RICERCA ITALIANA     

Meccanismi di controllo dell’eritropoiesi e policitemie congenite e familiari: ruolo delle vie di risposta alla pressione di ossigeno

Seconda Università degli Studi di Napoli

Abstract

La regolazione dell’omeostasi dell’ossigeno è critica per la sopravvivenza. L’ipossia determina un aumento dei livelli del fattore di trascrizione HIF1 (hypoxia-inducible factor), che è parte dei meccanismi di regolazione trascrizionale dell’eritropoietina (Epo), VEGF e di numerosi atri geni O2-dipendenti. HIF1 è composto di due subunità, HIF1-alfa e HIF1-beta, che formano un eterodimero; solo HIF1-alfa è regolato dall’ipossia. La degradazione ubiquitina-mediata di HIF1-alfa (dipendente dalla normossia) rappresenta il maggior meccanismo di controllo dei livelli della proteina. I livelli del fattore di trascrizione aumentano in condizioni ipossiche e tornano alla normalità in normossia.
L’ubiquitinazione di HIF1-alfa richiede una reazione di idrossilazione in prolina (O2 dipendente) che commissiona la proteina per l’interazione con una E3 ubiquitina proteina ligasi. Il complesso E3 è formato da varie proteine: von Hippel-Lindau (VHL), elongina B e C, cullina 2, e RBX1.
La policitemia di Chuvash è la sola forma di policitemia congenita dovuta ad anormalità nella vie dipendenti dall’ossigeno. La malattia recessiva autosomica, endemica nella regione russa della Chuvashia, è una patologia non benigna caratterizata da un alto contenuto di emoglobina, alta Epo plasmatica, vene varicose, emangioma vertebrale e bassa pressione ematica. I pazienti affetti da policitemia di Chuvash muoiono precocemente, per vasculopatie cerebrali o trombosi periferiche. Un genome-wide screening e la caratterizzazione dei geni candidati hanno dimostrato che la mutazione Arg200Trp (C598T) di VHL causa la policitemia di Chuvash. Tutti i pazienti affetti da tale eritrocitosi sono omozigoti per la mutazione C598T, mentre tutti i portatori obbligati sono eterozigoti.
Di recente, abbiamo dimostrato che ad Ischia (un’isola della baia di Napoli) esiste un cluster di policitemia di Chuvash con una frequenza in eterozigosi più alta di quella osservata in Chuvashia. Inoltre, abbiamo osservato che la policitemia congenita è estremamente frequente in Sud Italia.
Sulla base di queste osservazioni, abbiamo proposto un progetto il cui scopo generale è chiarire le basi molecolari delle varie forme di policitemia congenita dovute ad alterazioni delle vie responsive all’ipossia. Fino ad ora, abbiamo raccolto più di 100 casi di policitemia ereditaria ed identificato varie alterazioni genetiche, tra cui: mutazioni VHL classiche (C598T), nuove mutazioni VHL e mutazioni nel recettore dell'Epo. Inoltre, abbiamo osservato numerosi casi di eritrocitosi senza mutazioni VHL ma associate ad alterazioni di vie O2-dipendenti.
Obiettivi del progetto proposto includono: a) lo sviluppo di strategie biochimiche per identificare i meccanismi delle alterazioni del metabolismo di HIF1-alfa e/o delle risposte all’ipossia; b) lo sviluppo di una banca italiana della policitemia congenita insieme alla preparazione di linee linfoblastoidi da tutti i pazienti policitemici; c) l’identificazione dei meccanismi responsabili per una aumentata risposta proliferativi dei precursori eritroidi dei policitemici all’Epo, e d) la caratterizzazione delle basi molecolari della policitemia in soggetti con un solo allele di VHL mutato.
Inoltre, la disponibilità di una famiglia con un gene del recettore di Epo mutato (che determina una proteina tronca al C-terminale) ci permetterà di studiare i processi con cui l'Epo regola la proliferazione ed il differenziamento eritroide.
In conclusione, il nostro studio, impiegando numerose condizioni di alterazioni genetiche ed approcci di biochimica, biologia cellulare e genetica ci permetterà di acquisire nuove importanti informazioni sulle vie che collegano i livelli di ossigeno ematico al controllo dell’eritropoiesi. Inoltre, otterremo nuove dati sulla politicitemia congenita, un malattia non benigna, i cui meccanismi patogenetici sono largamente sconosciuti e la cui caratterizzazione e classificazione clinica ancora aspetta basi razionali. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Fulvio Della Ragione Seconda Università degli Studi di NAPOLI

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il progetto presentato ha l’obiettivo generale di studiare e chiarire i meccanismi molecolari dei processi regolati dall’ossigeno e, nel contempo, investigare le alterazioni che determinano una accelerata eritropoiesi e una conseguente policitemia.
Questi studi verranno condotti attraverso una efficace integrazione tra biochimici, genetisti e clinici.
E’ noto che in condizioni ipossiche, le cellule renali producono significative quantità di eritropoietina (Epo), una importante citochina che stimola il midollo osseo ad aumentare la produzione e maturazione di globuli rossi. La risposta dei precursori eritroidi all’Epo è legata all’attivazione del suo recettore, che dopo l’interazione con il suo ligando forma sia omodimeri che eterodimero con altri recettori (c-Kit).
L’attivazione del recettore per l’Epo determina una complessa serie di eventi, inclusa in particolare la fosforilazione di numerose (almeno 8) tirosine localizzate nel dominio citoplasmatico del recettore. Successivamente, il recettore attivato induce l’attivazione di varie vie di trasduzione del segnale che determina un incremento di proliferazione e il differenziamento dei precursori eritroidi. Contemporaneamente, il recettore attivato è in grado di indurre una serie di circuiti endogeni i quali determinano lo “spegnimento” del recettore stesso.

Il meccanismo attraverso il quale l’ipossia attiva l'espressione del gene codificante per l'Epo è estremamente complesso. In breve, bassi livelli di O2 inducono un aumento dei livelli di un fattore di trascrizione, HIF1-alfa, e la conseguente attivazione trascrizionale dei suoi geni bersaglio (in particolare, Epo e VEGF).
L’ossigeno controlla i livelli di HIF1-alfa mediante meccanismi post-trascrizionali. Infatti, bassi livelli di O2 prevengono la degradazione di HIF1-alfa, degradazione che normalmente si ha attraverso un processo di ubiquitinazione che coinvolge come attività E3 (E3 ligasi) un complesso che include la proteina VHL (von Hippel-Lindau).
Livelli normali di O2, al contrario, determinano una rapida rimozione di HIF1-alfa con conseguente contenuto cellulare del fattore di trascrizione estremamente basso.

Recentemente, i gruppi di ricerca che partecipano a questo progetto hanno dimostrato che una attivazione costitutiva delle vie regolate dall’ipossia determinano un aumentata produzione di Epo ed una significativa eritrocitosi. L’alterazione genetica coinvolge la proteina VHL che, come descritto in precedenza, normalmente previene l’attivazione delle vie che rispondono all’ipossia e, quindi, la produzione di Epo. La policitemia congenita dovuta a mutazione di VHL (C598T) è stata per la prima volta dimostrata in Chuvashia, una regione della Russia ed è stata pertanto definita come “Chuvash polycytemia”.

Noi abbiamo sorprendentemente dimostrato una frequenza veramente elevata della policitemia di Chuvash nel Sud Italia, e particolarmente in Ischia, un’isola della baia di Napoli (Perrotta et al. Blood. 107, 514-9: 2006).
La scoperta che questa malattia fosse endemica in queste zone ci ha spinto a studiare in modo dettagliato i meccanismi molecolari alla base di questa forma di policitemia.
Inoltre, abbiamo raccolto un numero significativo di casi di policitemia che mostrano alterazioni genetiche diverse dalla mutazione Chuvash. Queste alterazioni coinvolgono sia il gene VHL (nuove mutazioni non-Chuvash) sia in geni non ancora individuati ma comunque connessi ai meccanismi di risposta all’ipossia.
Infine, nel corso di questi studi abbiamo identificato una forma dominante di policitemia legata ad una alterazione del gene per il recettore dell’Epo che risulta in una forma tronca di tale proteina.

La disponibilità per la prima volta di una così grande casistica di differenti alterazioni genetiche, tutte coinvolgenti le vie molecolari regolate dalla pressione ematica di O2. rappresenta una base sperimentale estremamente solida per contribuire a chiarire i processi regolati dall'ipossia tissutale.

Sulla base di quanto descritto, il progetto da noi proposto ha i seguenti obiettivi:
1. Costruzione di un registro e di una banca dei casi italiani di policitemia congenita e familiare
2. Sviluppo di metodologie biochimiche per studiare alterazioni funzionali delle vie regolate dall’O2 e dall’attivazione del recettore per l’Epo
3. Preparazione di linee linfoblastoidi stabili e di di cellule BFU-E e CFU-E dai casi di policitemia congenita
4. Caratterizzazione molecolare e clinica di pazienti affetti da policitemia dovuta a mutazioni tipo Chuvash (VHL C598T)
5. Caratterizzazione molecolare e clinica di pazienti affetti da policitemia dovuta a mutazioni di VHL differenti da quella Chuvash
6. Caratterizzazione molecolare e clinica di pazienti affetti da policitemia congenita non dovuta a mutazioni di VHL ma legata ad alterazioni delle vie di risposta all’ipossia
7. Caratterizzazione dei meccanismi molecolari alla base dell’eccessiva risposta all’Epo osservata nelle cellule eritroidi da pazienti affetti da policitemia congenita
8. Caratterizzazione molecolare e clinica di pazienti affetti da policitemia dovuta a mutazioni di un solo allele del gene VHL
9. Caratterizzazione molecolare e clinica di pazienti affetti da policitemia dovuta ad alterazioni del gene codificante per il recettore dell’Epo

Numerose considerazioni suggeriscono che gli obiettivi sopra riportati possano essere raggiunti.
Prima di tutto, casi di policitemia con alterazioni genetiche descritte sono già disponibili nei laboratori dei proponenti il progetto, Inoltre, numerosi nuovi casi (ancora non analizzati) sono stati raccolti negli ultimi anni
Secondo, la collaborazione tra le unità è iniziata da numerosi anni e ha dato significativi risultati in varie tematiche dell’eritropoiesi.
Le singole unità presentano un considerevole background in campo biochimico, genetico e clinico.
Infine, tutte le unità del progetto operano nella stessa Università, rendendo le interazioni e lo scambio di materiale e di idee estremamente facili.

I risultati potranno contribuire significativamente a chiarire i numerosi aspetti oscuri dei meccanismi regolati dall’ossigeno. Inoltre, gli studi proposti forniranno nuovi dati sulla policitemia congenita, una malattia etereogenea con prognosi infausta, che ancora richiede sia la comprensione delle basi meccanicistiche che una classificazione razionale. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Le policitemie sono un gruppo eterogeneo di patologie definite come un aumento assoluto della massa eritrocitaria (1, 2). Le policitemie congenite possono essere:
1. Primarie e sono causate da a) alterazioni ereditarie nei meccanismi di risposta alla pressione dell’ossigeno o b) difetti ereditari intrinseci nei precursori eritroidi che determinano una aumentata risposta all’eritropoietina (Epo) (policitemia familiare e congenita)
2. Secondaria e dovuta a condizioni ereditarie che portano ad un aumento dei livelli sierici di Epo

Il controllo dell’omeostasi dell’O2 è critico per la sopravvivenza e l’ipossia tissutale può causare alterazioni cellulari e, infine, morte cellulare. Le maggiori cause di ipossia tissutale sono (a) diminuzione di ossigenazione ematica (come avviene in alcune patologie polmonari), (b) alterato rilascio da parte dell’emoglobina (associato ad alcune emoglobinopatie), e (c) alterata circolazione che porta ad anemia localizzata (ischemia) come nel caso di bassa pressione ematica o ostruzione vascolare. Allo scopo di adattarsi all’ipossia, sono state sviluppate numerose risposte fisiologiche. Queste includono, tra le altre, a) aumentata produzione di Epo, che attiva l’eritropoiesi; b) l’induzione ti tiroxina idrossilasi, che facilita il controllo della ventilazione, a c) la stimolazione della neoangiogenesi mediante l’incremento di “vascular endothelium growth factor (VEGF). A livello cellulare l’ipossia induce alcune alterazioni metaboliche che permettono il mantenimento della produzione di energia nonostante la diminuita disponibilità di O2.

Uno dei fattori centrali della risposta cellulare all’ipossia è il cosiddetto fattore inducibile dall’ipossia (HIF), che trascrizionalmente attiba l’espressione dei geni della risposta adattativi alla ridotta disponibilità di O2. HIF è un eterodimero formato da un di tre subunità (HIF1-alfa, HIF2-alfa e HIF3-alfa) legate as una subunità che è conosciuta come HIF1-beta. HIF1-alfa è un membro della superfamiglia delle proteine basiche elica-loop-elica (bHLH), in cui il dominio HLH lega il DNA e un dominio PAS e un dominio PAS facilita la forlaizone dell’eterodimero ( )
I geni bersaglio di HIF giocano un ruolo chiave nel metabolismo cellulare, nell’angiogenesi, nella proliferazione e sopravvivenza cellulare. Esempi di geni bersaglio di HIF includono fattori angiogenetici e di proliferazione (Epo e VEGF), recettori e trasportatori di membrana, proteine della matrice, fattori di trascrizione, proteine del citoscheletro ed enzimi gli colitici (aldolasi, G6P isomerasi, esochinasi, LDH A). HIF riconosce una sequenza consensus che contiene come nucleo di riconoscimento la sequenza 5’-TACGTG-3’ (5) nella regione al 5’ dei geni-inducibili dall’iposia. L’attivazione trascrizionale da HIF è legata alla sua capacità di reclutare proteine coattivatrici quali CBP, p300, coattivatore 1 del recettore degli steroidi, etf2 (4-6). Da notare che l’ipossia incrementa sensibilmente HIF1-alfa mentre non modifica HIF1-beta (7-11).

La comprensione dei meccanismi che regolano HIF1-alfa rappresenta uno dei risultati scientifici più interessanti degli ultimi anni. L’accumulo di HIF1-alfa è dovuto alla modulazione O2-dipendente della sua degradazione che coinvolge il processo di ubiquitinazione e la proteolisi da parte del proteasome 26S (12-14). La proteina di Von-Hippel Lindau (VHL) è richiesta per il processo di ubiquitanazione /15, 16). VHL insiema all’elongina B e C, la cullina 2 ed RBX1 forma un complessp ad attività di E3 ubiquitina proteina ligasi capace di riconoscere la proteina che attiva l’ubiquitina (E1) e l’enzima E2 coniugante l’ubiquitina in modo da determinare l’ubiquitinazione della proteina HIF1-alfa (17-20). Poiché l’ubiquitinazione ela degradazione di altre proteine regolatorie chiave sono generalmente dipendenti dalla fosforilazione, è stato ipotizzato che alcuni residui di HIF1-alfa fossero modificati modificati in tal senso.
Al contrario successivamente è stato dimostrato che Pro-564 è idrossilata in modo O2-dipendente, e che questa modifica è necessaria per il legame con VHL (21-23). La Pro-402 rappresenta un secondo sito di idrossilazione e legame con VHL (24). Pro-402 e Pro-564 sono contenute in una stessa sequenza (LXXLAP).

Tre prolil-idrossilasi (PHD1, 2 e 3) sono presenti nei mammiferi e impiegano O2 come substrato per generare 4-idrossiprolina sui residui 402 e 564 di HIF1-alfa (27-29).
L’idrossilazione richiede anche 2-ossiglutarato come substrato e genera succinato come prodotto. L’ascorbato è necessario come cofattore. Il sito catalitico di PHD contiene Fe(II) che è coordinato con due istidine e un aspartato. A differenza delle proteine contenenti eme, il Fe(II) nelle ossigenasi 2-ossiglurato-dipendenti può essere chelato o sostituito con Co(II), rendendo l’enzima inattivo.

Molto importante, queste PHD hanno una Km relativamente alta per l’O2, leggermente superiore alla proessione atmosferica, cosicché l’O2 è limitante per l’attività enzimatica nelle condizioni fisiologiche (25, 28). Come risultato, cambi nelle concentrazioni cellulari di O2 sono direttamente tradotti in cambi nella velocità con cui HIF1-alfa è idrossilato, ubiquitinato e degradato. Comunque una attenta analisi della relazione tra la concentrazione di O2 e l’attività di PHD nelle cellule nonè stata ancora condotta (30). In particolare, il grafico della quantità di HIF1-alfa come funzione di O2 nelle cellule HeLa dava una curva sigmoide suggerendo cooperatività (3=), un dato che non è spiegato in base all’attività di PHD.

Importante, il dominio di transattivazione di HIF1-alfa è regolato dall’idrossilazione O2-dipendente di Asn-803, che previene il legame con CBP e p300 (31). L’enzima FIH è l’enzima che catalizza tale reazione (32) agendo da asparaginil idrossilasi. Come nel caso di PHD, FIH-1 impiega O2 e 2-ossiglutarato e contiene Fe(II) nel suo sito attivo (33-35), sebbene abbia una Km per l’O2 che è tre volte più basso di quello di PHD ( 36-39).
L’idrossilazione di Asn-803 distrugge le interazione proteina-proteina fra HIF1-alfa e CBP e p300. Analogamente, l’idrossilazione di Pro-564 è stata dimostrata anche funzionare come interruttore molecolare per regolare positivamente l’interazione tra HIF1-alfa e VHL (40, 41).
Pertanto, l’idrossilazione provvede un meccanismo per regolare le interazioni proteina-proteina, in modo simile alla fosforilazione e ad altre modifiche prost-traduzionali. Comunque, cosa è specifico di questo meccanismo e che esso mette in relazione la l’ossigenazione cellulare ed i livelli di HIF1-alfa.
Un aspetto notevole dei sistemi sensoriali all’O2 descritti in precedenza è la loro plasticità. Sebbene l’O2 sia il substrato limitante nelle condizioni fisiologiche, appare che in condizioni alterate anche il ferro el’ascorbato possano essere limitanti. Inoltre, l’espressione di PHD varia da una cellula all’altra così come in risposta a vari stimoli, compresa l’ipossia (28, 42-44). Ed ancora, la risposta trascrizionale dovuta a stimolo ipossico presenta un grado notevole di plasticità, poiché l’insieme dei geni bersaglio di HIF1-alfa è unico per ogni tipo di cellula (45). Pertanto, l’identificazione delle componenti molecolari dei sistemi di risposta all’O2 rappresenta la base ma non la conclusione degli studi sulla regolazione dell’omeostasi dell’O2.

Attualmente, l’unica policitemia congenita dovuta ad anormalità nelle vie sensoriali all’ossigeno è la cosiddetta policitemia di Chuvash (CP) (20). Areata è una malattia autosomica recessiva endemica in una regione del centro Volga (Chuvashia). E’ stato stimato che ci sono centinaia di soggetti affetti fra i due milioni di abitanti di questo gruppo etnico (21). La CP non è una malattia benigna ed è caratterizzata da elevata emoglobina, aumento di Epo plasmatici, vene varicose, emangiomi vertebrali, bassa pressione ed elevata concentrazione di VEGF sierico (22).
I pazienti affetti da CP muoiono presto, maggiormente a causa di eventi vascolari e trombosi periferica.
I progenitori eritrosi sei pazienti con CP sono ipersensibili all’Epo ma sebbene tale sensibilità sis importante patogeneticamente, il suo meccanismo molecolare rimane oscuro.
Un ampio screening genomico e la caratterizzazione dei geni candidati dimostravano che la mutazione C&gt;T in posizione 598 (C598T, Arg200Trp) del gene VHL causa la CP (20). Tutti i pazienti con CP sono omozigoti per questa mutazione, mentre tutti i portatori obbligati sono eterozigoti (22). Studi molecolari nei pazienti con CP indicano che VHL C598T porta ad inattivazione dell’interazione di VHL con HIF1-alfa e al conseguente aumento dei livelli di HIF1-alfa con incremento dell’espressione dei geni bersaglio (23).
PoichèCP è caratterizzata da una mutazione nella linea germinale di VHL, è stato ipotizzato che gli omozigoti possano sviluppare tumori vascolari tipici della sindrome di von Hippel-Lindau. Al contrario, gli omozigoti per VHL C598T presentano i sintomi sopradescritti ma in nessun caso tumori tipici della classica sindrome di von Hippel-Lindau (22). Omozigoti per la mutazione C598T sono stati evidenziati in soggetti policitemici sporadici da diversi gruppi etnici (24-28). In totale, 19 omozigoti sono stati evidenziati tra i 150 casi conosciuti di policitemia familiare non abitanti in Chuvashia. Inoltre, altre otto mutazioni VHL (Arg79Cys, Gly104Val, Asp126Tyr, Val130Leu, Gly144Arg, Tyr175Cys, Leu188Val, His191Asp, Pro192Ala) sono state evidenziate in policitemici omozigoti o eterozigoti composti (24, 25, 27-29). Queste mutazioni sono state evidenziate in un totale di 10 casi indicando che la transizione C598T è la maggior causa di policitemia correlata a VHL.
Per affrontare il problema se la sostituzione in VHL C598T si fosse avuta in un singolo fondatore o da eventi mutazionali ricorrenti, l’analisi dell’aplotipo impiegando 8 polimorfismi s singolo nucleotide (SNPs) informativi che coprivano 340 kb intorno al gene VHL è stata condotta in 101 soggetti che presentavano la mutazione e in 441 soggetti normali da vari gruppi etnici (chuvashi, sud-est asiatici, caucasici, ispanici, afro-americani). I risultati indicavano che le differenze nella frequenza allelica per ogni marker fra i 447 controlli (598C) e i 101 soggetti portanti la mutazione (598T) era altamente significativa (p&lt;10-7), indicando un forte “linkage disequilibrium”. Infatti la frequenza in Chuvashia è circa 0.057 (20), mentre la frequenza nel mondo associata all’aplotipo e circa 0.001377 (30). Pertanto, è stato valutato che la mutazione VHL C598T sia originata in un singolo fondatore tra i 12000 ed i 51000 anni fà. E’ possibile cha la vasta disseminazione dal fondatore originario possa essere associata ad alcuni vantaggi per l’eterozigote che porta questa mutazione. Tale vantaggio può essere correlato ad un sottile miglioramento del metabolismo del ferro, dell’eritropoiesi, dello sviluppo embrionale, del metabolismo energetico o di qualche altro effetto non ancora conosciuto. Una interessante possibilità è correlata alla recente dimostrazione di un ruolo protettivo dell’HIF1-alfa nel regolare i livelli di VEGF nella pre-eclampsia (31, 32), la causa maggiore di mortalità materna e fetale nel mondo (33). Un altro ruolo positivo di una leggera risposta all’ipossia è rappresentata da un incremento dell’attività battericida dei neutrofili, come recentemente dimostrato nei topi knock-in per HIF1-alfa (34).

Pochi casi di CP appaiono presentare la mutazione di VHL su di un solo allele, osservazione in ovvio contrasto con il meccanismo patofisiologico osservato in genere. In una famiglia ucraina, due bambini con policitemia erano eterozigoti per la mutazione VHL G376T (D126Y) ma i loropadri eterozigoti non erano policitemici (35). I progenitori ertroidi (ottenuti dal sangue periferico) dai bambini e dai padri erano ipersensibili all’Epo in saggi clonogenici in vitro similmente a quanto osservato nei soggetti CP. I granulociti e le piastrine del sangue periferico del paziente erano policlonali come evidenziato in un saggio di clonalità basato sull’espressione del cromosoma X (36), permettendo di escludere una ulteriore mutazione somatica di un progenitore ematopoietico che determini una ematopoiesi clonale come avviene nella policitemia vera.

Ci sono altre descrizioni separate di pazienti VHL eterozigoti in cui l’eredità di un allele VHL nullo in posizione trans era esclusa; il meccanismo molecolare del fenotipo cellulare legato ad una singola mutazione di VHL rimane da spiegare ed appare di estrema rilevanza all’interno dei meccanismi di regolazione della risposta all’ipossia e dei suoi rapporti con l’eritropoiesi (26). Infine, più della metà dei pazienti affetti da policitemia congenita con elevata Epo non hanno mutazioni di VHL, e le basi molecolari della malattia rimane da essere chiarita. Alterazioni dei geni correlati alla risposta a variazioni di pO2 e loro interazioni altre proteine del pathway di VHL/HIF1-alfa appaiono come possibilità primarie nello screening di mutazioni per pazienti con policitemia congenita, alta Epo ed assenza di mutazioni a VHL. Tra l’altro, alcune di queste condizioni appaiono essere ereditate con meccanismo dominante.

Una ulteriore forma di policitemia congenita, indirettamente correlata ad alterati vie O2-sensibili, è dovuta alla alterazione di un differente meccanismo di controllo dell’eritropoiesi e, precisamente la presenza di alterazioni al recettore dell’Epo (EpoR).

Come meccanismo centrale della regolazione dell’eritropoiesi, l’Epo è anche richiesta per lo svliluppo oltre lo stadio di CFU-E e funziona principalmente come fattore di sopravvivenza eritroblastica (1). Come descritto in precedenza, attraverso meccanismi HIF1-alfa regolati, l’Epo è espressa nel rene adulto ed è secreta come complesso sialoglicoproteico (3). La sua azione sui precursori eritroidi dipende da recttori dimerici (EpoR).
I segnali da EpoR negli eritroblasti coinvolgono inizialmente l’attivazione di Jak2 come prima chinasi che si assembla a un dominio di EpoR altamente conservato (3). Jak2 poi fosforila 8 tirosine conservate del dominio citoplasmatico del recettore (fosfotirosina o PY 343, 401, 429, 431, 443, 460, 464 e 479) (3) Queste tirosine di EpoR funzionano come scheletro per il legame di un complesso, ancora approssimativamente definito, di vari fattori proteici che presentano domini SH2 leganti le fosfotirosine. Un subset di fosfotirosine recruta fattori di controllo negativi. PY429 lega la protein tirosina fosfatasi (SHP-1) che defosforila Jak2 (12). PY401 insieme a PY429 e PY431 lega SOCS-3 e la proteina inducibile da citochine, Cis-1 (13) che possono interferire con l’attivazione di Jak2 e/o Stat-5 ed anche attivare l’ubiquitinazione del recettore e la sua degradazione/internalizzazione (14). In aggiunta, la fosfatasi Ship-1 (una fosfatasi inibitrice per il fosfatidilinositolo 3,4,5-trifosfato) si associa con i complessi legati a EpoR e può inibire gli eventi stimolati dall’enzima fosfatidilinositolo 3 chinasi (PI3K) (15).
I segnali positivi predominanti di EpoR sono legati a due subset di siti PY ed agli effettori accoppiati (3). Il legame di PI3K a EpoR PY479 porta all’attivazione dei meccanismi antiapoptotici di Akt, mTOR e p70S6 chinasi (16,17). Il legame della proteina Grb2/Shc a PY464 (insieme al legame della fosfatasi Syp a PY425) (18) è stato correlato alla regolazione della via di proliferazione mSos/Ras/Raf/MEK, mentre l’attivazione della fosfolipasi Cgamma1 e il flusso di calcio mediato dal canale ionico TRPC2 sembra essere accoppiato a PY460 (20). PY di EpoR sembrano essere anche coinvolte nel legame con Gab e nella modulazione di NF-kB (altro fattore antiapoptotico) (21). Infine, l’attivazione del fattore di trascrizione Stat5 si ha predominantemente attraverso PY343 e può promuovere, tra l’altro, l’espressione dell’importantissima proteina antiapoptica Bcl-xL (23). <<<