1964), e per più di 30 anni le istone demetilasi sono rimaste una sorta di oggetto misterioso, sulla cui esistenza era diffuso un certo scetticismo (Bannister et al., 2002). La scoperta della prima istone demetilasi lisina-specifica (Shi et al., 2004; Forneris et al., 2005a) ha definitivamente dimostrato che, analogamente all’acetilazione, anche la metilazione degli istoni è un processo dinamico, reversibile e soggetto a regolazione.

d.1 – Scoperta della prima istone demetilasi lisina-specifica.
I nostri gruppi (finanziamento PRIN04) ed il gruppo di Y. Shi (Harvard) hanno indipendentemente dimostrato che LSD1 è un’istone demetilasi lisina-specifica (Fig. 3), una scoperta fondamentale nel settore della biologia della cromatina (Shi et al., 2004; Forneris et al., 2005a).


La LSD1 umana consiste di 886 aminoacidi e comprende una regione N-terminale probabilmente non-strutturata, un dominio SWIRM e un dominio flavinico C-terminale che è debolmente omologo agli enzimi della famiglia delle amine ossidasi. Abbiamo dimostrato che peptidi corrispondenti ai 21 aminoacidi N-terminali dell’istone H3 umano metilato sulla Lys4 reagiscono con l’enzima causando la riduzione del cofattore flavinico (Fig. 4). Questa osservazione ha rivelato che LSD1 è una istone demetilasi specifica per la Lys4 di H3 in quanto nessun altro tra i peptidi analizzati reagisce con la proteina. Inoltre, questi esperimenti hanno indicato che la demetilazione è realizzata mediante l’ossidazione del gruppo N-metile con produzione di un intermedio iminico, che viene successivamente idrolizzato a generare il peptide demetilato, e formaldeide (Fig. 3). E’ stato anche dimostrato che LSD1 è ugualmente attiva su peptidi mono- e di-metilati suggerendo che la funzione in vivo di LSD1 è probabilmente quella di “azzerare” lo stato di metilazione della Lys4 (Shi et al., 2004). Il completamento del ciclo catalitico richiede la riossidazione della flavina (Fig. 3). Mediante un saggio accoppiato con l’enzima perossidasi, abbiamo dimostrato che la LSD1 è in grado di impiegare l’ossigeno molecolare come accettore di elettroni (Fig. 3 e 5). Peraltro, abbiamo anche notato che la reattività con l’ossigeno non è particolarmente marcata se comparata a quella di altre ossidasi flavina-dipendenti, suggerendo che l’ossigeno non è necessariamente l’accettore di elettroni fisiologico ma che altre molecole possono svolgere questa funzione (Forneris et al., 2005a).


d.2 – La LSD1 “interpreta” il codice istonico
La coda N-terminale di H3 è contraddistinta dalla presenza di numerose modifiche covalenti. Di particolare importanza sono gli aminoacidi Lys4, Lys9 e Ser10 che costituiscono i siti delle modifiche epigenetiche maggiormente studiate. Un problema centrale era quello di comprendere come e se queste modifiche alterino l’attività di LSD1. In un articolo recentemente pubblicato abbiamo dimostrato che LSD1 riconosce un segmento esteso di H3 comprendente i 21 aminoacidi N-terminali della proteina (Fig.3). Inoltre, si è visto che l’acetilazione della Lys9 aumenta di circa 6 volte la Km per il substrato, mentre la fosforilazione della Ser10 abolisce completamente il legame (Fig. 6). Una conclusione fondamentale che emerge da questi studi è che LSD1 è capace di “interpretare” il codice istonico discriminando tra le varie modifiche covalenti al punto tale che una singola modifica epigenetica può rendere l’enzima incapace di agire sul substrato. Uno degli obiettivi del nostro progetto è l’approfondimento di queste proprietà fondamentali, e della loro modulazione da parte dei partner proteici associati all’enzima, nel riconoscimento del substrato da parte di LSD1 (Shi et al., 2005; Metzger et al., 2005) (CoREST, HDAC 1 e 2).
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