RICERCA ITALIANA     

Fattori di trascrizione e neurotrasmettitori nel differenziamento neurale: aspetti molecolari, funzionali ed evolutivi

Università degli Studi di Genova

Abstract

Il nostro progetto di ricerca si propone di studiare organismi modello quali i protocordati anfiosso (Branchiostoma floridae) e ascidia (Ciona intestinalis) e i vertebrati Xenopus laevis e topo. Su questi modelli verranno condotti studi volti a definire alcuni aspetti molecolari coinvolti nel differenziamento dei neuroni serotonergici, gabaergici, catecolaminergici e colinergici. Su alcuni di questi modelli verranno caratterizzati e clonati i geni codificanti recettori serotonergici. Successivamente tali recettori verranno analizzati dal punto di vista farmacologico e strutturale. Inoltre, saranno utilizzati topi transgenici come strumenti genetici per comprendere il ruolo morfogenetico della serotonina nello sviluppo del sistema nervoso. Verranno studiati alcuni elementi chiave coinvolti nel pathway del fenotipo neurotrasmettitoriale, quali enzimi biosintetici e trasportatori. Alla luce dell’affascinante ma ancora poco studiata funzione del neurotrasmettitore come molecola segnale durante l’embriogenesi, ci sembra interessante esplorare i possibili ruoli dei differenti neurotrasmettitori nel controllo della morfogenesi sia in modelli in vivo che in vitro. Pertanto, studi saranno condotti al fine di dimostrare la capacità dei neurotrasmettitori di indurre un differenziamento neuronale in differenti linee cellulari quali una linea di neuroblastoma (N18TG2), colture di neuroni sensoriali (DRG), una linea immortalizzata derivata dallo striato (ST14A) e cellule stromali del midollo osseo (BMSC) indotte a differenziare mediante trattamenti specifici (opportuni terreni di differenziamento) ed ingegnerizzazione con espressione di chimere ad attività proneuronale. D’altra parte numerosi studi effettuati su vertebrati ed invertebrati, hanno messo in evidenza che i principali meccanismi alla base della diversità neuronale sono legati ad una fine regolazione dell’espressione di determinati fattori di trascrizione nei progenitori neurali, tuttavia alcuni aspetti rimangono ancora da essere chiariti. Pertanto, nel presente progetto analizzeremo anche il ruolo di nurr-1, Egr-1, REST e dei fattori di trascrizione della famiglia POU nello sviluppo neuronale. Infine, gli approcci evolutivi e funzionali utilizzando sia modelli in vivo che in vitro rappresentano permetteranno di comprendere meglio i meccanismi molecolari che sono alla base del differenziamento neuronale. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Mario Pestarino Università degli Studi di GENOVA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Le conoscenze relative ai fattori che intervengono nel corso del differenziamento cellulare sono ancora limitate in particolare per quanto riguarda il sistema nervoso che è costituito da un elevato numero di popolazioni neuronali necessarie per lo sviluppo della sua complessa architettura. Una domanda importante è per quanto tempo i precursori neurali conservano un certo grado di plasticità, di modo che possano rispondere a diverse segnalazioni anche ambientali, che li inducono a generare nuove cellule con specifiche caratteristiche. Cellule staminali neurali e precursori neuronali sono stati identificati nel cervello di mammiferi sia allo stato embrionale che adulto e stimoli diversi, anche patologici come l’epilessia o l’infarto cerebrale, possono indurne la proliferazione e il differenziamento. Sebbene siano stati identificati numerosi fattori trascrizionali e trofici coinvolti nel differenziamento neuronale le nostre conoscenze degli eventi molecolari responsabili della transizione da progenitori a neuroni completamente differenziati sono ancora incomplete. Obiettivo del progetto di ricerca dell’Unità di Ricerca di Roma è quello di saggiare la capacità di fattori trascrizionali nel dirigere cellule indifferenziate verso uno specifico fenotipo neuronale. Sarà inoltre verificata la capacità di cellule che rappresentano differenti stadi del programma differenziativo neuronale di rispondere a fattori estrinseci. In particolare verrà approfondito il ruolo sinergico di diversi neurotrasmettitori sulla crescita neuritica. Un ulteriore obiettivo del programma di ricerca è verificare se cellule simil-neuronali ottenute da BMSC possano esprimere caratteristiche funzionali tipicamente neuronali, indicanti la loro capacità di comunicare (in modo bidirezionale) con altre cellule attraverso neurotrasmettitori specifici. Questo obiettivo verrà svolto dall’Unità di Ricerca di Genova-Maura, la quale si propone in particolare di studiare da un punto di vista funzionale cellule ottenute da BMSC indotte a differenziare mediante trattamenti specifici (coltura in opportuni terreni di differenziamento) ed ingegnerizzazione con espressione di chimere ad attività proneuronale. In particolare si intende verificare se cellule ottenute da BMSC possano esprimere, oltre che specifici antigeni neuronali (TUBB4/III, TAU, TH) o gliali (GFAP, GalC) e caratteristiche morfologiche neuronali, caratteristiche neurofisiologiche corrispondenti al fenotipo neuronale, cioè in primo luogo la loro capacità di comunicare (in modo bidirezionale) con altre cellule attraverso neurotrasmettitori specifici. Verranno quindi valutate la capacità di captare neurotrasmettitori o precursori dei neurotrasmettitori, di liberare neurotrasmettitori in seguito ad eccitazione (depolarizzazione o attivazione di recettori ionotropici). Verrà inoltre valutata la capacità di queste cellule di rispondere a stimoli specifici da parte di altre cellule neuronali (attraverso i neurotrasmettitori), valutando la presenza di recettori per i neurotrasmettitori stessi ed il loro accoppiamento con secondi messaggeri intracellulari, oltre che la loro capacità di regolare la liberazione di neurotrasmettitore. Un ulteriore obiettivo sarà quello di studiare i fattori che dirigono il differenziamento dei neuroni serotonergici, dopaminergici, acetilcolinergici e GABAergici durante l’embriogenesi dei protocordati, C. intestinalis e B. floridae. I protocordati rappresentano organismi modelli semplici, a sviluppo rapido, nel quale il SNC presenta numerose somiglianze con quello dei vertebrati sia dal punto di vista morfologico che molecolare. Il recente sequenziamento e assemblamento del genoma di C. intestinalis da parte del Joint Genome Institute (JGI, Dehal et al., 2002) facilita notevolmente gli studi molecolari, permettendo una rapida identificazione dei geni di interesse e delle regioni non codificanti. D’altra parte, il sequenziamento del genoma di anfiosso, in fase di completamento, fornirà un ulteriore utile elemento per studi comparativi. Pertanto, sia l’ascidia C. intestinalis che l’anfiosso B. floridae rappresentano due ottimi modelli di studio per comprendere i network genetici che controllano il differenziamento del SNC. Non bisogna infatti dimenticare che il genoma dei protocordati non ha subito le intense duplicazioni geniche che hanno invece caratterizzato quello dei vertebrati. Pertanto, nella maggior parte dei casi, i protocordati presentano un singolo gene omologo contro i molteplici geni paraloghi presenti nel genoma dei vertebrati. Pertanto, il genoma notevolmente compatto dei protocordati si presta molto bene per comprendere il funzionamento di specifici geni e per l’identificazione delle regioni regolatrici. A tale scopo l’Unità di Ricerca di Milano studierà l’espressione dei geni che codificano per diversi recettori e per enzimi che sono parte del pathway di segnale di serotonina e GABA. Si cercherà quindi di capire quale di queste molecole mediano il ruolo morfogenetico dei neurotrasmettitori e di ottenerne una caratterizzazione funzionale. Inoltre verrà valutata l'eventuale interazione tra i vari neurotrasmettitori durante il differenziamento del fenotipo serotonergico e GABAergico nel sistema nervoso centrale e periferico. Sarà prodotta una mappa dei neuroni nel SNC di Ciona intestinalis che sintetizzano serotonina, dopamina e GABA, che, confrontata con quella disponibile per i mammiferi, fornirà ulteriori indicazioni circa la conservazione di aree omologhe nel SNC dei cordati. Parallelamente, l’Unità di Ricerca di Genova-Pestarino si propone di studiare il differenziamento del sistema serotonergico e dopaminergico in anfiosso. A tale scopo verranno studiati i pattern di espressione dei geni TH e TPH, così come quello di alcuni fattori di trascrizione (nurr-1, GATA, Pet-1 e POU) coinvolti nel differenziamento dopaminergico e serotonergico. In ascidia e anfiosso, sarà valutato il possibile coinvolgimento del trasportatore della serotonina (SERT) nei processi morfogenetici, mediante esperimenti di microiniezione con oligo morfolino. Infine, l’Unità di Ricerca di Genova-Pestarino si propone di studiare il locus colinergico al fine di comprendere alcuni dei meccanismi molecolari che intervengono nel differenziamento colinergico in B. floridae e in C. intestinalis. Nel presente progetto verranno anche utilizzati adeguati modelli animali per lo studio del ruolo del sistema serotoninergico nello sviluppo e morfogenesi del sistema nervoso e visivo: questo potrebbe portare allo sviluppo di nuove terapie per il trattamento di patologie mentali e retiniche. Questa parte del progetto, svolta dall’Unità di Ricerca di Pisa, verrà effettuata su due modelli animali: topo e Xenopus. Il modello murino verrà utilizzato perché i risultati ottenuti possono essere facilmente estrapolati all’uomo e perché permette lo studio del ruolo di geni specifici mediante la generazione di topi knockout e transgenici. Xenopus è uno dei principali sistemi modello per la biologia dello sviluppo in quanto rende possibile effettuare esperimenti di perdita e guadagno di funzione genica. Il progetto proposto prevede due punti specifici: 1) ottenere linee di topi knockout e transgenici in cui la sintesi di 5-HT possa essere abolita. Mediante questo strumento genetico potremo chiarire il ruolo morfogenetico della 5-HT nello sviluppo delle strutture neurali e, verosimilmente, ottenere modelli animali per patologie neuropsichiatriche. 2) creare mediante mutagenesi sito specifica forme mutate dei recettori 5-HT2B e 2C (dominanti negativi) che possano competere con l’attività dei recettori endogeni. Studi funzionali saranno condotti in embrioni di Xenopus e in colture cellulari. La combinazione di studi in vivo ed in vitro ci permetterà di far luce su importanti aspetti molecolari e farmacologici dei recettori di classe 2 che contribuiscono in maniera sostanziale alla regolazione mediata da 5HT. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Lo sviluppo del sistema nervoso inizia con il differenziamento di cellule neurali e gliali, questo differenziamento può avvenire in molti modi ed in momenti diversi dello sviluppo di un organismo. Tuttavia i meccanismi molecolari e cellulari che stanno alla base di tale differenziamento sono evolutivamente conservati. La formazione di neuroni dalle regioni neurogeniche sia di vertebrati sia di invertebrati tipicamente è caratterizzata da una fase intermedia: prima si forma una cellula progenitrice neurale, quindi essa si differenzia per produrre numerosi e differenti neuroni. Questi neuroni richiedono informazioni genetiche appropriate per poter acquisire il fenotipo richiesto, per individuare il percorso del cono di crescita assonale e per raggiungere il bersaglio corretto. Fattori di crescita responsabili del differenziamento neurale possono essere prodotti nei tessuti che circondano il neurone. Sebbene geni come Neurogenina, Neuro D, Notch, Delta e Mash sono stati ritenuti responsabili delle fasi precoci della neurogenesi (1), l’identificazione di molecole segnale e di geni regolatori che determinano il differenziamento di una cellula progenitrice in un neurone con uno specifico fenotipo è ancora in una fase iniziale. E’ noto che i promotori di geni neurali contengono sequenze consenso per diversi fattori di trascrizione tra i quali si trova EGR-1 (2) e l’espressione della famiglia genica Egr è intensificata dall’attivazione dei recettori muscarinici per l’ACh (3, 4), suggerendo che ACh sia capace di modulare l’espressione di proteine specifiche neuronali. D’altronde, è noto che REST (fattore di trascrizione silenziante RE-1) regola in maniera negativa l’espressione dei geni neurali. REST è espresso nei precursori neurali (5) e il suo livello di espressione tende a diminuire durante il differenziamento (6). Sebbene i fattori di trascrizione che indirizzano i precursori neuronali verso un determinato fenotipo, siano poco caratterizzati, Nurr-1 è un fattore di trascrizione richiesto per il differenziamento dei neuroni dopaminergici (7). Tuttavia i meccanismi per i quali Nurr-1 promuove il differenziamento dopaminergico sono ancora sconosciuti. In conclusione, l’identificazione di specifici fattori di trascrizione come Nurr-1, EGR-1 e REST con proprietà attivatrici o repressive suggerisce che la loro equilibrata attività è indispensabile per un corretto programma differenziativo neuronale (8, 9). Recentemente è stato dimostrato il ruolo dei neurotrasmettitori come fattori estrinseci capaci di dirigere le cellule verso un destino neurale (10). E’ importante ricordare che cellule di neuroblastoma N18TG2 sono incapaci di produrre neurotrasmettitori (11-13) ma posseggono recettori muscarinici. Usando queste cellule è stato dimostrato che la trasfezione di un costrutto per la ChAT rende tali cellule capaci di sintetizzare ACh e di stimolare la crescita assonale, inoltre nello stesso tempo ACh influisce la sintesi di numerosi marcatori neuronali specifici (14). Di particolare interesse è la constatazione che nei cloni transfettati con la ChAT è sovraregolata. Le conoscenze attuali sul differenziamento neurale suggeriscono che l’attivazione di uno specifico set di fattori di trascrizione probabilmente necessita un appropriato insieme di segnali provenienti dall’ambiente esterno al fine di attivare uno specifico programma differenziativo. Numerosi studi in vertebrati ed invertebrati hanno dimostrato che i principali meccanismi responsabili della diversità neuronale sono evolutivamente conservati e che la produzione sequenziale di differenti sottotipi neuronali riflette l’espressione temporale e spaziale dei fattori di trascrizione nelle cellule progenitrici neurali. Nei mammiferi i principali fattori di trascrizione coinvolti nel differenziamento di neuroni sertoninergici posso essere raggruppati in due ampie classi: (i) Nkx2.2, Nk6.1 e mash1 sono necessari per il differenziamento serotoninergico, (ii) Mas1, gata2, gata3, Lmx1b e Pet1 sono richiesti per selezionare i differenti sottotipi di neuroni serotoninergici. Il differenziamento di neuroni serotoninergici è stato studiato anche in Drosophila e C.elegans. In quest’ultimo il fattore di trascrizione lim-4 regola il fenotipo serotoninergico tra i neuroni chemosensoriali, mentre il fattore di trascrizione unc-86 definisce il fenotipo serotonergico di altri neuroni regolando la trascrizione del gene TH. Attualmente è accettato che 5HT abbia un ruolo fondamentale nell’attività neuronale, e che svolga un ruolo cruciale nel controllo della morfogenesi durante le prime fasi di sviluppo (15). Assieme a 5HT sono coinvolte due importanti famiglie di trasportatori della 5HT: il trasportatore vescicolare delle monoammine (VMAT) e i trasportatori di membrana (SERTs). E’ ben noto che SERT è un regolatore estremamente importante della fisiologia del sistema nervoso. Inoltre, SERT è anche implicato nell’embriogenesi e nella regolazione della proliferazione cellulare (16, 17). In particolare in embrioni di Xenopus e pollo è stato dimostrato che tali molecole hanno un ruolo importante nella definizione dell’asse sinistro/destro durante le fasi precoci dello sviluppo (18). Uno tra i più importanti neurotrasmettitori è l’ACh. I neuroni colinergici possono essere riconosciuti dall’espressione del locus del gene colinergico (19). Questo complesso locus codifica per due molecole essenziali della neurotrasmissione colinergica: ChAT e VAChTP (20). L’intera regione codificante del gene VAChTP è situata all’interno del primo introne del gene ChAT e con lo stesso orientamento trascrizionale di ChAT. Inoltre VAChTP e ChAT non solo condividono un comune locus genico ma anche elementi regolatori della trascrizione dei rispettivi geni. In Drosophila è stato dimostrato che pochi elementi cis-regolatori e fattori di trascrizione associati sono probabilmente coinvolti nella regolazione differenziale del locus colinergico (21). I geni POU della classe IV sono stati studiati ampiamente nei vertebrati (22) and hanno un ruolo importante nella specificazione di diversi neuroni sensoriali (23, 24). In particolare, in Drosophila isoforme mancanti del POU IV box determinano la morte dei neuroni colinergici (25) e nella famiglia Brn3 dei vertebrati almeno una forma di Brn3 regola l’espressione di un particolare tipo di recettore nicotinico colinergico (26). Per questo motivo si ritiene estremamente interessante verificare il livello di conservazione dei meccanismi regolatori dei geni colinergici. Ascidie e anfiosso offrono un favorevole sistema genico per identificare i regolatori trascrizionali per differenti tipi di neuroni colinergici. Recentemente un omologo della classe IV dei geni POU è stato clonato in ascidia e anfiosso (27, 28). Questi geni svolgono un ruolo evolutivamente conservato nello sviluppo del sistema sensoriale come dimostrato in numerosi vertebrati ed invertebrati e pertanto ascidie e anfiosso sono organismi modello molto utili per studiare la specificazione dei fenotipi neuronali serotoninergici, catecolaminergici e colinergici. 5HT e GABA sono normalmente associati alla comunicazione nervosa: tuttavia essi hanno anche la capacità di influenzare differenti meccanismi morfogenetici dallo sviluppo del sistema nervoso alla metamorfosi e alla maturazione neuronale (29-33). Negli ultimi anni, la localizzazione di 5HT e dei suoi recettori nelle fasi precoci dello sviluppo ha portato ad ipotizzare che essi possano agire come regolatori della crescita embrionale durante specifiche fasi dello sviluppo. Nelle ascidie, i recettori serotoninergici compaiono nelle fasi più precoci dello sviluppo. Il trattamento con ritanserina, un antagonista del recettore 5HT2B, causa un anormale sviluppo del sistema cardiocircolatorio (34). Trattamenti con WAY 100635, un antagonista del recettore 5HT1A, causa assenza della parte più anteriore della vescicola sensoriale anteriore e mancanza di pigmento nei due organi sensoriali della larva di ascidia, l’ocello e l’otolite (35). Inoltre, 5HT e il recettore 5HT1A sono necessari per iniziare la metamorfosi nella seconda parte della vita larvale (36). Poiché la metamorfosi richiede nuove trascrizioni geniche, 5HT potrebbe essere coinvolto nei meccanismi di attivazione e regolazione genica. Negli embrioni di vertebrati, 5HT si lega con elementi del citoscheletro delle cellule neuroepiteliali (37) e può regolare i cambiamenti nella forma cellulare e nei movimenti morfogenetici importanti per la chiusura del tubo neurale (38) e per la migrazione delle cellule della cresta neurale (39,40). E’ anche dimostrato che specifici recettori per neurotrasmettitori sono presenti in cellule progenitrici dei neuroni svolgendo un ruolo non ancora chiarito (41). 5HT è anche coinvolta nel controllo di numerosi altri meccanismi differenziativi sia nel sistema nervoso centrale sia in quello periferico. Una selettiva deplezione della 5HT nel cervello è probabilmente all’origine di disordini psichiatrici quali ansietà, depressione, disordini bipolari, autismo e schizofrenia. Gli effetti comportamentali di un uso cronico di antidepressivi come la fluoxetina, un inibitore selettivo del re-uptake della 5HT, può essere mediato dalla stimolazione della neurogenesi nell’ippocampo. Il sistema serotoninergico oltre che interagire con BDNF, S100beta e altri messaggeri chimici, interagisce con i sistemi GABAergico, glutamatergico, e dopaminergico. Modificazioni di queste interazioni portano a disordini del SNC che sono stati associati con un perturbato sviluppo. Numerosi studi hanno suggerito associazioni tra diverse malattie neuropsichiatriche e i geni che modulano la trasmissione dell’impulso nervoso nei sistemi serotoninergici e che codificano SERT (42), recettori serotoninergici (43, 44) e monoamminoossidasi (45), così come l’enzima TPH coinvolto nella sintesi della 5HT (43, 46, 47). Per questi motivi, malfunzionamenti precoci del sistema serotoninergico hanno la possibilità di alterare lo sviluppo del cervello portando alla comparsa di schizofrenia, autismo e ritardo mentale. Numerosi farmaci psicoattivi mediano la loro azione attraverso l’attivazione di recettori 5HT(2). In Xenopus trascritti di 5HT2B e 2C sono coespressi nelle regioni di proliferazione del sistema nervoso larvale e della retina. Appare quindi importante svelare il contributo delle vie di trasduzione del segnale mediate da 5HT2B/2C e attivate da 5HT nel cervello e nella retina, chiarendo il ruolo di particolari domini proteici e delle possibili omo e/o eterodimerizzazioni. La disponibilità di animali modello adatti è necessaria per implementare le nostre conoscenze sul ruolo della 5HT nello sviluppo del cervello e della retina. Questo potrà portare a significativi progressi nella scoperta di nuovi trattamenti farmacologici di patologie del cervello e della retina. Come già detto anche gli enzimi coinvolti nella via biosintetica sono coinvolti nei meccanismi molecolari collegati a malattie del cervello e dell’occhio. Infine numerose prove dimostrano una interazione tra il sistema serotoninergico e fattori neurotrofici, oltre che con i sistemi GABAergico, glutamatergico e dopaminergico. In particolare GABA è da lungo tempo considerato il principale neurotrasmettitore inibitorio nel cervello di mammiferi. Tuttavia, i segnali mediati dal GABA sono anche implicati nella regolazione di molte tappe chiavi dello sviluppo, dalla proliferazione cellulare alla maturazione neuronale in vertebrati ed in invertebrati (48, 49). I recettori ionotropici GABA e GABAC sono distribuiti nell’intero sistema nervoso degli insetti e sono bersagli importanti degli insetticidi. Recentemente il gene del recettore metabotropico GABAB è stato clonato in Drosphila e il suo pattern di espressione durante lo sviluppo è stato studiato (50). Perciò è possibile che un sistema GABAergico si sia originato in un organismo ancestrale allo scopo di svolgere funzioni trofiche. Infine, dati dimostrano la possibilità di differenziare cellule stromali del midollo osseo di adulti in neuroni e quindi essi aprono nuove prospettive nel campo della medicina rigenerativa. BMSC sono capaci di penetrare nel sistema nervoso e differenziarsi in cellule esprimenti antigeni neurali e gliali (51, 52), originare cellule del Purkinje del cervelletto da BMSC trapiantate in ratto e uomo (53, 54); inoltre BMSC possono riformare tessuto dopo un episodio infartuale (55), un trauma cranico (56, 57) e in presenza del morbo di Parkinson (58). Tuttavia, sono anche noti esperimenti che hanno dimostrato l’incapacità delle BMSC a differenziarsi in senso neuronale. Da questo punto di vista, occorre considerare anche l’estrema variabilità dei mezzi di coltura e di differenziamento (59, 60); infatti un approccio alternativo al problema consiste nell’indurre il differenziamento neurale mediante l’uso di costrutti specifici. Come è noto in molte cellule è presente REST che è capace di reprimere numerosi geni, tra i quali quelli per la beta tubulina III e MAP2 (61, 62). Una proteina chimerica che presenta all'N-terminale il DNA-binding domain di REST e al C-terminale in sostituzione del dominio repressore di REST è stata giustapposta la potente regione transattivante della proteina VP16 (63). In questo modo la proteina chimerica si lega alle stesse specifiche sequenze di DNA a cui si lega REST ma con il risultato di indurre la trascrizione dei geni che vengono normalmente repressi dalla proteina REST wild type. Questa strategia ha dimostrato la sua validità in cellule staminali neurali e mioblasti che hanno acquisito fenotipo e funzioni neuronali (64, 65). Queste premesse fanno ritenere che l'espressione di questa chimera possa essere molto utile per forzare il differenziamento in senso neuronale di cellule stromali. Rimane tuttavia non risolto quanto cellule stromali differenziate che esprimano marcatori neuronali possano avvicinarsi ad un fenotipo di neurone adulto, e svolgere il suo ruolo funzionale da un punto di vista neurofisiologico. Mancano infatti chiare evidenze sperimentali sulle caratteristiche funzionali tipicamente neuronali, quali per esempio la capacità di depolarizzarsi, di captare neurotrasmettitori, di liberare neurotrasmettitori in seguito a depolarizzazione, di rispondere alla stimolazione di neurotrasmettitore. In altri termini, non è chiarito se al di là dell'espressione di svariati marcatori neuronali, queste cellule hanno assunto la capacità di comunicare con altre cellule attraverso neurotrasmettitori specifici oppure se sono in grado di stabilire giunzioni sinaptiche. <<<