RICERCA ITALIANA     

IL RECLUTAMENTO LEUCOCITARIO: MECCANISMI E ASPETTI PATOLOGICI

Università degli Studi di Verona

Abstract

Questo progetto di ricerca si propone di chiarire i meccanismi con i quali le integrine regolano l’arresto ed il successivo reclutamento di diverse popolazioni leucocitarie nei siti infiammatori. Il ruolo dell’adesione integrine-dipendente nel reclutamento leucocitario verrà indagato anche nel contesto di patologie infiammatorie del sistema nervoso centrale, tra cui l’ encefalomielite sperimentale autoimmune (EAE), modello murino di sclerosi multipla, e l’epilessia.

Come descritto in dettaglio nella "Base di Partenza Scientifica", l’adesione integrine –dipendente rappresenta un evento centrale nell’interazione tra leucociti ed endotelio attivato e nel successivo reclutamento tessutale nel corso dei processi flogistici. Comprendere in dettaglio i meccanismi che regolano l’adesione integrine-dipendente e la successiva stabilizzazione dell’interazione leucocita-endotelio rappresenta un pre-requisito centrale per definire nuove strategie terapeutiche per il controllo dell’infiammazione.

Gli studi che verranno condotti riguarderanno quattro linee di ricerca principali che possono essere così riassunte:
1) Meccanismi di trasduzione del segnale regolante l’affinità dell’integrina beta2 LFA-1 da parte di molecole ad attività chemiotattica (Unità di ricerca II).
2) Meccanismi con cui tirosin chinasi della famiglia del Src, implicate nella trasduzione del segnale da parte di integrine, regolano il reclutamento di granulociti e monociti (Unità di Ricerca I).
3) Ruolo di tirosin chinasi della famiglia del Src e di small GTPasi della famiglia Rho nel regolare l’adesione e la migrazione leucocitaria nei vasi cerebrali infiammati, in corso di EAE (Unità di ricerca IV).
4) Ruolo dell’adesione integrine-dipendente nel reclutamento di cellule infiammatorie in un modello animale di epilessia sperimentale (Unità di ricerca III).

Gli obiettivi di questo progetto rappresentano una coerente e logica prosecuzione di linee sperimentali che i proponenti hanno sviluppato nel corso degli ultimi dieci anni. E’ importante notare che gran parte degli obiettivi specifici di questo progetto verranno perseguiti mettendo in comune tra i partecipanti approcci sperimentali e metodologie complesse e avanzate, distinte competenze ed esperienze sperimentali e culturali, modelli animali e reagenti unici e non reperibili commercialmente. Rappresenta un valore aggiunto di questa collaborazione e convergenza comune su obiettivi ben individuati il fatto che i proponenti lavorano nella stessa istituzione. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giorgio Berton Università degli Studi di VERONA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo progetto di ricerca si propone di chiarire i meccanismi con i quali le integrine regolano l’arresto ed il successivo reclutamento di diverse popolazioni leucocitarie nei siti infiammatori. Il ruolo dell’adesione integrine-dipendente nel reclutamento leucocitario verrà indagato anche nel contesto di patologie infiammatorie del sistema nervoso centrale, tra cui l’ encefalomielite sperimentale autoimmune (EAE), modello murino di sclerosi multipla, e l’epilessia.

Come descritto in dettaglio nella "Base di Partenza Scientifica", l’adesione integrine –dipendente rappresenta un evento centrale nell’interazione tra leucociti ed endotelio attivato e nel successivo reclutamento tessutale nel corso dei processi flogistici. Comprendere in dettaglio i meccanismi che regolano l’adesione integrine-dipendente e la successiva stabilizzazione dell’interazione leucocita-endotelio rappresenta un pre-requisito centrale per definire nuove strategie terapeutiche per il controllo dell’infiammazione.

Gli obiettivi di questo progetto rappresentano una coerente e logica prosecuzione di linee sperimentali che i proponenti hanno sviluppato nel corso degli ultimi dieci anni. E’ importante notare che gran parte degli obiettivi specifici di questo progetto verranno perseguiti mettendo in comune tra i partecipanti approcci sperimentali e metodologie complesse e avanzate, distinte competenze ed esperienze sperimentali e culturali, modelli animali e reagenti unici e non reperibili commercialmente. Rappresenta un valore aggiunto di questa collaborazione e convergenza comune su obiettivi ben individuati il fatto che i proponenti lavorano nella stessa istituzione.

Alcuni degli obiettivi principali che si intendono raggiungere sono riassumibili quattro obiettivi principali.

1. DEFINIZIONE DEI MECCANISMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE REGOLANTE L’AFFINITÀ DELL’INTEGRINA BETA2 LFA-1 DA PARTE DI MOLECOLE AD ATTIVITÀ CHEMIOTATTICA.
Il senso generale di questo obiettivo è quello di dare un contributo significativo alla definizione della rete di trasduzione del segnale che regola l’attivazione della capacità di legame di integrine implicate nell’interazione leucocita-endotelio; più specificamente dei segnali implicati nel passaggio dell’integrina LFA-1 da uno stato a bassa ad uno stato ad alta affinità per il ligando. Rientrano in questo obiettivo generale i seguenti obiettivi specifici: 1.1. RUOLO DI RHO GTPasi NELL’ATTIVAZIONE DI LFA-1 DA PARTE DI CHEMOCHINE. 1.2: RUOLO DI FOSFOLIPASI D1 (PLD1) E FOSFATIDILINOSITOLO-4-FOSFATO-5-KINASI (PI(5)K) NELL’ATTIVAZIONE DI LFA-1 DA PARTE DI CHEMOCHINE.

2) IDENTIFICAZIONE DEI MECCANISMI CON CUI TIROSIN CHINASI DELLA FAMIGLIA DEL SRC, IMPLICATE NELLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE DA PARTE DI INTEGRINE, REGOLANO IL RECLUTAMENTO DI GRANULOCITI E MONOCITI.
Il senso generale di questo obiettivo deriva da recentissimi studi, condotti anche nei laboratori coinvolti in questo progetto di ricerca (Unità I, II e III, vedi voce bibliografica 12), che hanno messo in evidenza come la trasduzione del segnale da parte di integrine leucocitarie sia importante nello stabilizzare l’interazione leucocita endotelio in condizioni di flusso, regolando di conseguenza il reclutamento leucocitario Siccome in cellule fagocitarie (granulociti neutrofili ed eosinofili, monciti/macrofagi), le tirosin chinasi della famiglia del Src (SFK), ed in particolare Fgr e Hck, svolgono un ruolo centrale nella trasduzione del segnale da parte di integrine e SFK regolano il reclutamento di fagociti in siti infiammatori, intendiamo comprendere in dettaglio i meccanismi di tali azioni. Rientrano in questo obiettivo generale i seguenti obiettivi specifici: 2.1. IDENTIFICAZIONE DI COMPONENTI DELLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE IMPLICATO NELLA REGOLAZIONE DEL MOVIMENTO CELLULARE IN MONOCITI/MACROFAGI E IN LINEE CELLULARI MACROFAGICHE. 2.2. RUOLO DELLE CHINASI DELLA FAMIGLIA SRC (SFK) NELLA REGOLAZIONE DELL’ADESIONE STABILE A LIGANDI INTEGRINICI. 2.3. RUOLO DI SFK NELL’ATTIVAZIONE DELLA PRODUZIONE DI INTERMEDI REATTIVI DELL’OSSIGENO (ROIs) DA PARTE DI SOSTANZE CHEMIOTATTICHE. 2.4. RUOLO DI SFK NELLA REGOLAZIONE DELLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE DA PARTE DI RECETTORI TOLL-LIKE IN MACROFAGI ALVEOLARI E TISSUTALI:.

3) DEFINIZIONE DEL RUOLO DI TIROSIN CHINASI DELLA FAMIGLIA DEL SRC E DI SMALL GTPASI DELLA FAMIGLIA RHO NEL REGOLARE L’ADESIONE E LA MIGRAZIONE LEUCOCITARIA NEI VASI CEREBRALI INFIAMMATI, IN CORSO DI ENCEFALOMIELITE SPERIMENTALE AUTOIMMUNE (EAE).
Il senso generale di questo obiettivo consiste nello studio del ruolo di SFK e di small GTPasi della famiglia Rho nel contesto delle vie di trasduzione dei segnali che controllano l’attivazione integrinica durante le migrazione leucocitaria nei vasi cerebrali infiammati, e nell’individuazione di nuovi potenziali bersagli terapeutici nell’encefalomielite sperimentale autoimmune (EAE) e la sclerosi multipla. Rientrano in questo obiettivo generale i seguenti obiettivi specifici: 3.1. RUOLO DI FGR E HCK SUL RECLUTAMENTO DEI MONOCITI E NEUTROFILI NEI VASI CEREBRALI INFIAMMATI E NELL’INDUZIONE DELL’EAE. 3.2. RUOLO DI RHO GTPasi E FOSFOLIPASI D1 (PLD1) NEL RECLUTAMENTO LEUCOCITARIO NEI VASI CEREBRALI INFIAMMATI E NELLL’INDUZIONE DELL’EAE.

4) DEFINIZIONE DEL RUOLO DELL’ADESIONE INTEGRINE-DIPENDENTE NEL RECLUTAMENTO DI CELLULE INFIAMMATORIE IN UN MODELLO ANIMALE DI EPILESSIA SPERIMENTALE.
Il senso generale di questo obiettivo consiste nel cercare di chiarire l'effetto del blocco delle interazioni adesive e del reclutamento dei leucociti nel cervello sullo sviluppo e progressione dell’epilessia. La razionalità e l’importanza di tale obiettivo deriva dal fatto che una recente collaborazione tra le Unità III e IV ha portato ad ottenere dati sperimentali che dimostrano un ruolo centrale del reclutamento leucocitario nella patogenesi dell’epilessia. Rientrano in questo obiettivo generale i seguenti obiettivi specifici: 4.1. RUOLO DELL’INTEGRINA LFA-1 E DEL SUO CONTRORECETTORE ICAM-1 NEL’INDUZIONE DI EPILESSIA. 4.2. RUOLO DI FGR, HCK E LYN NEL RECLUTAMENTO DI MONOCITI E NEUTROFILI NEI VASI CEREBRALI INFIAMMATI E NELL’EPILESSIA SPERIMENTALE. 4.3. RUOLO DI RHO GTPASI E FOSFOLIPASI D1 (PLD1) NEL RECLUTAMENTO LEUCOCITARIO NEI VASI CEREBRALI INFIAMMATI E NELL’INDUZIONE DI EPILESSIA. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

IL RECLUTAMENTO LEUCOCITARIO.

Il reclutamento dei leucociti dal sangue è un processo controllato da meccanismi di riconoscimento specifico fra il leucocita e l’endotelio vascolare. La migrazione leucocitaria attraverso l’endotelio vascolare viene descritta come un modello a fasi comprendente: 1) aggancio (“tethering”) e rotolamento (“rolling”); 2) attivazione del leucocita attraverso una via di secondi messaggeri associata a recettori trimerici Galphai 3) adesione salda integrino-dipendente; 4) diapedesi/transmigrazione in risposta a un gradiente di fattore chemiotattico (1, 2).

La seconda tappa di questa sequenza di eventi comporta l’”attivazione” di integrine della famiglia beta2 (integrine leucocitarie: LFA-1 o CD11a/CD18, Mac-1 o CD11b/CD18 e gp150/95 o CD11c/CD18) e beta1 (VLA-4); con tale termine si intende, dal punto di vista funzionale, un’ aumentata capacità di interagire con appropriati ligandi e, dal punto di vista molecolare, una modificazione di conformazione che determina un’aumentata “affinità” dell’integrina. Il modello generale proposto per concepire l’attivazione della capacità di legame delle integrine comprende tre tappe. Da una conformazione chiusa e ripiegata verso la membrana plasmatica, l’integrina passa ad uno stato conformazionale caratterizzato da una proiezione verso l’esterno del suo dominio extracellulare, stato nel quale ha un grado di affinità per il ligando intermedio. Infine, la modificazione conformazionale si completa con l’assunzione conseguente di un’affinità elevata. Assieme a modificazioni di affinità, è considerata far parte dell’attivazione integrinca una redistribuzione della stessa in siti discreti che potenzia la forza di legame ad appropriati ligandi (aumentata “valenza”). Per quanto riguarda l’integrina LFA-1, questa serie finemente regolata di eventi regola la sua adesione salda al contro-recettore endoteliale ICAM-1 espresso dall’endotelio infiammato (3-8). Successivamente all’interazione con il suo ligando, l’integrina assume tutte le proprietà di un vero e proprio recettore, in grado quindi di trasdurre segnali all’interno della cellula. E’ importante notare che recentissimi studi, condotti anche nei laboratori coinvolti in questo progetto di ricerca, hanno messo in evidenza come la trasduzione del segnale da parte di integrine leucocitarie sia importante nello stabilizzare l’interazione leucocita endotelio in condizioni di flusso, regolando di conseguenza il reclutamento leucocitario (9-12).

MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELL’AFFINITA’ INTEGRINICA.

L’aumento di affinità integrinica è un fenomeno critico durante il reclutamento leucocitario. I polipeptidi appartenenti alla famiglia delle chemochine sono i maggiori responsabili dell’attivazione integrinica e generano segnali attraverso recettori con sette domini transmembrana che sono diversamente espressi nei diversi sottotipi leucocitari. Questi recettori generano un’ampia e diversificata rete di molecole segnalanti in grado di controllare l’attivazione integrinica ed il movimento direzionato (chemiotassi). Inoltre, nei linfociti naive tale evento è importante per permettere la generazione della sinapsi immunologia ed iniziare la risposta immunitaria acquisita, mentre nei fagociti professionali esso permette il riconoscimento dei patogeni e l’inizio della risposta innata.

Dati recenti dimostrano che l’induzione dell’alto stato di affinità dell’eterodimero è l’evento primario di attivazione indotta da chemochine di LFA-1 e VLA-4, responsabile a sua volta, del rapido arresto di leucociti circolanti rispettivamente su ICAM-1 e VICAM-1. Nel caso di LFA-1, un complesso meccanismo di segnali intracellulari generati dai recettori per le chemochine è responsabile della sua rapida attivazione (4). Sebbene la natura di questa rete pro-adesiva di molecole segnalanti sia ancora grandemente non definita, recenti dati dimostrano chiaramente il ruolo centrale delle GTPasi RhoA e Rap1 nel controllo della rapida attivazione di LFA-1 (6,7,13). Il modulo di Rap-1 sembra coinvolgere PLC, CalDAG-GEF e RapL. Il modulo di Rho sembra essere molto più complesso. Infatti, è ben stabilito che l’attivazione di LFA-1 nel suo stato di alta affinità dipenda strettamente dall’interazione della catena beta2 di LFA-1 con proteine che possono legare l’actina. La Talina è la più studiata tra le proteine che possono legare l’actina ed è in grado di attivare, previa la sua interazione con la catena beta2 di CD18, l’alto stato di affinità per ICAM-1 (14).

L’interazione tra CD18 e la Talina smaschera un epitopo di attivazione presente solo nella forma di LFA-1 in alto stato di affinità e questo viene riconosciuto da due anticorpi monoclonali specifici, il 327A e il 327C. D’altra parte, l’inibizione di RhoA con peptici troiani previene completamente l’induzione nell’alto stato di affinità di LFA-1 indotta da chemochine (6) e blocca la comparsa dell’epitopo di attivazione (Alon comunicazione personale). Quindi nei linfociti, sia la Talina che RhoA co-regolano l’attivazione di CD18. Qual è il collegamento tra RhoA e Talina? Un’ipotesi potrebbe essere che l’interazione funzionale tra RhoA e Talina, che porta al legame di Talina con LFA-1, possa essere mediata da fosfolipasi D1 (PLD1) e fosfatidilinositolo-4-fosfato-5-kinasi (PI(5)K) (in particolare dall’isoforma gamma) entrambi effettori a valle di RhoA. Inoltre, anche Rac1 e CDC42 attivano PLD1 e PI(5)K e, quindi, possono potenzialmente attivare il legame della Talina a LFA-1 e indurne l’attivazione. In questo contesto, la Talina potrebbe essere attivata dall’interazione diretta con PI(5)K e/o da lipidi come PIP2 e PA (prodotti da PI(5)K e PLD1). RhoA, Rac1, Cdc42, PLD1, PI(5)K e Talina potrebbero, quindi, costituire un complesso modulo dinamico di segnale deputato all’attivazione dell'aumento dell’affinità di LFA-1 per ICAM-1 e al rapido arresto dei leucociti circolanti indotto da chemochine. Sebbene le interazioni fisiche dirette tra queste proteine siano gia state ampiamente dimostrate (vedi HPRD www.hprd.org ), l’esistenza di un modulo integrato di proteine attivato da rho e in grado di lavorare come un’entità funzionale pro-adesiva non è stato ancora dimostrato.

TRASDUZIONE DEL SEGNALE DA PARTE DI INTEGRINE E RECLUTAMENTO LEUCOCITARIO: RUOLO DI CHINASI DELLA FAMIGLIA DEL SRC (SFK).

Le recenti evidenze che la trasduzione del segnale da parte di integrine regola la forza di adesione dei leucociti all’endotelio vascolare (9-12) incoraggia studi tesi a identificare componenti della rete di traduzione del segnale integrinico come nuovi bersagli molecolari per il controllo dell’infiammazione. Per quanto riguarda le cellule fagocitarie (granulociti neutrofili ed eosinofili, monoliti/macrofagi), le tirosin chinasi della famiglia del Src (SFK), ed in particolare Fgr e Hck svolgono un ruolo centrale nella trasduzione del segnale da parte di integrine (15).

La conclusione che tali chinasi regolano il reclutamento di fagociti in siti infiammatori è supportata da parecchi studi condotti in vivo: 1) Nella reazione infiammatoria sistemica indotta da lipopolisaccaridi, l’aumentata sopravvivenza di topi hck-/-fgr-/- correla con un ridotto accumulo di neutrofili nel parenchima del fegato (16). 2) Il reclutamento di eosinofili nei polmoni in un modello di infiammazione allergica delle vie respiratorie è marcatamente ridotto in topi hck-/-fgr-/- e fgr-/- (17). 3) L’inattivazione selettiva di Csk, che porta ad un’iper-attivazione delle chinasi della famiglia Src, in granulociti, causa nei topi un progressivo sviluppo di infiammazione polmonare (18). Inoltre anche topi knock-in che esprimono la chinasi Hck costitutivamente attiva sviluppano infiammazioni polmonari spontanee (19). Tali topi sono poi maggiormente suscettibili allo shock endotossico indotto da LPS, e ciò si associa ad un marcato incremento nel numero di granulociti che infiltrano il fegato.
Anche la migrazione di monociti e macrofagi dipende chiaramente dall’attività delle chinasi della famiglia Src. Infatti:1) Sia in saggi di ferita in vitro che in saggi di migrazione in transwell, il movimento di macrofagi hck-/-fgr-/- è significativamente ridotto e macrofagi hck-/-fgr-/-lyn-/- mostrano una ridotta migrazione in un modello in vivo di peritonite indotto da tioglicollato. (20-22). 2) Macrofagi che esprimono una forma costitutivamente attiva di Hck hanno un’aumentata capacità migratoria (19), e Pyk2, un substrato delle chinasi della famiglia Src in cellule mielomonocitiche (15), è richiesta per una normale migrazione di macrofagi sia in vitro che in vivo (23). 3) Le chinasi Hck ed Fgr sono anche in grado di indurre protrusioni di membrana e migrazione cellulare se sovra-espresse sia in linee cellulari mieloidi che non mieloidi. (24-26). Infine è importante sottolineare come un notevole accumulo di cellule mieloidi nei polmoni, così come anche in altri organi, sia una caratteristica tipica di topi mevmev, che esprimono ridotti livelli di SHP-1 (27), una tirosin fosfatasi che neutralizza il segnale dipendente dalle chinasi della famiglia Src (15). Quindi, sia un incremento positivo nel segnale attraverso l’espressione di chinasi della famiglia Src costitutivamente attive, che la perdita di segnale inibitorio in topi mutanti per SHP-1, risulta in un aumentato reclutamento di granulociti e monociti in siti infiammatori.

ADESIONE INTEGRINE-DIPENDENTE E SVILUPPO DI PATOLOGIA NEUROLOGICA DEGENERATIVA

L’encefalomielite sperimentale autoimmune (EAE) e la sclerosi multipla (MS) sono malattie infiammatorie autoimmuni mediate da linfociti CD4+ reattivi ad antigeni cerebrali. Lo sviluppo dei segni clinici di disfunzione del sistema nervoso centrale (SNC) nella SM/EAE, notoriamente correla con l’infiltrato leucocitario nel cervello (28). Quindi, un momento critico nella patologenesi della MS/EAE è rappresentato dalla migrazione dei leucociti nel cervello. I linfociti attivati, ma non resting possono oltrepassare la barriera emato-encefalica (BBB) indipendentemente della loro specificità antigenica: tuttavia solo le cellule che riconoscono antigeni del SNC permangono nel tessuto e possono richiamare altre cellule infiammatorie (29). Per poter migrare attraverso l’endotelio nell’SNC, i linfociti devono innanzitutto aderire saldamente all’endotelio cerebrale. Quest’adesione dipende dall’attivazione linfocitaria da parte di varie fattori come per esempio le citochine, e dal successivo legame dei linfociti attivati a ligandi integrinici endoteliali. I recettori di adesione coinvolti appartengono primariamente alla famiglia delle integrine e delle immunoglobuline. Molte coppie di ligando-recettore sono state dimostrate coinvolte nell’adesione dei linfociti all’endotelio cerebrale; queste comprendono alpha4beta1-VCAM-1 and LFA-1-ICAM-1 (30) .

Benché i recettori di adesione che mediano l’adesione leucocitaria siano stati ben caratterizzati sia in condizioni fisiologiche che patologiche, le vie di secondi messaggeri che controllano l’attivazione integrinica nel SNC sono assai meno caratterizzate. Recentemente, c’é stato un crescente interesse per i meccanismi biochimici che controllano l’attivazione delle molecole di adesione, in quanto la caratterizzazione di questi meccanismi potrebbe favorire lo sviluppo di nuovi farmaci in patologie come infiammazione e metastasi tumorale.

ADESIONE INTEGRINE-DIPENDENTE, RECLUTAMENTO DI CELLULE INFIAMMATORIE ED EPILESSIA

Una crisi epilettica è un evento parossistico dovuto a scariche anormali, eccessive ed iper-sincrone di un complesso di neuroni del sistema nervoso centrale (SNC) (http://www.who.int/topics/epilepsy/en/). L'epilessia è invece un disordine neurologico che interessa l'1-2 per cento della popolazione mondiale e causa crisi ricorrenti dovute ad un processo cronico di fondo (31, 32). La forma di epilessia più frequente nell'adulto è l'epilessia del lobo temporale o limbica (TLE). La TLE è caratterizzata clinicamente dal progressivo sviluppo di crisi ricorrenti spontanee (SRS) che hanno origine dal lobo temporale. Dal punto di vista neuropatologico, la TLE è caratterizzata da alterazioni strutturali di tale lobo. L'alterazione più frequentemente osservata è la neurodegenerazione corticale ed ippocampale, ed in particolare nell’ilo del giro dentato (DG) e negli strati piramidali delle cellule dei campi CA1 e CA3. Le crisi limbiche provocate negli animali da laboratorio dalla somministrazione sistemica di pilocarpina forniscono un modello efficace di epilessia del lobo temporale o limbica (TLE), nel quale lesioni cerebrali conseguenti allo stato di male iniziale (status epilepticus, SE) conducono a SRS dopo una fase di latenza, cioè un intervallo libero da crisi. Per le loro caratteristiche, tali SRS sono molto simili alle crisi temporali umane. In questo modello animale di epilessia sperimentale, la somministrazione sistemica di pilocarpina a ratti da laboratorio innesca crisi acute che si sviluppano rapidamente in SE. Questa fase acuta è seguita da una fase di recupero, nella quale gli animali mostrano un comportamento normale. Tale periodo silente ha un'alta variabilità inter-individuale e dura in media due settimane nel ratto ed una nel topo. La conclusione del periodo silente è contrassegnata dall’insorgenza di una crisi spontanea e gli animali entrano così nel periodo cronico, presentando SRS durante il corso della loro vita, senza alcuna remissione spontanea. Gli episodi critici iniziali determinano quindi alterazioni strutturali, ed in particolare eventi infiammatori e neurodegenerativi, che possono allora a loro volta diventare epilettogenici.

Ultimamente, sia dati sperimentali (31, 32) che dati clinici (33, 34) hanno indicato chiaramente come delle crisi ripetute possano provocare uno stato epilettico attraverso meccanismi neurodegenerativi. E' quindi di estrema importanza lo studio di tali meccanismi per identificare il trattamento farmacologico adeguato per evitare che un singolo episodio di insulto cerebrale possa condurre ad uno stato di epilessia. Negli ultimi anni, il coinvolgimento di citochine infiammatorie nella patogenesi dell'epilessia è stato suggerito dall'osservazione che crisi limbiche aumentano il RNA messaggero (mRNA) di citochine infiammatorie nell'encefalo di roditore (35,-39) , suggerendo con forza che l'infiammazione può svolgere un ruolo critico nella patogenesi dell' epilessia. L’Unità 4 ha recentemente indicato che le integrine LFA-1 e VLA-4 controllano l'arresto dei leucociti nel microcircolo infiammato cerebrale (40, 41). Una recente collaborazione tra l’Unità 3 e 4 ha portato ad osservare una chiara sovra-espressione di ICAM-1, il controligando per LFA-1, dopo le convulsioni indotte da pilocarpina (Fabene et al., submitted to Nature). Questi dati preliminari indicano chiaramente che l'endotelio cerebrale è notevolmente attivato e promuove l'adesione leucocitaria nei topi dopo crisi epilettica (Fabene et al., submitted to Nature). Inoltre, sono stati ottenuti risultati che dimostrano come i neutrofili, monociti e linfociti attivati aderiscono efficientemente all'endotelio cerebrale di topi con epilessia in studi di microscopia intravitale. <<<