RICERCA ITALIANA     

RETI GENETICO-MOLECOLARI NELLO SVILUPPO NEURALE: DAL DIFFERENZIAMENTO ALLA FUNZIONE

Università di Pisa

Abstract

Questo progetto è la naturale prosecuzione, con significativi nuovi contributi, del programma PRIN svolto con successo nel 2004-2006, come è dimostrato dalle pubblicazioni e dai risultati preliminari qui presentati, che testimoniano il raggiungimento degli obiettivi allora proposti. Ciò permette ora a questa rete di laboratori di affrontare domande che sono al cuore della neurobiologia dello sviluppo, ancora riguardanti principalmente (ma non solo) il SNC e la retina dei Vertebrati. Il presente programma affronta infatti domande quali la relazione funzionale tra ciclo cellulare e differenziamento (pre-requisito per la comprensione della biologia delle cellule staminali); la conservazione di una rete molecolare comune nello sviluppo e nella rigenerazione; il mantenimento di vie molecolari comuni nel controllo di tipi diversi di apoptosi, nello sviluppo e nelle degenerazioni retiniche; il ruolo di interazioni tra proteine nel differenziamento neuronale. Come nel programma precedente, la diversità di organismi/sistemi disponibili nella nostra rete permetterà di adottare il miglior modello per un preciso obiettivo e, in qualche caso, di mettere in luce vie/meccanismi comuni conservati nell’evoluzione. Questo programma si basa su approcci tecnologici di alto livello, come l’analisi del Trascrittoma per “microarray”, del Proteoma per MALDI-Tof, dei microRNA mediante appositi “miRNA-chip”. Inoltre, trae vantaggio dall’alto grado di interazione tra le diverse Unità Operative, che si incontrano per una discussione generale una volta l’anno e scambiano continuamente materiali, protocolli e competenze sulle tecnologie del DNA ricombinante, selezione e produzione di anticorpi monoclonali, ibridazione in situ, micro-manipolazione di embrioni, analisi elettrofisiologiche, lipofezione in vivo e saggi biochimici per interazioni tra proteine.
Saranno investigati i seguenti aspetti:
RELAZIONE TRA MACCHINARIO DEL CICLO CELLULARE E GENI DEL DESTINO CELLULARE
In Dictyostelium discoideum, un organismo uni/multicellulare molto semplice, analizzeremo le relazioni funzionali tra i geni antiproliferativi Rb e PC3 ed i geni “homeobox” recentemente scoperti. Nella retina in sviluppo di Xenopus, caratterizzeremo la natura molecolare dell’”orologio” dipendente dal ciclo cellulare, che genera sequenzialmente i diversi tipi neuronali della retina regolando la traduzione di cruciali fattori di trascrizione “homeobox”; indagheremo anche sulle relazioni funzionali dell’orologio con il gene Xrx1, che sostiene la proliferazione e la multipotenza dei progenitori retinici.
CONDIVISIONE DELLE RETI MOLECOLARI CHE REGOLANO SVILUPPO E RIGENERAZIONE NEL SISTEMA NERVOSO
Chiariremo se la rigenerazione ed il transdifferenziamento coinvolgono la ri-espressione di geni embrionali e se il decremento della capacità rigenerativa con il tempo sia correlato alla diminuita capacità delle cellule staminali di esprimere geni embrionali.
L’APOPTOSI NELLO SVILUPPO NEURALE E NELLA NEURODEGENERAZIONE
Indagheremo sull’esistenza di un comune “pathway” tra differenti tipi di neurodegenerazione dei fotorecettori retinici. In modelli murini di degenerazione retinica, studieremo il ruolo della funzione mitocondriale, lo sviluppo della funzione visiva e della circuiteria retinica, e l’efficacia di strategie neuroprotettive che prevengono efficientemente i danni da luce ad alta intensità.
RUOLO DELLE INTERAZIONI PROTEINA-PROTEINA NEL DIFFERENZIAMENTO NEURONALE
Studieremo le interazioni tra i componenti di tre rilevanti complessi multi proteici: 1) il complesso mediato dal distroglicano; 2) i complessi mediati da varie isoforme della proteina PATJ/CIPP/; 3) il complesso mediato da ARMS. Questi tre complessi sono coinvolti in meccanismi di adesione, polarità e rimodellamento di cellule e strutture neurali cruciali per la proliferazione cellulare, la scelta del destino differenziativo e la migrazione di cellule neurali in sviluppo. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giuseppina Barsacchi Università degli Studi di PISA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo di questo progetto è quello di contribuire ad una migliore comprensione dei meccanismi che costruiscono e riparano il cervello. L’uso di diversi sistemi modello - quali Dictyostelium discoideum (Dd), Danio rerio (Dr, il pesce zebra), la rana Xenopus laevis (Xl) ed il ratto, oltre a colture cellulari -, ci permetterà di utilizzare il sistema più appropriato per l’analisi di ciascun processo. In alcuni casi sarà anche possibile caratterizzare i meccanismi molecolari di base implicati nello sviluppo, rigenerazione e sopravvivenza delle cellule nervose, conservati durante l’evoluzione. La presente domanda è il proseguo naturale di un progetto precedentemente finanziato, i cui obiettivi sono stati ampiamente raggiunti dal consorzio. Vorremmo analizzare alcuni argomenti fondamentali che i) sono stati messi in evidenza dal completamento degli obiettivi precedenti, ii) sono collegati alle competenze culturali e tecniche delle diverse UO.

LEGAMI FUNZIONALI TRA CICLO CELLULARE E DESTINO DIFFERENZIATIVO IN CELLULE NERVOSE IN SVILUPPO ED IN DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM (UO Barsacchi, Ceccarelli)
Il nostro scopo è quello di caratterizzare un “pathway” minimo, evolutivamente conservato, che colleghi ciclo cellulare e destino differenziativo. Sfrutteremo la capacità di Dd di generare aggregati multicellulari, mancanti di proliferazione ma provvisti di “pattern”, al fine di analizzare le interazioni funzionali tra Retinoblastoma (Rb, un componente rilevante del macchinario del ciclo cellulare) e fattori di trascrizione “homeobox”: queste interazioni non dipenderanno dal passaggio attraverso il ciclo cellulare. In Dd analizzeremo i) il ruolo della progressione del ciclo cellulare nell’indurre l’espressione di Rb, ii) il ruolo di Rb nel controllo della regolazione dei geni “homeobox”, iii) il ruolo del gene neurale antiproliferativo PC3, conservato in Dd.
Nella retina di Xenopus analizzeremo se la lunghezza del ciclo cellulare sia in grado di influenzare il destino differenziativo dei progenitori retinici. Abbiamo infatti individuato un "orologio" cellulare retinico che dipende dal ciclo cellulare e che indirizza i progenitori verso uno specifico destino neuronale regolando la traduzione di fattori chiave “homeobox”. Uno dei nostri principali obiettivi è la caratterizzazione molecolare di questo orologio. Cercheremo nuovi fattori “homeobox” regolati a livello traduzionale. Selezioneremo micro-RNA - piccoli RNA responsabili del controllo traduzionale di circa il 20% dei geni eucariotici -, o ribo-nucleo-proteine, che possano essere responsabili del controllo traduzionale dei geni "homeobox". Infine, analizzeremo gli eventuali legami tra i repressori traduzionali, la progressione attraverso il ciclo cellulare ed il gene Xrx1, che promuove la proliferazione e la multipotenza dei progenitori retinici.

CONSERVAZIONE DELLA RETE DI INTERAZIONI MOLECOLARI TRA SVILUPPO E RIGENERAZIONE NEURALE (UO Filoni)
Ad oggi non è noto se la neurogenesi postembrionale, come quella osservata negli Anfibi anuri in processi di rigenerazione del Sistema Nervoso Centrale (SNC) e nel transdifferenziamento retinogeno, comporti una riattivazione di geni implicati nella neurogenesi embrionale, o se utilizzi geni rigenerazione–specifici. Analizzeremo l’espressione genica nei processi rigenerativi di diverse regioni del SNC e nel processo di transdifferenziamento retinogeno dell'epitelio pigmentato della retina e dell'iride, al fine di capire se i) la rigenerazione ed il transdifferenziamento comportino la riespressione dei geni che controllano lo sviluppo del SNC e della retina, ii) il decremento della capacità rigenerativa delle varie regioni encefaliche nel corso della vita larvale e dopo la metamorfosi sia correlato con una decrescente capacità delle cellule staminali ad esprimere i geni neurogenici embrionali.

L’APOPTOSI NELLO SVILUPPO NEURALE E NELLA NEURODEGENERAZIONE (UO Bisti)
La morte cellulare programmata (apoptosi) svolge un ruolo fondamentale sia nella formazione delle reti neurali durante lo sviluppo, che nella morte dei neuroni durante la neurodegenerazione. I mitocondri svolgono un ruolo chiave nella morte cellulare indotta da danno. Analizzeremo se esiste una via comune nella neurodegenerazione dipendente dall’età dei fotorecettori, da cause genetiche o indotta da danno. Studieremo i) la relazione tra funzione mitocondriale e morte e/o sopravvivenza del fotorecettore in modelli animali di neurodegenerazione retinica, ii) lo sviluppo della funzione visiva e della circuiteria retinica in modelli animali di neurodegenerazione retinica, iii) verificheremo se le strategie di neuroprotezione efficaci nel danno da luce siano applicabili ad altri modelli animali di neurodegenerazione retinica.

RUOLO DELLE INTERAZIONI PROTEINA-PROTEINA NELLA GENERAZIONE DELLA DIVERSITA' DELLE CELLULE NERVOSE (UO Dente)
Proponiamo di studiare le interazioni tra i componenti di complessi multiproteici implicati in fenomeni di adesione, polarità e rimodellamento di strutture cellulari, fenomeni che influenzano fortemente la proliferazione, la scelta del destino e la migrazione di cellule nervose in sviluppo. I complessi che studieremo sono i) il complesso mediato dal distroglicano, un recettore transmembrana di cellule polarizzate che connette proteine della matrice extracellulare al citoscheletro, ii) il complesso mediato dalle varie isoforme di PATJ/CIPP, una proteina PDZ potenzialmente coinvolta nella formazione di spine dendritiche e prolungamenti assonici, iii) il complesso mediato da ARMS, una proteina transmembrana conservata nell'evoluzione, che funziona da impalcatura per reclutare recettori di neurotrofine ed efrine e i loro mediatori della trasduzione del segnale. Questi tre complessi sono strettamente correlati e spesso comprendono le stesse proteine. In particolare, caratterizzeremo l’elemento centrale di ciascun complesso, che funziona come struttura di sostegno al fine di collegare diversi enzimi, recettori ed adattatori e di modulare i processi cellulari di sviluppo.

INTERAZIONI METODOLOGICHE TRA LE UO
Uno degli obiettivi principali del nostro consorzio è la condivisione di competenze culturali e tecniche ben consolidate delle diverse UO. Il presente progetto dipende strettamente da questa interazione, che quindi viene a costituire uno scopo comune.
Tecnologie principali condivise:
UO Barsacchi - Ibridazione in situ, marcatori dello sviluppo neurale, analisi di microarray “GeneChip”
UO Filoni – “Screening” e produzione di anticorpi monoclonali
UO Ceccarelli - MALDI-Tof, DNA ricombinante
UO Dente - Saggi biochimici di interazione proteine-proteine
UO Bisti - Registrazioni elettrofisiologiche <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

1. LA TRANSIZIONE PROLIFERAZIONE/DIFFERENZIAMENTO:

A. NELLO SVILUPPO DELLA RETINA DI XENOPUS
Come orchestrare proliferazione e differenziamento nello sviluppo è essenziale al fine di generare cellule diverse nelle corrette proporzioni ed organi di giuste dimensioni. La comprensione di questo problema è il pre-requisito per capire come indirizzare le cellule staminali verso destini specifici a fini terapeutici.
Nell’embriogenesi delle strutture nervose vengono generati tipi neuronali diversi in tempi ben precisi (1). I meccanismi molecolari che collegano il tipo di neurone con il momento della sua formazione sono analizzati in Drosophila (2,3), ma non sono noti nei Vertebrati. Nella retina dei Vertebrati, i sei tipi principali di neuroni (gangliari, orizzontali, coni, amacrine, bastoncelli e bipolari) sono generati sequenzialmente da progenitori pluripotenti (1). La conservazione evolutiva di questa “timing schedule” suggerisce che sia stato selezionato un meccanismo molecolare che coordina la “data di nascita” di una cellula (il momento della sua uscita dal ciclo cellulare) e la specificazione di un determinato destino neuronale.
L’Unità BARSACCHI ha caratterizzato Xrx1, un gene chiave che collega il macchinario del ciclo cellulare al differenziamento neuronale in Xenopus (4,5). Ha inoltre mostrato che i geni “homeobox” Xotx5b e Xotx2 sono necessari e sufficienti a generare, rispettivamente, fotorecettori e cellule bipolari (6) e che anche Xvsx1 è implicato nella formazione di cellule bipolari. Fotorecettori e cellule bipolari hanno date di nascita tardive. Per capire il “timing” neurogenetico nella retina occorre quindi capire come e quando siano prodotti fattori di trascrizione come Xotx5b, Xotx2 e Xvsx1. L’Unità BARSACCHI ha recentemente dimostrato che l’attività di Xotx5b, Xvsx1 e Xotx2 è regolata a livello post-trascrizionale. Le regioni 3’ non tradotte (3’UTR) dei corrispondenti mRNA contengono segnali “cis-acting” sufficienti per la regolazione della traduzione (Mod. B; cfr. 7,8). Ad oggi, poco si sa su una possibile implicazione del controllo traduzionale nella determinazione di destini cellulari neurali.
Almeno 20% dei geni dei Vertebrati contengono nelle loro 3’UTR corte regioni altamente conservate, complementari a microRNA (miRNA) (9). I miRNA agiscono sia degradando l’mRNA bersaglio, sia inibendone la traduzione, e controllano così molti eventi di sviluppo, quali proliferazione, differenziamento ed apoptosi; in particolare sono implicati nel controllo del “timing” dell’espressione genica (10). Essi potrebbero quindi essere degli ottimi candidati come regolatori del controllo traduzionale di Xotx5b, Xotx2, Xvsx1. Una possibilità alternativa è che il controllo traduzionale sia dovuto a specifiche proteine leganti RNA. Le due possibilità non si escludono a vicenda ed i due meccanismi potrebbero cooperare (11).
Nuove evidenze suggeriscono che, al fine di maturare la competenza per generare tipi cellulari retinici tardivi, sia necessaria anche una progressione a lungo termine nel ciclo cellulare (12; v. Mod. B). Questi risultati preliminari suggeriscono che i geni “homeobox” siano effettori di un orologio cellulare dipendente dalla progressione attraverso il ciclo. Se così fosse, teoricamente il destino di una cellula staminale potrebbe essere cambiato attivando le giuste molecole chiave, gli effettori dell'orologio, una volta identificati.

B. NELLA NEUROGENESI POST-EMBRIONALE E NELLA RIGENERAZIONE DEL SNC
La neurogenesi non termina con lo sviluppo embrionale. In tutte le classi dei Vertebrati sono presenti cellule indifferenziate e proliferanti (staminali), localizzate in aree del sistema nervoso centrale (SNC) denominate "aree matrici", capaci di dare origine a nuovi neuroni e cellule gliali nel corso della vita post-embrionale e nell'adulto (v. 13). L'estensione delle aree matrici è correlata con la capacità di rigenerare nuovi neuroni in seguito a lesione. Infatti, tale capacità rigenerativa è notevole nei Teleostei e negli Anfibi urodeli, dove ampie aree matrici sono distribuite nelle varie regioni encefaliche, mentre è estremamente ridotta nei Mammiferi, che possiedono esigue aree matrici limitate a due sole regioni encefaliche (bulbo olfattivo e telencefalo dorsale) (13-15). Negli Anfibi Anuri (Xenopus laevis), il decremento della capacità rigenerativa del SNC nel corso della vita larvale e dopo la metamorfosi è correlato con la graduale diminuzione dell'estensione delle aree matrici (16). Pertanto l'identificazione dei meccanismi cellulari coinvolti nella rigenerazione neuronale durante la vita larvale e dopo la metamorfosi degli Anuri, non solo può fornire risposte a questioni biologiche fondamentali, ma potrebbe contribuire ad individuare le cause limitanti la neurogenesi post-embrionale nei Mammiferi.
Le larve di Xenopus laevis rappresentano un modello sperimentale utile non solo per studiare la neurogenesi post-embrionale in seguito a proliferazione e differenziamento di cellule staminali, ma anche in seguito a sdifferenziamento e transdifferenziamento di cellule differenziate. Infatti tali larve possono rigenerare la retina neurale per transdifferenziamento dell'epitelio pigmentato retinico (RPE): questo processo è promosso dal fattore di crescita dei fibroblasti basico (FGF2) prodotto dalla retina neurale residua (17). Un analogo processo di transdifferenziamento retinogeno può avvenire anche a carico dell'epitelio pigmentato dell'iride (IPE) (18). Tale transdifferenziamento è indotto non solo dalla retina neurale, ma anche dal blastema rigenerativo dell'arto larvale le cui cellule mesenchimatiche producono FGF2 (19).
Attualmente non è noto se la neurogenesi che si osserva durante la rigenerazione delle varie regioni del SNC e il transdifferenziamento retinogeno degli Anuri comporti la riattivazione degli stessi geni che operano durante lo sviluppo delle varie regioni del sistema nervoso centrale (es. Rx1, Otx2, Pax6, En2, Krox20, Notch1, Delta1, Dach; 20-22), o l'attivazione di geni specifici per la rigenerazione.
Varie ricerche indicano che un gradiente di acido retinoico (RA) è responsabile della morfogenesi antero-posteriore del SNC (es. 23). L’acido retinoico è anche implicato nella determinazione dell’asimmetria dorso-ventrale della retina in sviluppo (24). Finora, non sono state effettuate ricerche sull’effetto dell’acido retinoico sulla rigenerazione del Sistema Nervoso Centrale e sul transdifferenziamento retinico.

C. IN DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
La coordinazione tra proliferazione e differenziamento presenta modalità diverse: in taluni casi la continua proliferazione permette il mantenimento di cellule multipotenti ed insieme la nascita di cellule il cui il destino differenziativo è, almeno in parte, determinato (es. il sistema nervoso centrale e periferico in Drosophila, la corteccia cerebrale e la retina nei Vertebrati; 25,26); in altri la determinazione segue, anziché accompagnare, una fase di intensa proliferazione (es. i dischi imaginali in Drosophila, l’embriogenesi precoce nei mammiferi; 27). Ciò suggerisce che differenti fasi del ciclo cellulare, e/o cicli cellulari con strutture differenti, possano regolare in modo specifico i vari destini differenziativi. In particolare sembra che la fase S sia importante per la determinazione e G1 per il differenziamento terminale (es. 28). Non solo quindi la progressione nel ciclo cellulare, ma anche specifiche fasi del ciclo possono agire come regolatori di differenziamento.
Anche in eucarioti unicellulari, come Dictyostelium discoideum (D.d.), è stata osservata una stretta relazione fra ciclo celllulare e destino differenziativo, le cui basi molecolari finora non sono state chiarite (29). D.d. è sorprendentemente dotato di geni oncosoppressori (Rb, E2F, etc.), nonostante l’assenza di proliferazione nella fase multicellulare. In collaborazione con l’Unità BARSACCHI, L’Unità CECCARELLI ha intrapreso lo studio del ruolo di questi geni ipotizzando che essi svolgano una funzione ancestrale di controllo del destino differenziativo e che l’attuale funzione di oncosoppressori sia emersa con la comparsa dei metazoi.
D.d. attraversa una fase del ciclo vitale sotto forma di organismo pluricellulare (corpo fruttifero): questo acquisisce la pluricellularità grazie all’aggregazione di molte cellule uguali. Il corpo fruttifero ha vita limitata ed è principalmente composto da spore che germinando reinizieranno il ciclo vitale. Nonostante la morfogenesi non comprenda proliferazione, e la generazione di un “pattern” differenziativo non richieda un controllo antiproliferativo, D.d. è comunque dotato di un macchinario del ciclo cellulare (CCM) paragonabile a quello dei Vertebrati. Con il lavoro del progetto PRIN 2004, abbiamo definito il ruolo del gene rblA, ortologo di Rb, nel controllo del destino differenziativo in D.d. (30; Conte et al., in prep.). I risultati ottenuti rinforzano l’idea dell’esistenza di una rete fra geni del CCM e geni del fato differenziativo. I due sistemi a confronto – Dictyostelium e retina di Xenopus – promettono di rivelare aspetti importanti di questa rete.
Il genoma di D.d., ora annotato per circa il 50% dei geni, possiede 13 geni con “homeobox”, di cui solo uno è finora caratterizzato (31). L’Unità CECCARELLI lavora a chiarire se essi possiedano un ruolo omeotico (selezione del fato) e quale sia la relazione tra il loro eventuale ruolo ed il ciclo cellulare.

2. APOPTOSI NELLA NEURODEGENERAZIONE RETINICA
Sia lo sviluppo che lo stadio adulto di un organismo dipendono non solo da proliferazione e differenziamento, ma anche da un programma di morte cellulare, che garantisca la corretta maturazione e funzione degli organi. Nell'adulto è richiesto un bilanciamento fra proliferazione e morte cellulare programmata (apoptosi) per mantenere l'omeostasi tissutale e rimuovere le cellule compromesse. L'apoptosi è coinvolta in molte malattie neurodegenerative (Alzheimer, Parkinson; 32); nella retina ha un ruolo principale nella perdita dei fotorecettori nelle degenerazioni come la retinite pigmentosa (RP) (33,34) o la degenerazione maculare legata all’età (DMLE) (35). La DMLE è il risultato dell'interazione di molte componenti, tra cui mutazioni genetiche, stress metabolici e fattori ambientali, con il risultato finale di morte per apoptosi (36). Non è ancora noto quale sia l'anello di congiunzione fra le mutazioni geniche e gli eventi cellulari e molecolari che determinano la morte cellulare, un pre-requisito per intervenire con possibili terapie (37).
Nell'ambito della ricerca di base sono disponibili modelli animali che rispecchiano le degenerazioni umane, ma i modelli per la DMLE sono rari e mancano quelli per le forme più complesse di degenerazione retinica. Recentemente si è cercato di sviluppare diverse strategie sperimentali per preservare le funzioni visive o mantenendo in vita i neuroni o sostituendoli con cellule staminali o con supporti biotecnologici (38). Gli approcci più promettenti sembrano essere la neuroprotezione e la terapia genica. L’autoprotezione del sistema nervoso maturo coinvolge il rilascio di fattori trofici e citochine, che attivano segnali intracellulari (39). Il fattore neurotrofico ciliare (CNTF) e il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2) sono i due principali fattori coinvolti nella risposta al danno (40). I loro recettori di membrana sono localizzati in posizione strategica ed aumentano in seguito a stress. L'attivazione di meccanismi di autoprotezione è una delle strategie utilizzate per evitare la morte dei fotorecettori in seguito al danno da luce (35), anche se il meccanismo non è completamente chiarito. Vari trattamenti e composti (es. antiossidanti) sembrano prevenire, anche se parzialmente, la degenerazione retinica in modelli animali di RP (41). Con poche eccezioni, tuttavia, l'efficacia è relativa e i meccanismi non sono identificati. Nell’uomo, il risultato migliore è un rallentamento della degenerazione. Il recupero della morfologia del fotorecettore non è necessariamente correlato al recupero della sua funzione (42). Stimoli apoptotici differenti, che attivano vie di morte differenti, potrebbero richiedere strategie di recupero differenti o anche una combinazione di diverse strategie (ref. in 37).Negli ultimi anni si è cominciato a discutere sul ruolo giocato dalla nutrizione sul manifestarsi e il progredire di malattie retiniche, ma la materia è ancora controversa (43). L’Unità BISTI ha recentemente dimostrato che la morte indotta da esposizione a luci di alta intensità può essere notevolmente ridotta se la dieta viene implementata con dosi giornaliere di zafferano (44).

3. INTERAZIONI TRA PROTEINE NEL DIFFERENZIAMENTO NEURONALE
Le interazioni proteina-proteina, mediate da domini di legame altamente specifici, influenzano la polarità ed il differenziamento cellulare. Le cellule neuronali sono polarizzate fin dai primi stadi di sviluppo. Sia nel cervello che nella retina i nuclei delle cellule proliferanti si dividono nella parte apicale del neuroepitelio e le cellule post-mitotiche migrano quindi verso la destinazione finale nei diversi strati. Negli ultimi anni, specifici determinanti della polarità e segnali guida della migrazione sono stati caratterizzati in Drosophila e “zebrafish”, ma molti aspetti sono da chiarire e da estendere ai Vertebrati superiori (45).
Nella regione apico/laterale dei fotorecettori o delle cellule epiteliali di Drosophila sono stati caratterizzati i complessi proteici “CRB”, “BAZ” e “SCR”. Le proteine interagenti spesso possiedono domini di legame PDZ, che mediano la formazione di intricate reti proteiche (46). Nel complesso CRB di Drosophila, la proteina Crb è essenziale per l'adesione e la polarità dei fotorecettori, mentre la proteina dPATJ è coinvolta nella morfogenesi dei fotorecettori e nel prevenirne la degenerazione nell’adulto (47). I geni ortologhi nell’uomo potrebbero svolgere un ruolo simile: infatti, mutazioni del gene umano CRB-1 sono associate a malformazioni retiniche, quali la retinite pigmentosa 12 (RP12) e la amaurosi congenita di Leber (LCA) (48).
L’Unità DENTE ha caratterizzato le potenzialità di legame di ciascun dominio PDZ dell’omologo umano di dPATJ (PATJ/CIPP/INADL) (49) ed ha isolato dal cervello di topo proteine che interagiscono con i singoli domini. Queste proteine sono coinvolte nella formazione delle spine dendritiche e dei prolungamenti assonici. In questo progetto proponiamo di verificare in vivo tali interazioni.
Proponiamo inoltre di studiare un altro complesso localizzato a livello basale nei precursori neuroepiteliali, con potenziale ruolo nella polarità cellulare (50). Il componente centrale, il distroglicano (DG), interagisce con varie proteine associate alla distrofina, la cui localizzazione è alterata nelle distrofie muscolari e in casi di degenerazioni retiniche e neuronali. L’Unità DENTE, in collaborazione con l'Unità BARSACCHI, ha mostrato che in Xenopus il DG preserva l’adesione tra lamina basale e ILM nella retina in sviluppo; inoltre la sua mancanza provoca un’anomala formazione dei vari strati retinici (51,52). Tale fenotipo retinico è simile a quello di mutanti della polarità di “zebra fish” (53).
L’Unità DENTE propone infine di caratterizzare un terzo complesso proteico coinvolto nei processi di rimodellamento strutturale delle cellule neuronali, mediato dalla proteina ARMS (“ankyrin repeat-rich membrane spanning”): ARMS è conservata nell’evoluzione e funziona reclutando recettori di neurotrofine ed efrine, ed i mediatori della loro trasduzione del segnale (54,55). L’Unità DENTE ha identificato una potenziale interazione tra ARMS e la proteina VSP, inizialmente identificata nel pesce zebra per la sua espressione sul lato ventrale della retina in sviluppo e studiata, nel pesce zebra e in Xenopus, dall’Unità BARSACCHI. <<<