RICERCA ITALIANA     

COMPLICANZE OSTETRICHE DA ANTICORPI ANTI-FOSFOLIPIDI: meccanismi patogenetici molecolari quali nuovi target terapeutici e marcatori prognostici.

Università degli Studi di Milano

Abstract

Evidenze epidemiologiche/sperimentali indicano che gli anticorpi anti-fosfoplipidi (aPL) sono un fattore di rischio acquisito, suscettibile di trattamento terapeutico, per aborti ricorrenti e complicanze gravidiche.Comunque i meccanismi dell’insuccesso aPL-mediato della gravidanza sono ancora argomento di ricerca.Gli aPL si associano strettamente a trombosi, ma gli eventi trombotici non giustificano tutti gli aborti.D’altra parte c’è l’evidenza di un effetto diretto sul trofoblasto in vitro,dimostrata da differenziazione difettiva e apoptosi aumentata. Una reattività diretta è supportata anche da: a)l’espressione del target principale degli aPL (beta2glicoproteina I [GPI]) sul trofoblasto umano, che spiega la reattività diretta degli aPL (in particolare degli ab anti-beta2GPI), b)nostri dati preliminari indicanti che gli ab aPL/anti-beta2GPI legano anche cellule deciduali/endometriali umane in vitro.Il progetto affronterà questo tema:a)ampliando i dati sulla reattività degli ab aPL/anti-beta2GPI con le cellule deciduali/endometriali umane;b)valutando se il binding degli ab aPL/anti-beta2GPI alle cellule deciduali/endometriali possa influenzare le loro funzioni in vitro (in particolare sintesi di prolattina, espressione di integrine e secrezione di Tumor Necrosis Factor [TNF] alfa) come precedentemente osservato per la proliferazione/differenziazione del trofoblasto; c)indagando se i recettori/co-recettori putativi della beta2GPI su cellule endoteliali e piastrine (Annessina A2, ApoER2 e TLR-4) hanno un ruolo anche su trofoblasto e cellule deciduali/endometriali; d)caratterizzando gli eventi del signalling innescati dagli aPL che portano alla modulazione delle funzioni cellulari nel trofoblasto e, se confermati, in decidua/endometrio.Gli studi definiranno i meccanismi patogenetici molecolari di danno placentare aPL-mediato e potranno indicare nuovi approcci terapeutici. In effetti abbiamo osservato che peptidi sintetici che mostrano omologia aminoacidica con la porzione di beta2GPI coinvolta nel binding cellulare inibiscono l’adesione di beta2GPI al trofoblasto e la reattività degli ab.Inoltre inibitori del signalling intracellulare bloccano le vie innescate dagli ab in altri modelli sperimentali.Se l’ipotesi di lavoro è corretta, potremmo interferire con il binding degli ab ai tessuti placentari mediante ab bloccanti o ligandi neutri specifici per i recettori/co-recettori di beta2GPI, e con le vie di signalling innescate dagli ab usando inibitori ad hoc.Questa parte sarà svolta in vitro e in parte nel modello di aborto in vivo.
L’attivazione locale del complemento (C’) sembra avere un ruolo nei modelli murini di perdita fetale aPL-mediata.Comunque poco si sa su questo argomento nell’uomo.Per sviluppare questo aspetto, studieremo: a)la capacità di fissare C’ degli ab aPL/anti-beta2GPI reattivi con trofoblasto e cellule deciduali/endometriali, b)l’attivazione di C’ serico in vivo usando un nuovo test che valuta le tre vie di attivazione di C’ e c)il deposito di C’ nei tessuti placentari raccolti dai pazienti/controlli inclusi.I dati si correleranno con l’esito della gravidanza.
Infine, un’aumentata secrezione di TNF alfa placentare/sistemico contribuisce al danno infiammatorio nel modello sperimentale murino di aborto da aPL.Inoltre nostri dati preliminari indicano che anche le chemochine sono coinvolte nell’aborto aPL-mediato.Amplieremo queste osservazioni indagando la produzione sistemica/locale di chemochine e se antagonisti specifici proteggano gli animali dall’aborto ab-indotto.Trasferiremo lo studio anche nell’uomo con: a)determinazioni seriate dei livelli serici di citochine/chemochine pro-infiammatorie e b)caratterizzazione immunoistochimica dell’infiltrato cellulare e della produzione di citochine/chemochine locale (placentare) nei pazienti/controlli inclusi.Questa parte del progetto evidenzierà meccanismi patogenetici addizionali coinvolti nell’aborto da aPL e offrirà nuovi potenziali strumenti prognostici. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Pier Luigi Meroni Università degli Studi di MILANO

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo principale del progetto è indagare i meccanismi patogenici mediati dagli ab aPL/anti-beta2GPI e responsabili dei difetti di placentazione associati alla sindrome da anticorpi anti-fosfolipidi (APS).
Gli obiettivi specifici del progetto sono:
(1) Dimostrare la reattività diretta degli ab aPL/anti-beta2GPI con strutture superficiali di membrana di cellule deciduali/endometriali e la capacità degli anticorpi di modulare le funzioni cellulari, analogamente a quanto dimostrato con il trofoblasto.
(2) Identificare il possibile ruolo di specifici recettori di membrana (Annessina A2, ApoER2) e co-recettori del signalling (TLR-4) nel binding di beta2GPI al trofoblasto e alle cellule deciduali/endometriali umani in vitro.
(3) Indagare le vie di signalling innescate dal legame degli ab aPL/anti-beta2GPI con la beta2GPI espressa sulla membrana di cellule di trofoblasto e deciduali/endometriali.
(4) Valutare la capacità di anticorpi bloccanti specifici per Anessina A2, ApoER2 e TLR-4 o di ligandi neutri dei recettori (TIFI, RAP) di competere/inibire : a) il binding di beta2GPI a monolayer di trofoblasto e cellule deciduali/endometriali, b) le vie di trasduzione del signalling e c) gli effetti funzionali indotti nelle cellule dagli ab aPL/anti-beta2GPI in vitro.
(5) Valutare l’effetto protettivo di ligandi neutri o di ab bloccanti in un modello sperimentale in vivo di perdita fetale aPL-indotta.
(6) Valutare il ruolo patogenico di chemochine e citochine pro-infiammatorie nell’abortività associata ad APS ed il valore prognostico della loro determinazione seriata durante la gravidanza in pazienti con APS.
(7) Indagare la capacità di fissazione del complemento degli ab aPL/anti-beta2GPI reattivi con il trofoblasto o le cellule deciduali/endometriali e valutare il significato prognostico dell’attivazione del complemento in vivo in pazienti con APS.
(8) Caratterizzare il quadro immunoistologico (infiltrato cellulare, produzione di citochine/chemochine e deposito di C’) dei tessuti placentari ottenuti sia dai modelli animali che dalle pazienti arruolate.

RISULTATI ATTESI
1. Dimostrare che gli ab aPL/anti-beta2GPI sono in grado di indurre una placentazione difettiva influenzando direttamente i diversi tipi di cellule della placenta (trofoblasto, cellule deciduali ed endometriali).
2. Caratterizzare a livello molecolare l’interazione tra gli ab e le strutture cellulari di membrana (recettori di beta2GPI, vie di signalling).
3. Dimostrare la possibilità di interferire con la placentazione difettiva mediata dagli ab aPL/anti-beta2GPI utilizzando molecole bloccanti/antagoniste innovative in modelli sperimentali in vitro ed in vivo.
4. Dimostrare il coinvolgimento di processi infiammatori locali (chemochine, citochine pro-infiammatorie, attivazione del complemento) come meccanismi patogenici nell’abortività associata ad APS.

Nell’insieme il progetto offrirà:
a) nuovi punti di vista sui meccanismi patogenetici fini dell’abortività APS-associata;
b) la comprensione del meccanismo di azione di sostanze correntemente impiegate nella prevenzione degli aborti;
c) possibili approcci terapeutici innovativi;
d) possibili nuovi strumenti prognostici. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

1.Background
Gli anticorpi antifosfolipidi (aPL) sono una famiglia eterogenea di autoanticorpi (autoab) identificabili per la loro capacità di prolungare i test funzionali di coagulazione PL-dipendenti e/o reagire con complessi di PL anionici e proteine che legano PL in test in fase solida. La beta2 glicoproteina I (beta2GPI) è il principale target antigenico e l’acronimo aPL/anti-beta2GPI definisce la più importante sottopopolazione di ab patogenetici (1).
Gli aPL sono associati con trombosi arteriose e/o venose ricorrenti e/o con aborti ripetuti e complicanze gravidiche (pre-eclampsia precoce e grave) in assenza di altri fattori di rischio noti. La presenza di aPL in pazienti con questi eventi definisce la sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS). L’APS può essere primaria o associata a malattie autoimmuni (principalmente lupus eritematoso – SLE)(1).
Gli aPL, oltre ad essere uno strumento diagnostico, hanno effetti patogenetici in modelli sperimentali in vitro ed in vivo. Inoltre studi clinici prospettici hanno confermato l’associazione tra aPL e manifestazioni cliniche di APS. Quindi la sindrome è ora accettata come malattia autoimmune ab-mediata(2,3).

2. Meccanismi patogenetici di aborto aPL-mediato
Sono stati suggeriti diversi meccanismi patogenetici per spiegare le manifestazioni ostetriche associate a APS (4,5).

2.1 Manifestazioni trombotiche
Trombosi intraplacentari con alterato scambio di sangue materno-fetale sono state tradizionalmente proposte come evento patogenico principale. L’esame istologico di placente da donne con APS ha supportato l’ipotesi di un possibile ruolo della trombosi (6-8). Inoltre studi in vitro hanno dimostrato che IgG aPL favoriscono uno stato pro-coagulante aumentando la sintesi di tromboxano placentare e spiazzando l’anticoagulante naturale Annessina V del trofoblasto(9,10). Ciò nondimeno studi epidemiologici indicano che la trombosi non giustifica tutti gli aborti e nella maggioranza delle placente da APS non si trovano segni istopatologici di trombosi(11). Inoltre è improbabile che trombosi intraplacentari siano responsabili di aborti nel primo trimestre ed è stato suggerito che in questi casi il meccanismo patogenico primario sia un’anomala invasività del trofoblasto(12).

2.2 Placentazione difettiva
Evidenze da modelli sperimentali di APS in vitro suggeriscono che gli aPL abbiano un effetto diretto sul trofoblasto modificando la sua differenziazione/maturazione mediante meccanismi non correlati con la trombosi.E’ stato infatti riportato che gli aPL legano il trofoblasto in vitro e possono indurre apoptosi, inibizione di proliferazione e formazione del sincizio, riduzione della produzione di gonadotropina corionica (hCG) e invasività difettiva(13-16). Tutti questi effetti aPL-mediati potrebbero causare difetti di placentazione.
La dimostrazione dell’espressione di beta2GPI sulla membrana di cellule di trofoblasto spiega il tropismo placentare degli aPL, essendo beta2GPI il principale target antigenico degli aPL(17).E’ stato suggerito che beta2GPI,come proteina plasmatica cationica, possa legare fosfatidilserina (PS) esposta all’esterno della membrana cellulare del trofoblasto durante la formazione del sincizio(18).In accordo, sia monoclonali murini e umani che IgG policlonali da pazienti con APS si legavano a monolayer di trofoblasto in studi in vitro(13,15,18,19).Queste osservazioni spiegano perché aPL infusi passivamente in topi naïve gravidi scompaiono rapidamente dal circolo e si ritrovano nei tessuti placentari(20,21).Questi ab, una volta legati, possono influenzare le funzioni del trofoblasto(22,23).Abbiamo trovato che frazioni policlonali IgG da pazienti con APS e ab monoclonali IgM umani con attività anti-beta2GPI legavano il trofoblasto umano e modificavano l’invasività e la sintesi/secrezione di hCG solo in presenza di beta2GPI(15). In linea con questi dati è l’osservazione che un moAb anti-beta2GPI inibiva la proliferazione di una linea di coriocarcinoma umano in vitro(24). L’invasione del trofoblasto è un processo dinamico regolato da una complessa serie di interazioni tra trofoblasto stesso e decidua(25).Abbiamo di recente riportato che gli aPL alterano anche l’espressione di integrine e caderine, alterando così l’invasione del trofoblasto in vitro(26).E’ stato suggerito che gli aPL possono modificare anche la placentazione inducendo l’incremento di apoptosi.E’ stato riportato che frazioni policlonali IgG da donne con aborti ricorrenti e APS secondaria a SLE o sieri con attività LA aumentano l’apoptosi rispettivamente in embrioni di ratto o colture di espianti placentari(16,27).Risultati simili sono stati ottenuti anche incubando moAb murini anti-PS con colture di embrioni di ratto(28) ma non coltivando monolayer di trofoblasto con moAb umani IgM anti-beta2GPI(29).
Nell’insieme questi dati suggeriscono che gli aPL possono essere patogenici influenzando numerose funzioni del trofoblasto senza necessariamente coinvolgere fenomeni trombotici.
Sebbene ci sia l’evidenza che gli aPL reagiscano direttamente con il trofoblasto (in particolare il sinciziotrofoblasto), sono scarsi i dati di letteratura sulla possibile reattività con le cellule deciduali/endometriali.Data l’armoniosa cooperazione tra trofoblasto e cellule deciduali/endometriali nella placentazione fisiologica, la comprensione dell’interazione tra aPL e cellule deciduali/endometriali è cruciale per conoscere gli effetti patogenici degli autoab.A questo proposito, un moAb xenogenico murino con attività anti-beta2GPI inibiva la sintesi/secrezione di prolattina (PRL) in cellule endometriali stromali in vitro(30).Un altro lavoro indicava che sieri aPL-positivi modificavano il rilascio di eicosanoidi e la sintesi/secrezione di PRL in colture di cellule deciduali umane in vitro(31). Mentre nel primo studio il moAb ottenuto da immunizzazione attiva non si poteva paragonare ad autoab spontanei, nell’ultimo gli autori usavano sieri aPL-positivi in toto senza escludere la possibilità che gli effetti osservati fossero dovuti a componenti serici diversi dagli aPL.Nostri dati preliminari indicano per la prima volta che frazioni IgG policlonali da APS con elevata attività anti-beta2GPI sono in grado di legare colture primarie di cellule deciduali/endometriali umane.Più interessante è che la stessa attività di binding è stata trovata sia con IgG anti-beta2GPI purificate per affinità sia con moAb umani IgG con specificità anti-beta2GPI(figura 1).Queste osservazioni offrono il razionale per lo studio del possibile effetto funzionale degli aPL su cellule deciduali/endometriali umane.


Figura 1:binding di differenti preparazioni anticorpali di aPL/anti-beta2GPI a monolayer di cellule umane di decidua e di endometrio.

2.3 Infiammazione e aborti aPL-mediati
E’ stato di recente osservato che l’inibizione della cascata del complemento (C’), mediante C3 convertase inhibitor complement receptor 1-related gene/protein y (Crr)-Ig, inibisce l’aborto e il ritardo di crescita indotti da immunizzazione passiva con IgG APS in topi naïve gravidi. Inoltre topi mancanti del fattore C3 erano resistenti al danno fetale aPL-mediato(32). Ulteriori studi hanno dimostrato che il componente C5 del complemento (in particolare il suo prodotto di cleavage C5a) e il reclutamento di neutrofili nella decidua erano necessari per l'insorgenza dell’aborto in questo modello sperimentale murino(33).Il coinvolgimento di C’ nell’APS umana è comunque ancora un capitolo aperto.Se pochi lavori hanno dimostrato che gli aPL fissano il C’ in modelli sperimentali sia in vitro che in vivo(34-36), non ci sono dati sulla capacità di fissare il C’ degli aPL che reagiscono con la placenta umana.
Nello stesso modello sperimentale è stato dimostrato che gli aPL riconoscono i tessuti deciduali e inducono un rapido aumento dei livelli locali e sistemici del Tumor Necrosis Factor (TNF) alfa.Inoltre il blocco di TNF alfa risultava protettivo nell’aborto aPL-mediato(37). Anche le chemochine infiammatorie sembrano essere coinvolte in modelli sperimentali di perdita fetale. In effetti noi abbiamo osservato che l’attività abortiva di Lipopolisaccaride (LPS) è mediata da un incremento locale e sistemico dei livelli di chemochine.In linea con queste osservazioni, il pre-trattamento di topi gravidi con una miscela di ab bloccanti anti-chemochine protegge da aborto LPS-indotto.Al contrario, l’esposizione a LPS di topi D6 deficienti (D6-/-) gravidi esita in un incremento dell’infiltrato leucocitario placentare e del grado di abortività (figura 2). D6 è un recettore che riconosce e porta alla degradazione molte chemochine CC infiammatorie, è espresso in placenta, sul trofoblasto invasivo e sul lato apicale delle cellule del sinciziotrofoblasto, all’interfaccia tra il sangue materno e il feto.La sua assenza rende gli animali più suscettibili agli effetti di una iperproduzione di chemochine.E’ da notare che l’esposizione di topi D6-/- a IgG aPL umane esita in un aumento della percentuale di riassorbimento fetale (dati preliminari delle Unità n.4 e 1). Le chemochine pro-infiammatorie sembrano quindi essere coinvolte nell’aborto aPL-mediato in animali da esperimento (figura 2).

Figura 2: ruolo di D6 nell’aborto LPS- e aPL-indotto. (a) Percentuale di aborti e (b) animali con abortività in topi WT e D6-/- trattati con fisiologica (barre bianche) o LPS (barre nere e grigie) dopo esposizione a una miscela di ab bloccanti le chemochine (barre grigie) o ab irrilevante (barre nere).I dati sono un compendio di 3 esperimenti con 18 topi WT e 10 D6-/- trattati con fisiologica, con 167 e 86 feti rispettivamente, 35 WT e 33 D6-/- trattati con LPS e ab irrilevante, con 272 e 257 feti rispettivamente, e 5 WT e 7 D6-/- trattati con LPS e ab bloccanti, con 33 e 61 feti rispettivamente. (c) Percentuale di aborti e (d) animali con abortività in topi WT e D6-/- trattati con aPL (barre nere) o controllo isotipico (barre bianche). I dati derivano da 14 topi WT e 12 D6-/- trattati con fisiologica, con 114 e 105 feti rispettivamente, e da 16 WT e 21 D6-/- trattati con aPL, con 157 e 216 feti rispettivamente. Ns, differenza non significativa; *p&lt;0.05; **p&lt;0.01 (test esatto di Fisher).
Questi dati dimostrano un ruolo potenziale dell’infiammazione nella patogenesi dell’aborto aPL-mediato in modelli animali e suggeriscono che eventi simili si verifichino anche nell’uomo.

3.1 Recettori di membrana per beta2GPI
Il meccanismo responsabile dell’adesione/espressione di beta2GPI alla membrana cellulare del trofoblasto è noto solo in parte.La sostituzione di uno o più aminoacidi nel PL-binding site del V dominio della molecola ne riduce la capacità di legame a piastre copulate con PL, ma non influenza il riconoscimento dei mutanti da parte degli ab anti-beta2GPI(38,39).Abbiamo dimostrato che mutazioni del PL-binding site riducono l’adesione di beta2GPI a monolayer di trofoblasto in vitro come evidenziato dalla perdita del legame degli ab anti-beta2GPI(40).
Una volta legata la beta2GPI adesa al trofoblasto, gli ab anti-beta2GPI inibiscono significativamente il rilascio e l’espressione di mRNA di hCG indotti da GnRH in colture di trofoblasto umano (15). Mutazioni del PL-binding site aboliscono tutti gli effetti ab-mediati riducendo l’adesione di beta2GPI al trofoblasto(40).Quindi l’interazione tra il PL-binding site cationico e strutture a carica negativa sul trofoblasto è importante per supportare l’adesione di beta2GPI e gli effetti funzionali mediati dagli ab che riconoscono la molecola. E’ da notare che un peptide sintetico di 20 aminoacidi derivato da Citomegalovirus (TIFI) e con sequenza uguale al PL-binding site del V dominio della beta2GPI inibisce la trombosi aPL-indotta in vivo(41). In collaborazione con il gruppo della Prof. Pierangeli (Morehouse School of Medicine, Atlanta, USA) abbiamo trovato che TIFI (20 µg/ml) inibiva in vitro il binding di beta2GPI fluorescinata (FITC) (50 µg/ml) a cellule endoteliali umane (EC) in coltura (figura 3b) (e a monociti murini, non riportato) mediante microscopia a fluorescenza. I dati indicano che nel topo TIFI inibisce le proprietà trombogeniche in vivo degli ab aPL/anti-beta2GPI competendo con l’adesione della beta2GPI e il suo riconoscimento da parte degli ab sulle cellule target coinvolte nella cascata della coagulazione.Dati preliminari dell’Unità n.3 mostrano che l’incubazione di monolayer di trofoblasto con concentrazioni seriali di TIFI abolisce in modo dose-dipendente il binding degli aPL/anti-beta2GPI alle cellule (figura 3a).Queste osservazioni suggeriscono che TIFI può avere un effetto paragonabile anche su monolayer di trofoblasto umano. Inoltre possono offrire una via innovativa per ridurre il tropismo placentare degli ab anti-beta2GPI materni e da ultimo i loro effetti patogenici.


Figura 3: a)binding di IgG anti-beta2GPI umane a monolayer di trofoblasto. Le colture sono state incubate con IgG (50 µg/ml), beta2GPI (5 µg/ml) e TIFI a concentrazioni proteiche seriali (da 0 a 20 µg/ml).I valori di binding sono espressi come media delle unità di densità ottica (O.D.); b)effetto di TIFI sul binding di beta2GPI-FITC a EC in vitro.
Ci sono evidenze indirette che Annessina A2, un recettore dell’attivatore del plasminogeno tissutale e del plasminogeno, e il toll-like receptor 4 (TLR-4), un recettore di LPS, possono legare beta2GPI e innescare il signalling intracellulare in EC(42,43).Inoltre è stato dimostrato che il recettore di tipo 2 di Apolipoproteina E (ApoER2, un membro della famiglia dei recettori delle LDL) funziona come recettore di beta2GPI nelle piastrine(44).Dato che tutti i recettori/co-recettori sopra menzionati si trovano sui tessuti placentari, almeno a livello di mRNA(45-47), è probabile che queste molecole siano coinvolte anche nel binding di beta2GPI alla placenta e nel signalling cellulare.Finora non ci sono comunque informazioni su questo aspetto.

3.2 Signalling cellulare mediato da ab anti-beta2GPI
Studi in vitro hanno evidenziato che il binding degli ab a beta2GPI induce perturbazioni della membrana cellulare in grado di trasdurre segnali intracellulari.Pur essendoci più dati sulle EC (figura 4), osservazioni simili sono state riportate anche per monociti e piastrine(48-50).

Figura 4:signalling intracellulare indotto da ab aPL/anti-beta2GPI mediante i recettori putativi di beta2GPI in EC.
Studi in topi LPS-non responsivi hanno mostrato che essi sono protetti da trombofilia e attivazione di EC indotte da APS-IgG in vivo(51).Questi topi hanno una mutazione puntiforme del gene tlr4 che porta all’espressione di un TLR-4 che non riconosce LPS. Perciò TLR-4 è apparentemente coinvolto negli effetti aPL-mediati in vivo(51). E’ interessante notare che abbiamo osservato che polimorfismi di singoli nucleotidi (SNP) di tlr4, associati ad alterata trasduzione del segnale LPS-indotta e protettivi dall’infiammazione(52), sono significativamente ridotti in pazienti con APS e trombosi associate(51). Questi dati preliminari suggeriscono che il signalling TLR-4-mediato è coinvolto nella trombofilia mediata da ab aPL/anti-beta2GPI in vivo.
Il/i recettore/i per beta2GPI possono coinvolgere più di una proteina, in forma di complesso che clasterizza o cross-reagisce con gli ab aPL/anti-beta2GPI e innesca il signalling intracellulare, che porterebbe a risposte funzionali anomale nelle cellule.Non ci sono informazioni sulle vie di signalling coinvolte nell’interazione tra ab aPL/anti-beta2GPI e trofoblasto o cellule deciduali/endometriali umani.
La comprensione della natura del/i recettore/i e della sua/loro interazione con beta2GPI (es. signalling intracellulare) può aiutare a definire nuove modalità mirate al trattamento e alla prevenzione. Per esempio l’espressione, la funzione e la trascrizione del Tissue Factor indotte da APS-IgG in vitro venivano inibite trattando EC umane con inibitori specifici della via di p38MAPK (SB203580 e MG132)(53). <<<