RICERCA ITALIANA     

Geni dell'angiogenesi indotti da ipossia: fattori di suscettibilità nella Sclerosi Laterale Amiotrofica ?

Università degli Studi di Siena

Abstract

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa, progressiva e fatale, che interessa i neuroni motori primari della corteccia cerebrale, del tronco dell’encefalo e del midollo spinale. L’incidenza della malattia è di 1-3/100.000 soggetti l’anno e se ne conoscono due forme: una familiare (circa 10% del totale) e l’altra sporadica (90%). Circa il 20% della patologia familiare è da attribuire a mutazioni del gene che codifica per la superossido dismutasi (SOD1), uno dei più importanti enzimi antiossidanti. I meccanismi invece che causano la forma sporadica sono sconosciuti. Recenti studi epidemiologici indicano che l’incidenza della SLA è in aumento in diversi Paesi, probabilmente a causa di fattori ambientali come traumi dell'encefalo e del midollo spinale, attività fisica strenua, esposizione a radiazioni o a stress ossidativo. Questi fattori di rischio non causerebbero di per sè la malattia, che rifletterebbe piuttosto la complessa rete di interazioni tra diversi fattori ambientali e specifici geni di suscettibilità. Vari geni candidati potenzialmente responsabili per la SLA sporadica sono stati proposti. Studi recenti hanno dimostrato che la delezione dell’ hypoxia-responsive element (HRE) nel promotore del gene vascular endothelial growth factor (VEGF) nel topo causa la degenerazione del motoneurone simile alla SLA nell’uomo. Inoltre, è stata riscontrata un’associazione tra particolari genotipi del VEGF, correlati a più bassi livelli di espressione proteica, ed il rischio di malattia. Evidenze sperimentali in vitro confermerebbero, per tale fattore, un’attività neurotrofica e neuroprotettiva diretta. Alterazioni a carico di un altro importante fattore angiogenetico, l’angiogenina (ANG), sembrano anch’esse correlate al rischio di SLA nelle popolazioni Irlandese e Scozzese. Tali risultati non sono stati tuttavia replicati in altri Paesi, e comunque i geni dell’angiogenesi non sono mai stati studiati nella popolazione italiana. Il presente x studio intende verificare, tramite metodiche di genetica molecolare e neurofisiologiche, il ruolo dei suddetti geni come fattori di suscettibilità e/o modificatori dell’espressione clinica della SLA in una estesa coorte di pazienti italiani. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Fabio Giannini Università degli Studi di SIENA

Obiettivo del Programma di Ricerca

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una patologia neurodegenerativa a decorso progressivo e prognosi infausta, caratterizzata da degenerazione primaria dei motoneuroni della corteccia cerebrale, del tronco encefalico e del midollo spinale. La malattia si presenta sia in forma familiare (SLAF) sia in forma sporadica (SLAS), clinicamente indistinguibili. In differenti popolazioni la frequenza di SLAF è il 5-10% di tutti i casi ((Brown RH, 1998). Allo stato attuale sono stati individuati 4 geni maggiori di malattia. Mutazioni del gene della rame-zinco superossido-dismutasi (SOD1, 21q22.1, SLA1) sono responsabili di circa il 20% delle SLAF. Gli altri geni maggiori di malattia identificati sono: ALSIN, 2q33 (SLA2); SETX, 9q34 (ALS4) e VAPB, 20q13.3 (SLA8). Questi ultimi sono stati descritti solo in poche ed isolate famiglie extra-europee, così che circa l’80% delle SLAF è da causa genetica non identificata.
Tuttavia, la SLA è sporadica (SLAS) in circa il 90% di tutti i casi e la sua patogenesi, ad oggi largamente sconosciuta, è comunemente ritenuta multi-fattoriale e verosimilmente dovuta all’interazione di più geni di suscettibilità con fattori ambientali.
Fra i molti fattori genetici di suscettibilità ipotizzati, la letteratura ha recentemente indicato un possibile ruolo di suscettibilità per due geni (VEGF e ANG) implicati nei meccanismi di angiogenesi indotta dall’ipossia.


Gli obiettivi del presente Programma di Ricerca sono così riassunti:

1)Definire il ruolo di geni dell’ angiogenesi (VEGF e ANG) come fattori di suscettibilità genetica alla SLA nella popolazione italiana
2)Verificare se variazioni di sequenza in altri geni fiancheggianti il gene ANG siano coinvolti nella suscettibilità alla malattia
3)Testare le combinazioni di differenti variazioni di sequenza nei geni esaminati per studiarne l’interazione come fattore rischio di malattia <br />4)Individuare un sottogruppo di pazienti portatori di mutazioni e/o polimorfismi “a rischio” nei due geni suddetti
5)Evidenziare eventuali differenze nel fenotipo clinico di malattia fra questo sottogruppo e la restante parte di pazienti SLA (“correlazione genotipo-fenotipo”)
6)Evidenziare, per gli stessi sottogruppi, le eventuali differenze nella velocità di progressione di malattia (perdita del II motoneurone), mediante specifica metodica elettrofisiologica (MUNE)
7)Indagare il possibile ruolo dell’ANG come fattore di neuroprotezione per i motoneuroni <<<

Durata

12 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una patologia neurodegenerativa a decorso progressivo e prognosi infausta, caratterizzata da degenerazione primaria dei motoneuroni della corteccia cerebrale, del tronco encefalico e del midollo spinale che porta ad ingravescente ipostenia/ipotrofia dei muscoli dei distretti bulbari, toracico, addominale e degli arti. Altre funzioni cerebrali, così come quelle sfinteriche ed oculomotorie, sono solo raramente coinvolte. Una lieve compromissione cognitiva è descritta nel 20-50% dei casi, mentre una demenza di tipo fronto-temporale è riportata nel 3-5%. Il decesso è dovuto, in genere, ad insufficienza respiratoria dopo 2-4 anni dall’esordio, ma un piccolo sottogruppo di pazienti può presentare una durata di malattia di 10 o più anni. L'incidenza è di circa 1-3/100.000/anno ed aumenta con l’età. La malattia si presenta sia in forma familiare (SLAF) sia in forma sporadica (SLAS), clinicamente indistinguibili. In differenti popolazioni la frequenza di SLAF è il 5-10% di tutti i casi ((Brown, 1998). Allo stato attuale sono stati individuati 4 geni maggiori di malattia. In circa il 20% delle SLAF sono riscontrabili mutazioni, ad oggi &gt; 100, del gene della rame-zinco superossido-dismutasi (SOD1, 21q22.1, SLA1), a trasmissione dominante o, più raramente, recessiva. La gravità della malattia, in termini di precocità d'esordio e di rapidità di progressione, può mostrare una grande variabilità sia inter- che intra-familiare. La penetranza della malattia può essere incompleta ed età-dipendente così che mutazioni della SOD1 possono essere riscontrati anche in casi apparentemente sporadici. L’analisi genetica della SOD1 può accelerare il processo diagnostico, può essere di aiuto in pazienti con caratteristiche cliniche atipiche (Andersen et al., 2003) e fornire alcune indicazioni di tipo prognostico (Andersen et al., 2005). Il nostro gruppo ha recentemente condotto uno studio retrospettivo, "referred based", sulla distribuzione delle mutazioni del gene SOD1 nella più ampia coorte di pazienti ad oggi descritta in Italia, con l'obiettivo di stimare la frequenza delle forme familiari della malattia, la frequenza di mutazioni SOD1 nei casi FALS e SALS e di valutare la presenza di polimorfismi del gene (Battistini et al., 2005). Abbiamo riscontrato mutazioni del gene SOD1 nel 2.9% dei casi totali di ALS. La frequenza di tali mutazioni nei pazienti FALS (17.9%) è risultata in linea con quanto riportato in altri studi su casistiche internazionali di dimensioni paragonabili.
Gli altri geni maggiori di malattia sono rappresentati da: gene ALSIN, 2q33 (SLA2), a trasmissione recessiva; gene SETX, 9q34 (ALS4), a trasmissione dominante ed alta penetranza; gene VAPB, 20q13.3 (SLA8), a trasmissione dominante ed alta penetranza. Allo stato attuale mutazioni di questi geni non sono mai state descritte nei paesi europei ed il loro screening non è giustificato nell’ iter diagnostico di routine. Sono inoltre noti altri 8 loci associati alla malattia, ma il gene corrispondente non è ancora stato identificato (Kunst, 2004; Andersen, 2006).
Comunque, la SLA è sporadica (SLAS) in circa il 90% di tutti i casi e la sua patogenesi, ad oggi largamente sconosciuta, è comunemente ritenuta multi-fattoriale e verosimilmente dovuta all’interazione di più geni di suscettibilità, non ancora identificati, con fattori ambientali.
Fra i molti fattori genetici di suscettibilità ipotizzati, la letteratura ha recentemente indicato un possibile ruolo di suscettibilità per due geni (VEGF e ANG) implicati nei meccanismi di angiogenesi indotta dall’ipossia (Lambrechts et al., 2003; Greenway et al., 2004; Greenway et al., 2006).
Uno studio sperimentale ha dimostrato che la delezione dell'elemento responsivo all'ipossia (HRE) nel promotore del gene Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) causa nel topo un fenotipo simile alla SLA dell'uomo, suggerendo una insospettata relazione tra il VEGF e SLA (Oosthuyse et al., 2001; Vande Velde &amp; Cleveland, 2005). Inoltre, la somministrazione di VEGF in modelli animali evidenzierebbe un ruolo del VEGF come possibile agente terapeutico per la SLA (Zheng et al., 2004). Il VEGF, noto sin dal 1983 come il più specifico fattore di crescita endoteliale, è stato pertanto riconsiderato alla luce di una possibile attività neurotropica e neuroprotettiva. In particolare, recenti evidenze sperimentali in vitro confermerebbero effetti diretti del VEGF su molteplici linee cellulari neuronali, tra cui i motoneuroni, sia promuovendo la rigenerazione assonale che proteggendo le cellule dalla tossicità indotta dal glutammato (Sondell et al., 2000; Matsuzaki et al., 2001). Questa funzione sulle cellule neuronali sembrerebbe essere in realtà quella filogeneticamente più antica (Popovici et al., 2002). Nei pazienti affetti da SLA è stata rilevata una dis-regolazione della sintesi e del rilascio di VEGF, basale ed in risposta a stimoli induttori come l' ipossia (Moreau et al., 2006). Inoltre, Lambrechts et al. (2003) hanno dimostrato che il VEGF è un fattore in grado di modificare l'espressione della malattia sia nel topo che nell'uomo. Il topo G93A SOD1, un modello murino di SLA, con delezione dell'HRE, sviluppa la malattia in tempi più rapidi e con sopravvivenza significativamente ridotta (da 124 a 107 giorni p= 0.001). D'altra parte, un esteso studio di associazione è stato condotto su tre comuni polimorfismi nella sequenza promotore/codificante del gene VEGF in un gruppo geograficamente eterogeneo di pazienti SLA. Tale studio ha mostrato che 2 genotipi VEGF (omozigosi degli aplotipi AAG e AGG in posizione -2578C/A, - 1154G/A e 634G/C) aumentavano significativamente il rischio di malattia nella popolazione Svedese, Belga e Inglese di Birmingham, ma non in un'altra popolazione inglese dell'area londinese. La meta-analisi di tutte le popolazioni considerate (693 pazienti e 1219 controlli) ha confermato che il rischio di SLA era 1.8 volte più alto per gli aplotipi suddetti (Lambrechts et al., 2003). I due aplotipi "a rischio" AAG e AGG correlavano con una ridotta espressione di VEGF in vitro rispettivamente del 41% e del 30% rispetto all'aplotipo "wild-type" CGC. Inoltre, gli individui con tali aplotipi presentavano livelli significamene minori di VEGF nel siero e nel plasma (Lambrechts et al., 2003). L'associazione di alcuni Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) nel gene VEGF con una ridotta espressione di VEGF ed aumentato rischio di SLA, suggeriscono un legame patogenetico tra livelli di VEGF e rischio di malattia. Particolari genotipi associati a bassi livelli di VEGF potrebbero interagire con fattori ambientali nel favorire la degenerazione motoneuronale.Tuttavia, studi più recenti in altre due popolazioni, rispettivamente del Nord-Est dell'Inghilterra e dell'Olanda, non hanno confermato l'associazione tra gli aplotipi "a rischio" e la SLA (Brockington et al., 2005; Van Vughtet al., 2005).
Sono state descritte, in letteratura, variazioni nella sequenza del gene dell’angiogenina (ANG) associate a SLA. In particolare, il polimorfismo di singolo nucleotide (SNP) in esone 2 (rs11701) è significativamente più frequente in 169 pazienti rispetto a 170 controlli (p=0.001, OR=2.0, CI= 1.2-3.2) (Greenway et al., 2004). Una successiva estensione dell’analisi di questo polimorfismo in 1269 pazienti e 1264 controlli di 5 popolazioni indipendenti, ha confermato l’associazione in Irlanda (p=0.00001, OR= 2.08, 95%CI: 1.48 - 2.93) e Scozia (p=0.001, OR= 1.62, 95%CI: 1.20 -2.19), ma non in USA, Inghilterra e Svezia (Greenway et al., 2006). Inoltre, il sequenziamento della regione codificante del gene, negli stessi pazienti, ha identificato 7 mutazioni “missense” in 15 pazienti SLA, non riscontrate in nessuno dei controlli. Sei di queste mutazioni producono alterazioni in siti funzionalmente importanti della proteina, altamente conservati nella filogenesi. Nel complesso, questi dati suggeriscono sia un possibile ruolo causale negli individui con queste rare mutazioni del gene ANG sia un ruolo modificatore nella patogenesi della SLA nei pazienti portatori del SNP sopradetto.
L’angiogenina fa parte della famiglia della ribonucleasi A pancreatica (RNase A), espressa in diversi tipi cellulari, ha potente attività angiogenetica, induce proliferazione, attiva le proteasi e stimola la migrazione cellulare (Fett et al., 1985). L’attività angiogenetica richiede la presenza sia dei domini con attività RNasica che di quelli non catalitici (Shapiro et al., 1989; Shapiro &amp; Vallee, 1989). Nelle tappe critiche dell’angiogenesi, l’ ANG si lega alle cellule della superficie endoteliale, interagisce con un recettore putativo di 170kD o con una proteina di legame di 42 kD sulla superficie cellulare. Successivamente viene internalizzata, e, tramite un sito di traslocazione nucleare di 5 aminoacidi, viene trasportata nel nucleolo dove stimola la trascrizione di RNAr, che regola la biogenesi ribosomiale, la traslazione proteica e la crescita cellulare (Hu et al., 1997).
Questa cascata di eventi rappresenta una via regolatoria endoteliale a monte del VEGF e di altri fattori angiogenetici come il FGF e l’IGF, ed è importante nella proliferazione cellulare indotta da tali fattori. Inoltre, la down-regolazione dell’ANG da parte di RNA interferente e di oligonucleotidi antisenso diminuisce la trascrizione di RNAr indotta dal VEGF, e l’inibizione della traslocazione nucleare dell’ANG abolisce l’attività angiogenetica del VEGF (Kishimoto et al., 2005). L’attività dell’ ANG è up-regolata in condizioni di ipossia, verosimilmente attraverso un meccanismo mediato dall’HIF-1a (e dal suo gene target DEC-1).
E’ stata dimostrata l’ espressione di ANG nel SNC, e, più recentemente nei motoneuroni, anche se, ad oggi, non esistono dati sulla sua possibile funzione in queste strutture.
Dal momento che, in differenti modelli cellulari, l’ANG ha dimostrato attività simile a quella del VEGF, è ragionevole pensare che, come già dimostrato per questo ultimo, anche l’ANG possieda un’azione neuroprotettiva sui motoneuroni. La conferma di questa ipotesi potrebbe costituire il razionale per futuri trial terapeutici dell’ANG nella SLA. Questo approccio è già stato seguito per il VEGF in due studi recenti su ratti SOD1 G93A. L’infusione nei ventricoli cerebrali di VEGF ha ritardato l’esordio dei sintomi migliorando la funzione motoria e prolungando la sopravvivenza, senza alcun evento avverso. Questi risultati appaiono molto promettenti ed aprono nuove prospettive terapeutiche.

Il ruolo patogenetico di questi geni nella SLA è quindi da definire, ma è ragionevole pensare che possa agire sia come fattore di rischio sia come modificatore dell’espressione fenotipica della malattia. In altre parole, singoli fattori genetici ed ambientali produrrebbero una combinazione peculiare in ciascun paziente, in grado di dar conto del diverso pattern clinico, della diversa età di insorgenza e della diversa velocità di progressione, anche all’interno di casi familiari con mutazione SOD1 identificata. La definizione del fenotipo di malattia si basa su criteri clinici standardizzati e su indagini neurofisiologiche, in grado di rilevare alterazioni subcliniche e differenziare il danno del I e del II motoneurone in ogni distretto anatomico. In particolare, la perdita del II motoneurone e quindi di Unità Motorie (UM) è l’evento che maggiormente condiziona la gravità e la durata. Al di là dell’aspetto puramente diagnostico, il monitoraggio elettrofisiologico, l’unico attualmente disponibile in vivo, di questo parametro è in grado di valutare la velocità di progressione della malattia, altro fondamentale elemento di caratterizzazione del fenotipo. La stima del numero delle unità motorie (MUNE) rappresenta la metodica più validata a questo scopo.
Il MUNE, descritto originariamente nel 1971, è un metodo idoneo a valutare il numero delle UM funzionanti in un determinato muscolo (McComas et al., 1971). Molteplici differenti modalità tecniche ne sono state proposte. Ciascuna ha specifici vantaggi e limiti, ma non esiste una chiara prova che una sia migliore rispetto all’altra (Shefner, 2001). Tra tutte, la tecnica dell’incremento manuale può essere rapidamente e facilmente eseguita ed è ampiamente utilizzata (Daube, 1999; Shefner, 2001; Sartucci et al., 2006).
Dati clinici ed epidemiologici, quali il sesso, l’età d’esordio, la sede di esordio della malattia (bulbare o spinale), la forza muscolare isometrica, l’ampiezza dei potenziali di unità motoria (PUM), l’ampiezza delle onde M, la capacità vitale sono stati riportati in letteratura come indici prognostici nella SLA (Armon &amp; Brandstater, 1999). Tuttavia, queste valutazioni hanno molti limiti. La misurazione della forza muscolare isometrica non può differenziare tra la perdita dei motoneuroni superiori ed inferiori, né tanto meno, in questi ultimi, stimare la reinnervazione collaterale. Inoltre, affinché l’ ipostenia sia rilevabile, è necessaria la perdita di almeno il 50% dei motoneuroni (Hansen &amp; Ballantyne, 1978). D’altra parte, la forza muscolare espressa risulta dalla simultanea contrazione di muscoli sinergici che potrebbero essere diversamente colpiti dalla malattia, mentre il MUNE stima il numero delle UM funzionanti in un determinato muscolo. L’ampiezza dei singoli PUM dipende dal numero delle fibre muscolari innervate, e confrontata alla forza isometrica ha il vantaggio di essere indipendente dall’attività del motoneurone superiore. Questa misura tuttavia non quantifica la perdita del motoneurone inferiore (Hansen &amp; Ballantyne, 1978). Analoghe considerazioni possono essere fatte per valutazioni basate sulla misura del potenziale d’azione muscolare composto (PAMC o onda M). <<<