RICERCA ITALIANA     

Esocitosi in cellule neurosecernenti: dalla competenza alla regolazione

Abstract

Lo studio di cloni defettivi, isolati dalla linea PC12 (feocromocitoma di ratto) ha mostrato che la competenza all’espressione della neurosecrezione, cioè la comparsa di vescicole chiare e scure ricche di neurotrasmettitore destinate alla liberazione per esocitosi regolata, è governata da un programma genico distinto che però non è stato ancora identificato. Recenti studi citogenetici su chimere cellulari ottenute dalla fusione di PC12 defettive con linfociti umani hanno rivelato che un frammento pericentromerico del cromosoma 11 è sufficiente per indurre la ri-espressione della competenza di ratto. Tra i geni localizzati nel frammento c’è quello di BHC80, un componente del complesso di trascrizione BRAF-HDA cui appartiene anche il fattore silenziatore restretto ai neuroni, REST. Quest’ultimo, abbondante in cellule non secretive (dove previene l’espressione di molti geni neurone-specifici) e quasi assente nelle PC12 wild-type, è presente nelle PC12 defettive. Nei neuroni REST è basso ma apprezzabile. REST non è sempre silenziatore. In condizioni controllate da BHC80 può essere stimolatore della trascrizione dei suoi bersagli.
Tre Unità (U), specializzate in aspetti complementari delle neuroscienze, hanno deciso di studiare insieme il ruolo di REST, specie in rapporto alla competenza neurosecretiva. Anticorpi e costrutti cDNA di REST e BHC80 saranno disponibili. La maggior parte degli esperimenti saranno condotti collaborativamente con prevalenza di singole Unità come indicato qui sotto. Studieremo 2 processi: gli effetti di REST sul fenotipo neurosecretivo e l’espressione e proprietà delle vescicole esocitiche espresse nelle PC12 defettive, gli enlargosomi. Studieremo PC12, wild-type e defettive, cromaffini, GT1-7 e neuroni ippocampali. In culture primarie di neuroni, U2 studierà il ruolo di REST endogeno nella crescita assonale, formazione di sinapsi e liberazione di trasmettitori. Gli effetti dei costrutti di REST trasfettati o infettati nei neuroni saranno testati per patch camping, con attenzione speciale per la plasticità sinaptica (studiata per elettrofisiologia - patch clamping, e multichannel recording in fettine ippocampali - e proteomica), e per il ruolo della sinapsina I, una fosfoproteina regolatore del traffico vescicolare. L’espressione di proteine dopo trasfezione di costrutti di REST e BHC80 verrà studiata dalla U1, focalizzando sulla riapparsa, almeno parziale, della competenza. Sulla stessa linea U3 userà soprattutto elettrofisiologia delle PC12, wild-type e defettive, e delle cromaffini. Studi sugli enlargosomi, localizzati anche sugli effetti di REST, saranno condotti dalle U1 e 3. quest’ultima, usando patch clamping e analisi per elettrodi dei prodotti liberati, studierà il possibile ruolo secretivo degli organelli. L’U1 investirà nell’isolamento e purificazione di frazioni subcellari purificate di enlargosomi e nel confronto di questi organelli con un altro tipo di vescicole esocitiche. Questa proposta introduce nuove idee ed approcci in un campo importante delle neuroscienze. Confidiamo che il contributo delle 3Us, complementari nella loro specificità scientifica e sperimentale, saprà assicurare un adeguato successo. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Jacopo Meldolesi Libera Università "Vita Salute S.Raffaele" MILANO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo scopo di questo progetto è l’identificazione e la caratterizzazione dei meccanismi molecolari e cellulari che regolano il processo di acquisizione della competenza alla neurosecrezione, una proprietà tipica sia dei neuroni che delle cellule neurosecretive.
L’origine di questi studi (inizio degli anni 90) è stato l’isolamento, da parte dell’Unità 1, di due cloni defettivi (PC12 e PC12-Trk) della linea cellulare PC12. Quest’ultima, isolata da un feocromocitoma di ratto, è la linea cellulare più nota e più usata negli studi di neurosecrezione. I cloni defettivi sono particolari perchè mantengono molte proprietà della linea di origine, incluso il differenziamento simil-neuronale in risposta all’NGF, ma sono completamente privi del fenotipo neurosecretivo. Questa scoperta dimostrava come, contrariamente alle opinioni accettate fino a quel momento, l’espressione della neurosecrezione é governata da un programma genetico indipendente che può essere inattivato, e possibilmente anche attivato, senza interferire con le altre proprietà differenziative della cellula. Insieme alla perdita della neurosecrezione i cloni PC12 defettivi mostrano la comparsa di un nuovo processo di esocitosi regolata, quello degli enlargosomi, scoperto nel 1999 e caratterizzato successivamente dall’Unità 1. Questo processo, che manca nelle cellule PC12 wild-type, vi compare però dopo differenziamento da NGF. Inoltre esso è presente in diversi altri tipi di cellule.
Lo studio dei cloni defettivi di PC12 ha aperto nuove prospettive in tema di competenza alla neurosecrezione. Finora, però, gli studi sono rimasti limitati soltanto alle PC12. Scopo di questa proposta è un ampio sviluppo dello studio, focalizzato non solo sulle PC12, che serviranno comunque come strumenti essenziali di riferimento, ma anche su altre cellule di fondamentale importanza, quelle cioé in cui la maggior parte delle conoscenze attuali in tema di neurosecrezione sono state acquisite: cellule cromaffini e neuroni ippocampali. Per questi studi l’Unità 1 ha stabilito stretti contatti collaborativi con l’Unità 2, che ha particolare esperienza in campo di neuroni ippocampali, studiati con tecniche molecolari, cellulari ed elettrofisiologiche; e con l’Unità 3, che nasce da uno dei gruppi di ricerca elettrofisiologica più avanzati del nostro paese, leader internazionale da lungo tempo in tema di cromaffini. La collaborazione tra le tre Unità ha permesso di riunire un gruppo di ricerca complementare nella sua competenza e coordinato nel suo approccio sperimentale, fornito di tecnologie avanzate e di interessi scientifici comuni. Soltanto pochi degli esperimenti riassunti in questa domanda di finanziamento avrebbero potuto essere concepiti da una sola Unità senza la collaborazione delle altre. Inoltre, il fall-out di questi studi sarà aumentato sinergisticamente dalla collaborazione.
In base a queste considerazioni, e a partire dai risultati preliminari già ottenuti soprattutto dall’Unità 1, abbiamo scelto come scopo principale di questo progetto l’identificazione del ruolo di un gene regolativo inibitore, quello del fattore silenziatore restrittivo neuronale, comunemente indicato come REST, nell’acquisizione della competenza alla neurosecrezione in alcuni aspetti funzionali dei tre sistemi cellulari già introdotti, PC12, cromaffini e neuroni ippocampali. Intendiamo riaprire il problema della identificazione e dello studio dei geni (e dei loro prodotti) bersaglio della espressione regolata da REST e in generale dei meccanismi e dei risultati dell’azione di REST. Studi recenti, infatti, hanno rivelato come il ruolo del fattore silenziatore sia più complesso di quanto ritenuto finora, in particolare perché REST fa parte di un complesso, BRAF-HDAC, e può essere regolato esso stesso da altri membri del complesso, come BHC80. L’identificazione degli effetti di REST, ottenuta attraverso l’uso di costrutti specifici, costituisce quindi uno scopo chiave della nostra proposta. Le prospettive che potranno aprirsi a partire dai nostri risultati saranno senz’altro importanti. Tra queste, il possibile ruolo di REST nella long term potentiation, il processo neuronale base della memoria e dell’apprendimento; una nuova visione del processo differenziativo neuronale, da affiancare a quelli oggi studiati a partire da cellule ad un livello di differenziamento ben più arretrato (stem cells). Un altro scopo importante sarà lo studio di caratteri che compaiono nei cloni defettivi in seguito alla perdita della loro competenza neurosecretiva, come la intensa espressione di organelli specifici per l’esocitosi regolata scoperti dall’Unità 1, gli enlargosomi. Le caratteristiche di questi ultimi, in particolare un loro possibile ruolo di liberazione di prodotti secretivi, il collegamento tra la loro espressione e la perdita della competenza, la loro possibile somiglianza con altri tipi di organelli esocitici, come quelli che servono al traffico del trasportatore del mio-inositolo, rappresentano ulteriori scopi della proposta.
Per concludere, l’ampio approccio sperimentale e le caratteristiche delle Unità che lo propongono appaiono come strumenti necessari per affrontare in modo complessivo un problema complesso come quello del differenziamento e l’acquisizione della competenza neurosecretiva. Pur presentando proprietà tipiche della ricerca di base il nostro progetto potrà probabilmente offrire l’opportunità di sviluppi anche di interesse applicativo in tema di specificità e terapia cellulare. Esso presenta quindi interesse anche da questo punto di vista. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I neuroni e le cellule neurosecernenti sono tra i sistemi cellulari più complessi, sia in tema di espressione genica che di struttura e organizzazione spaziale. Tra di loro, quindi, esistono notevoli differenze che non riguardano solo la loro specificità di prodotti secretivi ma anche molteplici altri aspetti. Esistono però anche molte proprietà in comune, già intensamente studiate a diversi livelli: cellulare, molecolare, elettrofisiologico, farmacologico. Anche se ancora non può dirsi completa, la nostra comprensione della neurosecrezione è profonda ed articolata, tale da rispondere a molte delle domande sollevate in passato. Per riassumere, è ormai chiaro che organelli specifici, le vescicole chiare e dense, così dette per il loro aspetto in microscopia elettronica, accumulano prodotti secretivi idrofili sintetizzati o nel reticolo endoplasmico – con successivo trasporto attraverso il complesso di Golgi ed il TGN – oppure nel citosol, e li liberano per esocitosi regolata in risposta a stimolazioni adeguate. L’esocitosi regolata consiste nella fusione, mediata da interazioni tra specifiche proteine e indotta dall’influsso di Ca2+, tra la membrana che delimita le vescicole e la membrana plasmatica, ed è seguito dal riciclo della membrana fusa e dalla rigenerazione delle vescicole (vedi Sudhof, 2004).
L’informazione sulla neurosecrezione riassunta finora si riferisce soprattutto al processo come tale ed ai suoi meccanismi. Esistono però altri aspetti che, quantunque importanti, hanno richiamato minore attenzione e sono quindi molto meno conosciuti e compresi. In particolare, noi faremo riferimento a due di questi aspetti: la competenza per la neurosecrezione, cioè il processo attraverso il quale le cellule acquisiscono le proprietà molecolari e strutturali (quali enzimi, membrane specifiche, prodotti di secrezione, complessi processi fusogeni) necessari alla neurosecrezione; e la molteplicità dei processi di esocitosi regolata, alcuni dei quali non servono probabilmente alla neurosecrezione come tale ma piuttosto ad altri scopi comunque importanti: il controllo della dimensione, della composizione e della funzione della membrana superficiale che oggi si sa essere dinamiche, anche a prescindere dalla liberazione di neurotrasmettitori.
Il processo di competenza è stato finora quasi completamente ignorato. Si sa naturalmente che, nel corso dello sviluppo, le cellule dapprima incompetenti per la neurosecrezione acquisiscono questa funzione, però insieme ad altre proprietà relative a funzioni diverse. La possibilità che l’espressione della neurosecrezione e delle funzioni acquisite insieme sia regolata da meccanismi diversi attivati in parallelo è stata sollevata (Borgonovo et al., 1998; Malosio et al., 1999) ma rimane ancora in gran parte da approfondire. Questa prospettiva appare comunque di grande importanza, non soltanto in relazione allo sviluppo. Esiste infatti la possibilità che cellule neurosecretive, molte delle quali di lunga sopravvivenza, perdono le funzioni specifiche precedentemente acquisite e le possano ri-acquisire, identiche o opportunamente modificate, in un momento particolare, fisiologico o patologico della loro attività. Risultati precedenti hanno dimostrato che un programma regolatorio di neurosecrezione, indipendente da altre funzioni, esiste realmente (Borgonovo et al., 1998; Malosio et al., 1999; Grundschober et al, 2002). I meccanismi che lo regolano, però, hanno cominciato ad essere chiariti solo recentemente. Per lo studio del problema è stato significativo l’isolamento del primo clone di PC12 completamente defettivo di neurosecrezione, cioè privo non solo degli organelli specifici ma anche di tutti i componenti cellulari che partecipano al processo (vedi Borgonovo et al., 1998; Malosio et al., 1999). Un secondo clone defettivo è stato isolato più di recente (Clementi et al., 1992). PC12 è la linea neurosecretiva che, a partire dal suo isolamento (Greene e Tischler, 1976) è stata la più spesso usata per studi specifici. Data la sua origine da un feocromocitoma, le cellule della linea presentano proprietà vicine a quelle delle classiche cellule neurosecretive, le cellule cromaffini. In seguito a trattamento con NGF le PC12 modificano la loro struttura e assumono quella di neuroni aminergici, con numerosi dendriti e formazioni di pseudo-sinapsi.
Gli sviluppi già realizzati, proprio a partire dall’uso dei cloni defettivi PC12, hanno introdotto il concetto che la competenza potrebbe essere regolata, in tutto o in parte, da un sistema di controllo della trascrizione, quel complesso BRAF-HDAC che include il fattore silenziatore ristretto neuronale (NRSF), in genere indicato come REST (Schoenherr e Anderson, 1995A). Quest’ultimo, infatti, è ritenuto scarsamente espresso nei sistemi neurosecernenti (Schoenherr e Anderson, 1995B; Ballas et al., 2005) incluse le cellule PC12 wild-type, mentre è invece abbondante nei cloni PC12 defettivi (non ancora pubblicato). Il ruolo di REST nella fisiologia cellulare delle cellule neurosecernenti è comunque assai complesso. Le informazioni disponibili anche sulle PC12, un tipo di cellule assai eterogeneo, prima e dopo differenziamento da NGF, non sono definitive. Altrettanto si può dire per le altre cellule che intendiamo studiare, le cromaffini e le GT1-7 che secernono GnRF. Per quanto riguarda il sistema nervoso, REST è represso durante differenziamento dei progenitori neuronali a neuroni (Schoenherr e Anderson, 1995B). Esso appare fondamentale nell’embriogenesi per la sua capacità di reprimere i geni neuronali in tessuti extra-neuronali e di prevenire l’espressione prematura di geni della differenziazione terminale nei precursori neuronali (Chen et al., 1998). Inoltre REST ha un ruolo chiave nel mantenimento del fenotipo neuronale, controllando l’espressione di geni che codificano per canali ionici, recettori per neurotrasmettitori, proteine delle vescicole sinaptiche, fattori neurotrofici e molecole di adesione. La maggior parte di questi geni contribuisce alle proprietà funzionali che governano attività specifiche, nei neuroni e nelle cellule neurosecernenti vere e proprie.
Nella maggior parte dei neuroni del sistema nervoso centrale dell’adulto, però, si trovano ancora livelli rilevabili di mRNA e proteina REST (Palm et al., 1998; Calderone et al., 2003; Brene et al., 2000). L’analisi con ibridizzazione in situ ha rivelato infatti nel cervello di ratto adulto una bassa ma diffusa espressione neuronale di mRNA per REST, con i livelli più alti nell’ippocampo (Palm et al., 1998). Sarebbe quindi prematuro concludere che il ruolo di REST nel sistema nervoso è sempre inibitorio anche perché studi recenti hanno dimostrato che l’attività neuronale modifica i livelli di espressione del fattore di silenziamento. Non è stata però ancora chiarita la natura delle cellule in cui questo aumento avviene (Palm et al., 1998). Inoltre studi su un altro componente del complesso BRAF-HDAC, BHC80, hanno dimostrato che il suo ruolo non è sempre di regolazione sinergica con REST, come ritenuto finora, ma che può essere anche antagonista, convertendo l’effetto inibitorio di REST sulla trascrizione dei bersagli in una stimolazione (Iwase et al., 2004). L’interesse specifico di BHC80 per il lavoro qui presentato nasce dalla localizzazione del suo gene nella zona del cromosoma 11, che studi di citogenetica ancora non pubblicati hanno dimostrato essere necessaria, anche se probabilmente non sufficiente, per il ripristino della competenza neurosecretiva nelle cellule PC12 defettive. Se le cose stanno davvero come da questi risultati, il complesso BRAF-HDAC potrebbe giocare un ruolo doppio, alternativamente di inibizione o di stimolazione dell’espressione degli stessi geni, a seconda delle condizioni funzionali. La prospettiva aperta da queste osservazioni, di grande interesse per la fisiologia e la farmacologia del sistema nervoso centrale, è che REST abbia un ruolo importante nei processi di plasticità sinaptica. Molti dei geni attivati nel corso del potenziamento a lungo termine, processo base dei fenomeni di apprendimento e memoria, sono infatti bersagli della inibizione da parte del sistema REST (Bozon et al., 2003; Metsis et al., 1993; Sato et al., 2000; Thiel et al., 1994, Zafra et al., 1990). Al momento però il problema rimane aperto e per questo intendiamo occuparcene.
Anche per quanto riguarda la molteplicità delle esocitosi regolate i cloni defettivi di PC12 isolati nel laboratorio dell’Unità 1 hanno avuto considerevole importanza, insieme però a numerosi altri strumenti e sistemi cellulari studiati da laboratori diversi. È infatti ormai acquisito che numerose funzioni di neuroni e cellule neurosecernenti avvengano attraverso processi di esocitosi/endocitosi regolata non secretiva che permettono il continuo scambio di membrana tra la superficie e i compartimenti intracellulari in risposta a stimolazioni specifiche. Processi del genere avvengono in parallelo con la neurosecrezione e possono essere quindi completamente indipendenti. Da un punto di vista cellulare questi processi servono per un gran numero di funzioni importanti: l’espansione della superficie cellulare, il controllo dell’area di superficie, il trasporto e la distribuzione di proteine di importanza chiave per la fisiologia cellulare, quali recettori, pompe e canali. Molto di rado, però, queste forme di esocitosi regolata sono state inserite in un quadro generale insieme al traffico ed all’esocitosi delle vescicole neurosecretive, chiare e scure (per discussioni complessive del problema vedi Chieregatti e Meldolesi, 2005; Cocucci e Meldolesi, 2006).
In questo progetto di ricerca intendiamo occuparci di due sistemi di esocitosi regolata probabilmente non secretiva: quello degli enlargosomi e quello che serve per trasferire alla superficie di sinapsi e cellule neurosecernenti il trasportatore del mio-inositolo, indispensabile proprio per assicurare il funzionamento dell’esocitosi (Uldry et al., 2004). Degli enlargosomi sono note diverse proprietà incluse la rapidità e la dipendenza dal Ca2+ dell’esocitosi, che avviene con meccanismi diversi da quelli della neurosecrezione. Inoltre studi recenti hanno portato ad identificare una proteina esposta alla superficie citosolica, e a rilevare la ultrastruttura degli organelli marcati con l’anticorpo specifico accoppiato alla perossidasi. Nelle cellule a riposo questi organelli appaiono come piccole vescicole, 60 nm di diametro, distribuiti in prossimità della membrana plasmatica; dopo stimolazione si fondono con la superficie della cellula, dando luogo a tipiche immagini di esocitosi. Finora però l’enlargosoma non è stato isolato e la possibilità che esso contenga prodotti secretivi da liberare nell’ambiente extracellulare non è stata esclusa. Anche i meccanismi della sua espressione, in particolare la possibile dipendenza da REST, non sono stati studiati. Per quanto riguarda la vescicola del trasportatore le conoscenze sono ancora più limitate e lo studio potrà quindi essere programmato in parallelo a quello degli enlargosomi. <<<