RICERCA ITALIANA     

Meccanismi molecolari di carcinogenesi: validazione di nuovi bersagli per la diagnosi e la terapia

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

La maggior parte delle caratteristiche delle cellule neoplastiche possono essere spiegate in termini di cambiamenti genetici o epigenetici e di impatto funzionale che questi cambiamenti hanno sulla fisiologia cellulare.
Infatti i tumori sono il risultato dell'accumulo di differenti modificazioni in geni critici coinvolti nel controllo della proliferazione, sopravvivenza, motilità, migrazione e angiogenesi. Sebbene vari approcci terapeutici siano stati eseguiti nella pratica clinica, la maggior parte di essi non sono completamente soddisfacenti. Quindi, la scoperta di metodi per diagnosticare il cancro ad uno stadio precoce e individuare terapie più efficaci è un obiettivo critico e urgente.
Per realizzare questo progetto, l'identificazione e la caratterizzazione di molecole “chiave” che partecipano al processo di cancerogenesi sono di essenziale importanza. La nostra proposta mira all'identificazione di nuove vie alterate nelle cellule tumorali allo scopo di fornire un quadro piu' approfondito della genetica molecolare del cancro, nuovi marcatori molecolari, per una migliore diagnosi e prognosi, ed infine individiare nuovi “targets” terapeutici piu'adeguati che consentiranno una migliore gestione del paziente. Partendo da questi obiettivi proponiamo di identificare le alterazioni genetiche ed epigenetiche che sono responsabili dello stabilirsi e della progressione di alcuni comuni tumori epiteliali quali i carcinomi della mammella, della tiroide e del colon.
Ci prefiggiamo di raggiungere questi obiettivi mirando alla validazione di proteine che sono già state implicate nei processi di sviluppo del cancro (CBX7, SKIN, p27 e MET). I risultati ottenuti dallo studio dei tumori umani sarà poi validato sia su sistemi animali che cellulari già disponibili nei nostri laboratori. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Alfredo Fusco Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il lavoro che sarà svolto dalle diverse UO si prefigge lo scopo di ottenere dei risultati rilevanti per la comprensione dei meccanismi molecolari della carcinogenesi epiteliale. Il lavoro compiuto in passato, dalle 4 UO proponenti questo progetto, ha portato all'identificazione di alcuni geni candidati come soppressori tumorali o oncogeni, il cui ruolo nel cancro ha bisogno di ulteriori studi. Il principale scopo di questa proposta è identificare alterazioni genetiche e d epigenetiche che sono responsabili dell'inizio e progressione di alcuni comuni tumori epiteliali (incluso i carcinomi della mammella, della tiroide e del colon) mira alla validazione di proteine che sono già state implicate nei processi di sviluppo del cancro (CBX7, SKIN, p27 e MET). L'uso di sistemi animali e cellulari, che sono stati sviluppati con successo nei nostri laboratori e usati negli ultimi anni, permetterà poi di sviluppare protocolli per validare i dati derivanti dall'analisi molecolare.
I risultati del progetto permetteranno di disegnare un quadro molecolare piu' completo di alcuni comuni e letali tumori di origine epiteliale.
Obiettivi specifici di questo progetto sono:
(1) Determinare il ruolo svolto da CBX7, un putativo gene oncosoppressore, in tumori umani della tiroide.
(2) Scoprire la funzione di SKIN, e i meccanismi attraverso cui svolge il suo ruolo nella tumorigenesi, soprattutto per validarlo come un bersaglio di terapia genica.
(3) Studiare la potenziale funzione citoplasmatica di p27 (inibitore delle chinasi ciclica- dipendenti).
(4) Determinare il meccanismo molecolare responsabile dell'induzione dell'espressione di MET in seguito all'attivazione del segnale di Wnt, ed analizzare l'espressione di MET nelle fasi precoci della carcinogenesi del colon in topi APC minus. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I tumori sono il risultato dell'accumulo di differenti modificazioni in geni critici coinvolti nel controllo della proliferazione cellulare, nella motilità, nella migrazione e nell'angiogenesi (1). In un vasto numero di carcinomi caratterizzati da prognosi sfavorevole, la lesione non è diagnosticata se non quando la malattia è già in fase avanzata. Nonostante i numerosi progressi. la maggior parte dei diversi approcci teraputici seguiti nella pratica clinica sembrano essere inefficaci. Diventa perciò urgente e critico individuare nuove metodiche per diagnosticare il cancro in fasi sempre più precoci della progressione e per stabilire terapie più efficaci. Per raggiungere questo obiettivo diventa essenziale identificare e caratterizzare le molecole chiave implicate nel processo di carcinogenesi. Pertanto, il recente lavoro delle Unità Operative che presentano questa proposta si è focalizzato sull'identificazione di nuovi “pathways” alterati nelle neoplaie allo scopo di fornire nuove conoscenze nella genetica molecolare delle cellule cancerose, nuovi marcatori per una migliore diagnosi e prognosi ,ed infine nuovi ed accessibili bersagli terapeutici che potrebbero migliorare il trattamento dei pazienti. Il lavoro svolto negli anni passati dalle UO afferenti a questo progetto ha portato rtato all'identificazione di alcuni candidati oncogeni e geni oncosoppressori.
La UO 1 ha identificato il gene CBX7 mediante l'analisi di un microarray in cui erano rappresentati 12.629 trascritti, utilizzando RNA estratti da una coltura primaria di cellule tiroidee umane e da sei linee cellulari provenienti da carcinoma tiroidei di differente istotipo (1 da carcinoma follicolare, 3 da carcinoma papillifero and 2 da carcinoma anaplastico).
l'espressione di CBX7, il cui prodotto è una proteina nucleare di 251 aa e del peso di 28,3 kDa, è cospicua nella linea cellulare normale di tiroide umana, ma assente o molto bassa in tutte le linee cellulari originate da tumori tiroidei. Inoltre precedenti studi hanno dimostrato una delezione della regione cromosomica 22q13.1, dove il gene CBX7 è localizzato, in carcinomi dell'ovaio, della mammella e del colon caratterizzati da un comportamento aggressivo (2), suggerendo CBX7 come gene candidato soppressore tumorale coinvolto nella fase di progressione della carcinogenesi di molte neoplasie.
La proteina CBX7 è coinvolta nei meccanismi di repressione trascrizionale di geni che modificamo la cromatina (3). CBX7 Contiene un “chromodomain” (CHRomatin Organization Modifier domain) compreso tra gli aminoacidi 10 e 46. Questo dominio è stato inizialmente definito definito come una regione di omologia conservata di 37 aminoacidi mostrata dalle proteine HP1 (Heterochromatin protein 1) e Pc (Polycomb) di Drosophila melanogaster. (4-6).
L'UO2 ha isolato il gene SKIN da miotubi E1A trasformati. Questo gene ha tutte le caratteristiche di un oncogene. Infatti il gene di SKIN è amplificato in numerose linee cellulari che mostrano iperespressione di SKIN e l'amplificazione/iperespressione è stata trovata in un numero significativo di carcinomi del colon. Altri dati mostrano che SKIN da solo è fattore prognostico predittivo nel cancro della mammella. Infine, il “knock down” di SKIN, ottenuto da siRNA in tre linee cellulari di origine tumorale (HT-29, SKMEL5, SKBR3), che mostrano iperespressione di SKIN, blocca la proliferazione cellulare.

Il progetto di UO3 ha focalizzato la sua attenzione sulla famiglia CIP/KIP degli inibitori delle chinasi ciclina-dipendente ed in particolare sulla proteina p27. Il gene che codifica per p27 (CDKN1B) è situato sul cromosoma 12p13.1 e contiene due esoni separati da un piccolo introne; il suo mRNA è di 2.5 kb e codifica per una proteina di 198 aminoacidi. Inizialmente p27 è stato isolato come inibitore dell'attività di Cdk-2 riscontrata in cellule con inibizione da contatto o trattate con TGFb. P27 è un regolatore fondamentale della proliferazione in molti tipi di cellule, essendo deputato a mantenere lo stato di quiescenza (7-9). P27 agisce principalmente in fase G0 e G1 precoce, dove è richiesta per l'arresto della crescita indotta da deprivazione di fattori di crescita, inibizione da contatto e perdita di adesione alla matrice extracellulare. L'espressione di p27 è più alta in cellule in stato di quiescenza e si riduce drasticamente dopo stimoli mitogenici. Sebbene p27 sia raramente mutato in tumori umani, ci sono numerose evidenze che l'inattivazione di p27 sia una tappa fondamentale per lo sviluppo del fenotipo maligno. La ridotta espressione di p27, a causa di una aumentata degradazione della proteina, correla con una prognosi negativa di pazienti con vari tipi di tumore. Inoltre, evidenze recenti suggeriscono che la proteina p27 è spesso “delocalizzata” al citoplasma in seguito a fosforilazione AKT-dipendente (10-13). Poiché l'attività di blocco della crescita svolta da p27 dipende dalla sua localizzazione nucleare, la “delocalizzazione” citoplasmatica potrebbe effettivamente bloccare l'attività inibitoria di p27. P27 citoplasmatico sembra direttamente correlare con una prognosi negativa e con tumori di grado avanzato di carcinomi dell'esofago e della mammella. Queste evidenze suggeriscono che delle delucidazioni sui meccanismi implicati nella regolazione della “mislocalizzazione” di p27 possano procurare nuove conoscenze sul “pathway” che regola l'inattivazione di p27 e il suo ruolo nelle cellule tumorali.

La UO4 ha identificato la proteina MET come prteina chiave nei meccanismi responsabilei dei processi di invasione e metastasi. Infatti, il programma genetico della crescita invasiva è regolato da specifici segnali extracellulari, principalmente dagli Scatter Factors (che comprendono l'hepatocyte growth factor, HGF, e la macrophage stimulating protein, MSP), che agiscono mediante l'interazione con i recettori tirosina cinasici della famiglia dell'oncogene MET. In alcuni tessuti dell'adulto (compreso l'epitelio del tratto gastrointestinale), l'espressione MET si limita alle cellule staminali/progenitrici (14-17). Se, come dibattuto, le cellule staminali del cancro (CSCs) derivano dalla trasformazione maligna di cellule staminali normali (18), è logico supporre che la capacità di eseguire il programma di crescita invasiva non solo sarà mantenuto dalle cellule staminali tumorali, ma agirà anche da forza trainante per l'espansione della popolazione di cellule staminali tumorali, e sarà un requisito importante per la disseminazione metastatica. Inoltre, si può ipotizzare che l'attivazione dell'oncogene MET in una cellula staminale possa trasformarla in una CSC invasiva e metastatica.
L'interazione fra MET e le vie di traduzione del segnale che regolano l'autorinnovamento delle cellule staminali nel tratto gastrointestinale si candida ad essere un importante campo di ricerca. Una famiglia di geni con un ruolo fondamentale nel regolare il destino delle cellule staminali, è la famiglia di Wnt. In condizioni fisiologiche, il pathway di Wnt mantiene la staminalità delle cellule della cripta dell'epitelio intestinale e viene spento durante la differenziazione di tali cellule lungo l'asse cripta-villo (19). Studi precedenti suggeriscono che il pathway a valle di Wnt aumenti la trascrizione di MET (20). Il pathway di Wnt è costitutivamente attivo in caso di mutazioni del gene oncosoppressore APC, che sono frequenti nei tumori colorettali. In questi tumori, è noto che si verifica un'espansione della popolazione di cellule staminali (19). Si può quindi ipotizzare che il medesimo evento genetico (l'inattivazione di APC) causi anche l'overespressione di MET, e che le cellule che esprimono MET corrispondano alla popolazione di cellule staminali (tumorali) che si è espansa.
In conclusione, l'intero approccio proposto dalle differenti UO per lo sviluppo del progetto, permetterà di raggiungere numerosi concetti importanti per la comprensione dei meccanismi molecolari della carcinogenesi epiteliale
Questa analisi dei tumori diversificata condurrà all'identificazione di
(i) geni candidati, rilevanti nella formazione di tumori epiteliali;
(ii) meccanismi di trasduzione del segnale nei quali siano implicati taluni oncogeni candidati e oncosoppressori tumorali;
(iii) il ruolo di meccanismi epigenetici nello sviluppo del cancro.
Infine, l'uso di sofisticati sistemi cellulari e animali, che sono stati sviluppati nei nostri laboratori e usati con successo negli ultimi anni, permetterà lo sviluppo di protocolli appropriati per la validazione dei dati derivanti dalle analisi molecolari. <<<