RICERCA ITALIANA     

Effetto materno e ruolo dei fattori di trascrizione DAG nella germinazione del seme di Arabidopsis

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Le proteine DOF sono fattori di trascrizione a dito di zinco presenti solo nel regno vegetale.
Con un approccio di genetica inversa, basandoci sulle proprietà di mutanti knockout, abbiamo dimostrato in precedenza che due geni DOF strettamente correlati, DAG1 e DAG2, regolano con ruoli opposti il processo, indotto dalla luce, di germinazione del seme di Arabidopsis. Abbiamo anche dimostrato che I due geni sono attivi solo nella pianta madre e che la mutazione di entrambi i geni ha effetto materno.
Nuove evidenze sperimentali, che intendiamo verificare e chiarire mediante il lavoro qui proposto, suggeriscono la possibilità di nuovi e inaspettati meccanismi molecolari per spiegare questo effetto materno, e indicano un ruolo delle proteine DAG nell’alterare la trasduzione del segnale luminoso, mediata dal fitocromo B, che innesca il processo di germinazione del seme.
La ricerca proposta coordina il lavoro di due laboratori, di competenze complementari e comprovata capacità di collaborazione, nella verifica di queste possibilità e nella definizione dei relativi meccanismi. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Paolo Costantino Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Obiettivo di questa proposta è l'analisi del ruolo di due fattori di trascrizione (FT), DAG1 e DAG2, isolati da una delle unità di ricerca (UR) proponenti, nella regolazione della germinazione del seme. In particolare, sulla base di risultati acquisiti e di nuove forti evidenze, la proposta intende verificare se le proteine DAG vengano trasferite dalla pianta madre all'embrione e controllano la trasduzione del segnale luminoso da parte del fitocromo B (PhyB) nell'induzione del processo di germinazione del seme, o se l’effetto materno può essere spiegato da una regolazione (post)-trascrizionale dei geni DAG mediata da siRNA o miRNA.

La pianta utilizzata sarà Arabidopsis, specie modello per la quale sono disponibili i più numerosi e sofisticati strumenti e approcci molecolari, genetici e genomici e la cui anatomia e modalità di sviluppo sono state descritte in dettaglio.
Il lavoro proposto potrà essere svolto solo in stretta collaborazione tra le UR proponenti, che hanno background scientifici e strumentazioni complementari: biologia molecolare, genetica e biochimica (UR Costantino); morfologia, anatomia, istologia e citologia (UR Altamura). Le UR proponenti hanno una consuetudine di collaborazione consolidata negli anni, anche in precedenti studi sui FT in oggetto.

Va sottolineato che risultati della ricerca proposta, oltre a rappresentare un importante e del tutto innovativo contributo di conoscenza sui meccanismi di controllo della pianta sull'embrione, avranno rilevanti implicazioni di tipo biotecnologico.
Il controllo del tempo e delle condizioni di germinazione è infatti un fattore critico nelle pratiche agricole. D'altra parte il controllo del livello di dormienza, un tratto adattativo delle piante annuali (come lo sono molti raccolti) ha anch'essa importanti implicazioni in agricoltura e nel mantenimento della biodiversità vegetale. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Al completamento dello sviluppo dell'embrione fa seguito una fase di maturazione, durante la quale vengono acquisite tolleranza all'essiccamento e in alcuni casi, come in Arabidopsis, dormienza. A seguito dell'imbibizione del seme maturo, la radice dell'embrione protrude dall'involucro del seme e ha luogo la germinazione. L'interruzione della dormienza e l'inizio del processo di germinazione del seme sono determinati da segnali sia interni (ormoni) che esterni (luce, temperatura), e controllati da circuiti regolativi (e relativi FT) che determinano e integrano la risposta a questi segnali.
La UR Costantino è stata tra le prime a identificare la famiglia dei geni regolativi DOF (1). Questi geni, presenti esclusivamente nel regno vegetale, codificano FT caratterizzati da un singolo "dito di zinco" la cui sequenza è estremamente conservata in tutti i membri della famiglia. Nel genoma di Arabidopsis sono stati individuati 36 geni DOF e la UR Costantino ha dimostrato che due di questi - DAG1 e DAG2 (DOF Affecting Germination), altamente omologhi tra loro - controllano con ruoli opposti la germinazione del seme. Mediante un approccio di genetica inversa, la UR Costantino ha dimostrato che i semi dei mutanti inserzionali dag1 e dag2 hanno proprietà di germinazione alterate, in modo opposto tra loro, rispetto a semi di Arabidopsis WT. I semi di dag1 hanno perso la dormienza, richiedono minore segnale di PhyB e una minor livello di gibberelline per germinare di quelli WT, mentre semi di dag2 sono più dormienti e richiedono maggiori stimoli esogeni ed endogeni per germinare dei semi WT (2-4). I due geni hanno profili di espressione, indistinguibili l'uno dall'altro, limitati alla pianta madre, in accordo con l'effetto materno di entrambe le mutazioni dag. Sia analisi con il gene reporter GUS che ibridazioni di mRNA in situ, hanno dimostrato che i due geni DAG sono infatti espressi nel floema della pianta ma non nell'embrione ad alcun stadio di sviluppo (2-4). Ciò indica che i geni DAG mediano a livello trascrizionale il controllo della germinazione del seme da parte della pianta madre. Va sottolineato che a tutt'oggi DAG1 e DAG2 sono gli unici geni materni descritti che influenzano la germinazione del seme, ad esclusione di alcuni geni coinvolti nella sintesi di componenti (e quindi nell'integrità) dell'involucro del seme, che è di origine materna e che non sembra invece sostanzialmente alterato nei mutanti dag (2).
Molto recentemente, due linee di evidenza hanno aperto nuove eccitanti prospettive riguardo all'effetto materno delle mutazioni dag e all'azione dei FT DAG.
La prima evidenza, del tutto inaspettata, riguarda la localizzazione tissutale delle proteine DAG rispetto al profilo di attività dei rispettivi promotori e alla localizzazione degli mRNA.
Mediante microscopia a fluorescenza e confocale, abbiamo infatti rilevato che la fusione traduzionale DAG1 con la green fluorescent protein (DAG1:GFP), espressa in piante di Arabidopsis, è localizzata non solo nel tessuto vascolare ma anche in altri tessuti, in particolare nell'epidermide, indicando trasporto intercellulare di questa proteina. Questo fenomeno è inaspettato ma non del tutto insolito. In anni recenti è stato dimostrato infatti, in un numero per ora limitato di casi, che proteine e RNA possono essere, nelle piante, trasportate da cellula a cellula (5). Nel nostro caso, però, abbiamo rilevato fluorescenza associata alla GFP anche nei cellule di embrioni maturi derivati dall' autoimpollinazione delle piante contenenti la fusione DAG1:GFP. Ciò potrebbe indicare che la proteina DAG1 è trasportata anche dalla pianta madre all'embrione (un fatto finora mai riportato) o che il costrutto DAG1:GFP utilizzato ha perso un cruciale livello di controllo (post)trascrizionale che normalmente limita la presenza dell’mRNA di DAG1 alla piante madre.
Entrambe queste possibilità definirebbero un meccanismo del tutto nuovo per spiegare l’effetto materno nelle piante.
La seconda evidenza riguarda l'effetto sul PhyB delle mutazioni dag. Analizzando semi WT, dag1 e dag2 che esprimono una fusione PhyB:GFP, abbiamo osservato che il numero di particelle di fluorescenza ("speckles", dovuti ad aggregati di PhyB) nei nuclei di embrioni maturi dag1 e dag2 è riproducibilmente alterato rispetto ai nuclei di embrioni WT. Il PhyB viene attivato e traslocato nel nucleo in seguito a irraggiamento con luce rossa (6), quindi il diverso numero di "speckles" (che indica una diversa quantità di PhyB) può significare un'alterata distribuzione di PhyB tra citoplasma e nucleo, dal momento che la diffusa fluorescenza del citolasma ne impedisce una valutazione quantitativa e che il livello di espressione del costrutto PhyB:GFP è più o meno lo stesso in tutte le piante analizzate. In alternativa, potrebbe significare una diversa quantità totale di PhyB nella cellula, dovuta ad alterata stabilità o altro. In entrambi i casi questa osservazione conferma i dati ottenuti in precedenza e riportati sopra, di un'alterata sensibilità della germinazione dei semi dag al segnale mediato dal PhyB (3).
Questa proposta intende chiarire queste due evidenze per portare, insieme a dati che proverranno da altre linee di ricerca attive nella UR Costantino - una più vasta analisi della relazione (genetica e molecolare) dei geni DAG con altri FT e altri geni e ormoni (gibberelline e ABA) coinvolti nella germinazione; l'identificazione dei target regolativi dei FT DAG; l'identificazione di proteine che interagiscono con i FT DAG ecc. - ad un modello complessivo del ruolo delle proteine DAG1 e DAG2 nel controllo della germinazione dei semi di Arabidopsis. <<<