RICERCA ITALIANA     

Individuazione di determinanti di folding e misfolding mediante mutagenesi sistematica

Università degli Studi di Firenze

Abstract

L’amiloidosi associata alla dialisi è una grave ed inevitabile complicazione dell’emodialisi a lungo termine ed è caratterizzata dall’accumulo, in alcuni tessuti dell’organismo come il muscolo scheletrico, di aggregati fibrillari, detti amiloidi, della proteina beta-2-microglobulina (b2-m). Questo progetto di ricerca si prefigge di ampliare le conoscenze attuali sul ruolo sia di determinati residui della sequenza della beta-2-microglobulina (b2-m), che delle sue diverse regioni strutturali nei processi di folding e di aggregazione. Il progetto si articolerà in più fasi, ognuna delle quali spesso prevede la collaborazione di più Unità di Ricerca (UR). Tali fasi sono:
1) Progettazione di mutazioni e preparazione di mutanti della b2-m. Verrà progettato un numero di mutazioni tale da permettere di studiare sia il processo di folding che quello di aggregazione della proteina.
2) Studio della struttura dei mutanti in soluzione mediante risonanza magnetica nucleare (NMR) standard 1D ed eteronucleare 2D e 3D. Si otterranno comparazioni strutturali tra i mutanti da analisi di pattern di attenuazione paramagnetica in presenza ed assenza di uno spin label oppure da pattern di accessibilità differenziale del solvente. Si otterranno informazioni di tipo dinamico sui profili di mobilità segmentale dei mutanti e informazioni dettagliate sulla stabilità dei diversi elementi di struttura secondaria della proteina. Verranno poi effettuate misure di real-time NMR, in grado di seguire l’evoluzione cinetica degli intermedi di folding lenti di alcune varianti di b2m e di fornire le loro caratteristiche strutturali.
3) Determinazione dei parametri termodinamici e cinetici di folding e di unfolding di b2-m. Le stabilità conformazionali dei mutanti saranno determinate misurando le curve di unfolding indotto da GdnHCl in condizioni di equilibrio, usando la fluorescenza e/o il dicroismo circolare come sonde spettroscopiche. Le velocità di folding ed unfolding verranno determinate per ciascun mutante a diverse concentrazioni di denaturante usando dispositivi a flusso interrotto. Per ricavare informazioni sul meccanismo di folding di b2-m si ricorrerà all’analisi dei cosiddetti valori phi di ciascun mutante. Questo approccio fornirà un’informazione sul livello di struttura che il residuo mutato possiede nello stato di transizione e nei principali intermedi di folding in modo da delineare il meccanismo di folding a livello molecolare.
4) Determinazione dell’accessibilità al solvente e della flessibilità strutturale di b2-m. Strategie integrate, quali lo scambio idrogeno/deuterio o la proteolisi limitata accoppiate alla spettrometria di massa, verranno applicate allo studio dei mutanti di b2-m per analizzare le regioni flessibili e/o esposte al solvente degli intermedi transienti del processo di folding e di misfolding della proteina.
5) La formazione di fibrille da parte dei mutanti verrà monitorata in tempo reale sia spettroscopicamente, tramite l’utilizzo di dosaggi specifici, che con microscopia a forza atomica (AFM). Si investigherà anche il ruolo di due fattori essenziali nel processo di formazione di aggregati amiloidi: la carica superficiale e l’idrofobicità, mediante misure di potenziale zeta e di capacità di interazione con membrane modello come liposomi, membrane planari e monostrati di fosfolipidi. Compito di questo progetto di ricerca è inoltre la determinazione la propensione ad aggregare dell’intera sequenza di b2-m, che verrà determinata confrontando le velocità di aggregazione dei mutanti con quella della proteina wild-type.
6) In seguito alla recente scoperta, da parte di alcune UR partecipanti a questo progetto, che le fibre di collagene possono promuovere il processo di aggregazione amiloide di b2-m in condizioni fisiologiche e spiegare la specificità tissutale in cui la deposizione avviene, saranno condotti esperimenti di aggregazione incubando b2-m con collagene fibrillare di tipo I e tipo II, in presenza o assenza di eparina. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Fabrizio Chiti Università degli Studi di FIRENZE

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’amiloidosi associata alla dialisi è una grave ed inevitabile complicazione dell’emodialisi a lungo termine. In questa condizione patologica, aggregati proteici noti come fibrille amiloidi si accumulano in tessuti indispensabili per una corretta funzionalità dell’organismo, come il muscolo scheletrico, interferendo con le loro normali funzioni. Un principale costituente delle fibrille amiloidi associate a questa patologia è la proteina beta-2-microglobulina (b2-m). Il progetto di ricerca qui descritto si prefigge di caratterizzare a livello molecolare gli eventi di folding ed aggregazione (o misfolding) di questa proteina.
Il primo obiettivo del progetto è investigare, a livello residuo specifico, il processo di folding di b2-m, ossia il meccanismo di conversione di questa proteina dalla forma destrutturata alla forma nativa e funzionale. Ci baseremo su modelli di folding precedentemente proposti sia da Unità di Ricerca partecipanti a questo PRIN che da altri gruppi di ricerca internazionali, per investigare il processo di folding a risoluzione molecolare. Ci proponiamo infatti di identificare i residui che partecipano alla formazione ed alla stabilità sia dello stato nativo che dei vari stati parzialmente strutturati che risultano essere popolati durante il processo di folding.
Il secondo obiettivo del programma è determinare, con simile risoluzione molecolare, i residui o le regioni della sequenza che promuovono il processo di aggregazione amiloide di b2-m. Il processo di aggregazione della proteina sarà inoltre studiato in presenza di collagene. E’ stato infatti osservato che il collagene pruomuove l’aggregazione di b2-m in vitro ed è associato ai depositi amiloidi in vivo, quindi si pensa che abbia un ruolo determinante nel processo di amiloidogenesi che ha luogo nei pazienti affetti da amiloidosi associata a dialisi e che determini la selettività dei depositi amiloidi per certi tessuti.
Con una piena comprensione dei processi di folding e di aggregazione, il network delle conversioni tra i vari stati conformazionali accessibili a b2-m sarà caratterizzato non solo in termini termodinamici e cinetici, ma anche determinando a livello molecolare i meccanismi di queste transizioni conformazionali. Ciò rappresenta un passo avanti fondamentale nella comprensione della patogenesi dell’amiloidosi associata a dialisi, e fornirà bersagli essenziali per la futura progettazione di strategie terapeutiche. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Le amiloidosi sono un gruppo eterogeneo di malattie caratterizzate dall'aggregazione patologica di proteine solubili in fibrille insolubili, che si accumulano nei tessuti causando un danno irreversibile (1). Negli ultimi anni l'UR di Pavia ha caratterizzato un significativo numero di proteine amiloidogeniche isolate da fonti naturali, in particolare ha caratterizzato le diverse isoforme di b2-m presenti nei depositi amiloidi di diversi pazienti affetti da DRA. La b2-m nativa è una proteina di 99 AA in cui è presente il motivo strutturale a sette beta strands caratteristico della superfamiglia delle immunoglobuline. Fisiologicamente la b2-m rappresenta la catena leggera non polimorfica dell’MHCI. Durante il suo normale catabolismo, si dissocia dal complesso e tramite il flusso sanguigno viene trasportata ai reni dove viene per la maggior parte degradata (2). Nei pazienti emodializzati (circa 25000 in Italia) la concentrazione di b2-m aumenta da 20 a 50 volte e, secondo un meccanismo non ancora ben conosciuto, la proteina va incontro ad un processo di autoaggregazione responsabile della formazione di fibrille amiloidi, che si accumulano prevalentemente a livello del sistema muscolo scheletrico (3). Nei depositi amiloidi la b2-m è presente per la maggior parte come proteina completa, tuttavia una significativa percentuale di b2-m fibrillare (circa 30%) è costituita da una forma proteolizzata della proteina priva dei primi sei residui (DN6b2-m) (4,5). Il gruppo della Dott.ssa Radford (6) ha dimostrato che la b2-m completa può formare fibrille in condizioni di pH acido e l'aggregazione è probabilmente preceduta dalla formazione di uno stato parzialmente destrutturato simile a un molten globule. Inoltre è stato dimostrato che l’isoforma DN6b2-m può formare fibrille a pH neutro e molto probabilmente non richiede notevoli modificazioni conformazionali per acquisire la struttura amiloidogenica (7). Recentemente anche il gruppo della Dott.ssa Radford ha confermato che DN6b2-m è in grado di formare fibrille con caratteristiche morfologiche tipiche delle fibrille amiloidi a pH 7.0, in assenza di nuclei preformati di fibrille (8). Questi dati permettono di ipotizzare che questa specie della b2-m sia in grado di iniziare il processo di fibrillogenesi in vivo.
Esperimenti di proteolisi limitata hanno permesso di dimostrare che la topologia superficiale della b2-m fibrillare è simile a quella dell’isoforma DN6b2-m, ma differisce da quella della proteina completa nativa (9). Sulla base di questi dati abbiamo quindi voluto indagare le possibili analogie conformazionali tra DN6b2-m allo stato nativo e gli intermedi della via di folding/unfolding. L’esistenza di queste specie parzialmente strutturate ci ha portato a ricercare eventuali caratteristiche funzionali di questi conformeri, come ad esempio il legame a target molecolari presenti nei tessuti (collagene e glicosamminoglicani) (10).
Nell’ambito degli studi riguardanti il folding della b2-m abbiamo potuto verificare che inaspettatamente questa proteina non segue una via di folding a due stadi: dopo due fasi veloci avviene una fase lenta finale, attraverso cui si ha il completo recupero della struttura nativa in circa 20 min a 20°C in condizioni fisiologiche (11,12). Nel corso della conversione strutturale associata a questa ultima fase, la b2-m è in grado di promuovere la crescita di fibrille preformate anche a pH neutro (13). Altre condizioni, compatibili con la formazione di fibrille a pH fisiologico, sono state identificate dal gruppo del Prof. Goto (14).
Tutti gli studi riguardanti la struttura e la dinamica di folding della b2-m, che sono stati condotti negli ultimi 5 anni, sono rivolti all’individuazione delle condizioni in grado di favorire la formazione di fibrille amiloidi. Questo argomento è stato oggetto di un approfondito dibattito durante un workshop svoltosi nel dicembre 2004, sponsorizzato dal CNR italiano e dal JSPS giapponese, e che ha visto riuniti tutti gli esperti in questo campo (vedi il numero monografico di BBA 1753, 2005, pp 1-153). I metodi di fibrillogenesi della b2-m in vitro possono essere suddivisi in tre categorie:
A) metodi che richiedono un parziale unfolding della proteina in condizioni drastiche di denaturazione (ad es. a pH 2.5);
B) metodi che prevedono l’utilizzazione di un solvente organico come il TFE o di un detergente come SDS, che hanno la funzione di aumentare le interazioni intermolecolari e di favorire circoscritte transizioni strutturali;
C) metodi che prevedono l’aggiunta di cofattori (collagene e eparina) in grado di mimare il micro-ambiente in cui il processo di amiloidogenesi avviene in vivo.
In questi tre diversi metodi di fibrillogenesi si può utilizzare sia la b2-m wild type sia isoforme proteolizzate della proteina che si ritrovano in tutti i depositi amiloidi, sia isoforme proteolizzate in grado di facilitare la formazione delle fibrille.
Il terzo approccio (C) è stato recentemente utilizzato da diversi gruppi, tra cui anche quello della Dott.ssa Radford che ha studiato il ruolo di diversi fattori biologici nel pruomovere la fibrillogenesi della b2-m a pH neutro in vitro (7). In questi esperimenti è stato dimostrato che incubando nuclei di fibrille con SAP, apoE, collagene e fluido sinoviale la formazione di fibrille amiloidi viene favorita anche in assenza di solventi organici o di detergenti. Questi fattori probabilmente hanno un’azione sinergica nel favorire la fibrillogenesi. Lo stesso gruppo di ricercatori ha dimostrato che questi fattori possono agire di concerto con l’eparina nella formazione di fibrille. Recentemente è stato dimostrato che l’eparina accelera in modo efficace anche la formazione di fibrille amiloidi di gelsolina, favorendo la formazione di beta-sheet intermolecolari (15). Inoltre, in presenza di eparina, viene accelerata la transizione in beta –sheet dei peptidi monomerici di A-beta (16).
Secondo la nostra opinione è estremamente interessante individuare metodi di fibrillogenesi in vitro “biocompatibili”. Recentemente l’UR di Genova ha dimostrato che in vitro, in condizioni di pH e temperatura simili a quelle che si riscontrano nei tessuti peri-articolari in presenza di processi flogistici, le fibrille amiloidi di b2-m si possono formare sulla superficie del collagene fibrillare di tipo I (17). Questo risultato evidenzia il ruolo cruciale svolto dal collagene nel processo di deposizione amiloide della b2-m, e suggerisce una possibile spiegazione della elevata specificità della DRA per i tessuti del sistema muscolo scheletrico. Ipotizziamo che la presenza di regioni positivamente cariche lungo la fibrilla di collagen svolga un ruolo di primaria importanza nella fibrillogenesi di b2-m. Questa ipotesi è rafforzata dall'osservazione che un polimero carico positivamente quale la poli-lisina ha un effetto simile al collageno nella fibrillogenesi di questa proteina (17).

Una comprensione dettagliata del meccanismo di ripiegamento (folding) di b2-m dallo stato totalmente destrutturato allo stato nativo e del meccanismo con cui la proteina in forma solubile si converte in aggregati fibrillari è di fondamentale importanza per spiegare la patogenesi dell’amiloidosi da dialisi e per definire approcci terapeutici per questa patologia. Uno degli approcci generalmente utilizzati per ricavare informazioni sul meccanismo di folding di una proteina globulare è l’analisi dei cosiddetti valori phi (phi-values), introdotta da Alan Fersht (18) e negli ultimi 15 anni utilizzata da molti gruppi di ricerca in tutto il mondo. L’analisi consiste nella produzione di un certo numero di singoli mutanti (tipicamente 25-50) della proteina di interesse. Le mutazioni devono essere distribuite nelle diverse regioni strutturali della proteina nativa e devono causare solo piccole variazioni delle catene laterali. La mutazione tipica dell’analisi phi è la sostituzione di un residuo di isoleucina con una valina, o di una treonina con una serina. Mutazioni conservative di questo tipo non cambiano sostanzialmente la natura chimica del residuo mutato, nè inseriscono nuovi gruppi chimici che potrebbero dar luogo ad ingombri sterici, e vengono dunque progettate allo scopo di minimizzare la distorsione della struttura nativa compatta della proteina di interesse. Tutti i mutanti vengono successivamente analizzati per determinare (a) il cambiamento di energia libera di unfolding estrapolato in assenza di denaturanti chimici, (b) la velocità di folding e (c) la velocità di unfolding, sempre in assenza di denaturante. Il confronto tra questi parametri misurati sui mutanti e quelli della proteina non mutata (wild-type) fornisce un’informazione sul livello di struttura che il residuo mutato possiede nello stato di transizione e nei principali intermedi di folding (se esistenti). In altre parole, quest’analisi comparativa di tutti i mutanti prodotti e della proteina wild-type permette di delineare il coinvolgimento di ciascun residuo mutato nel processo di folding della proteina.

Gli stessi mutanti possono poi essere utilizzati per investigare il coinvolgimento del residuo mutato nel processo di aggregazione della proteina. Infatti, la velocità del processo di aggregazione e la stabilità delle fibrille finali possono essere valutate per ogni mutante e confrontate con quelle della proteina wild-type (19). Queste misure sistematiche possono essere condotte in condizioni in cui lo stato nativo è popolato oppure in condizioni in cui la proteina popola uno stato parzialmente destrutturato, generalmente indicato come il diretto precursore delle fibrille amiloidi. Questo studio, grazie al confronto tra i risultati ottenuti e quelli attesi sulla base dei moderni metodi computazionali e grazie ai dati cinetici e termodinamici della reazione di folding, può fornire informazioni importanti su più aspetti. In primo luogo è possibile identificare quali residui o regioni della sequenza promuovono il processo di aggregazione (19); in secondo luogo, si può stabilire se l’innesco del processo di aggregazione richiede un completo o parziale unfolding della proteina piuttosto che l’associazione di molecole di tipo nativo (20); in terzo luogo, quando quest’analisi è condotta in parallelo ad uno studio conformazionale dello stato amiloidogenico, si possono ottenere informazioni sulla relazione tra le regioni o i residui che promuovono l’aggregazione e la struttura dello stato amiloidogenico. <<<