RICERCA ITALIANA     

Studi genetici ed immunologici in gruppi etnici dell'Africa occidentale con diversa suscettibilità alla malaria

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Le unità di ricerca aggregate in questo progetto sono caratterizzate da competenze complementari nei campi della malariologia, epidemiologia, genetica e immunologia. L’obiettivo generale è di esplorare i meccanismi genetici ed immunologici alla base della resistenza alla malaria descritta nei Fulani dell’Africa occidentale. Precedenti indagini hanno escluso il ruolo di fattori classici di resistenza (emoglobinopatie, enzimopenia per la G6PD, HLA-I) e le evidenze disponibili, ottenute in diversi contesti epidemiologici dell’Africa occidentale, convergono nell’indicare il ruolo di meccanismi immunogenetici nella resistenza alla malaria del gruppo Fulani.
Le indagini programmate comprendono, studi inter-etnici comparativi sul ruolo di polimorfismi genetici in loci codificanti molecole del sistema immunitario e la valutazione fenotipica e funzionale di linfociti T regolatori (CD4+ CD25+, Tr1 e TH3) e di cellule dendritiche.
In riferimento agli aspetti genetici si procederà in particolare all’analisi del ruolo: 1) del locus FOX-P3, localizzato sul cromosoma Xp11.23, codificante il fattore FOXP3-scurfin, principale fattore di regolazione dello sviluppo e della funzione dei linfociti T regolatori CD4+ CD25+; 2) della regione cromosomica 5q31-q33, nota anche come cluster Th2, contenente geni codificanti numerose citochine di regolazione e fattori di crescita del sistema immunitario (IL4, IRF1, IL3, CSF2, IL5, IL9, ADRA1B, IL13, FGF1, CSF1R, IL12); 3) dei geni del pathway di azione dell’IFN-gamma (IFN-gamma, IFN-gammaR1 e IFN-gammaR2, IRF).
La caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule Treg (CD4+CD25+, Tr1 e Th3) circolanti e delle cellule dendritiche sarà valutata utilizzando i seguenti parametri: a) espressione del T-cell receptor (TCR) e delle sue catene Vbeta, di recettori per citochine (CD25high, TNFaRII, TGF-beta1R) e chemochine (CXCR4, CCR7, CCR4, CCR8, CRTH2), di molecole di costimolazione (CTLA4, CD28, ICOS, CD40L, OX40), di mTGF-beta, di recettori KIR e di neutropilina, di fattori di trascrizione (FOXP3). b) Valutazione della percentuale di cellule Treg CD8+CD25high mediante analisi citofluorimetrica. Come parametro della attività funzionale dei linfociti T reg verrà quantizzato, mediante PCR quantitativa, il mRNA per GITR e Foxp3
c). Come parametro dell’attività regolatoria complessiva verrà valutata la percentuale delle cellule producenti citochine regolatrici (IL-10, TGF-beta) mediante analisi citofluorimetrica intracitoplasmatica. d) Analisi, attraverso tecniche di microarray, del pattern di espressione genica di cellule dendritiche, ottenute dopo differenziamento in vitro delle cellule CD14+ del sangue periferico in presenza di IL-4 e GM-CSF e stimolazione con estratti di Plasmodium falciparum o antigeni purificati. L’analisi verrà eseguita ibridizzando cRNA amplificato ottenuto da almeno 5 donatori appartenenti a ciascuna delle tre etnie su chip Microarray specifici. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

David Modiano Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Uno dei possibili approcci nello studio della variabilità umana nella suscettibilità alla malaria consiste nel confronto di indicatori malariologici tra popolazioni con diverso background genetico ma residenti nello stesso contesto epidemiologico e cioè esposti allo stesso livello di trasmissione e agli stessi ceppi parassitari. Infatti, la possibile osservazione di differenze interetniche di suscettibilità in queste condizioni potrebbe contribuire alla identificazione di "nuovi" fattori protettivi. Questo approccio è stato recentemente applicato in studi su larga scala condotti in zone rurali iperendemiche del Burkina Faso e del Mali, Africa occidentale. Questi studi hanno evidenziato chiare eterogeneità interetniche nella suscettibilità alla malaria da P.
falciparum tra i gruppi etnici simpatrici, Fulani, Mossi, Rimaibé e Dogon (29,30). I Fulani (circa 13 milioni), noti anche come Peulh o Fulbe sono pastori nomadi in parte stanziali caratterizzati da tratti non negroidi di possibile origine caucasoide (31,32). Sono presenti in vaste aree dell'Africa occidentale, dal Lago Ciad fino alla costa atlantica, in particolare in Cameroon, Nigeria, Niger, Mali, Burkina Faso, Guinea e Senegal. I Mossi, Rimaibé e Dogon sono popolazioni negroidi Sudanesi tradizionalmente dedite all'agricoltura. Gli studi sopra menzionati (21,29,30) hanno dimostrato che, a dispetto di simili
esposizioni alla malaria e equivalente uso di misure di protezione dalla malattia, i Fulani sono meno parassitati e meno colpiti dalla
malattia rispetto ai Mossi, Rimaibé e Dogon. Inoltre, l'analisi della risposta immunitaria umorale a vari antigeni sporozoitici e degli stadi ematici ha rivelato più alte sieroprevalenze e più alti livelli nei Fulani rispetto ai Mossi, Rimaibé e Dogon (29,30,35). La resistenza all’infezione malarica in questo gruppo etnico non è correlata a geni “eritrocitari” di resistenza alla malaria (Emoglobina S, Emoglobina C, alpha-talassemia, enzimopenia per la G6PD) o a determinanti HLA di classe I, noti per indurre protezione contro l’infezione (32,33). La capacità di sviluppare un’efficace risposta umorale contro numerosi antigeni del Plasmodio depone altresì contro la presenza di un particolare genotipo HLA di classe II (32). Gli elevati livelli anticorpali contro antigeni del plasmodio sono stati messi in correlazione con un’elevata frequenza di una variante allelica del promotore dell’IL-4 (IL4-524 T), ma tale polimorfismo, da solo, non è in grado di spiegare le complesse basi della resistenza all’infezione (34).
Gli studi immunologici finora effettuati hanno evidenziato che i livelli sierici di anticorpi specifici per diversi antigeni di Plasmodium falciparum (CSP,TRAP, Pf155/RESA, Pf332, MSP-1) sono significativamente aumentati in individui appartenenti al gruppo etnico dei Fulani, rispetto ad individui appartenenti ai gruppi simpatrici dei Mossi e dei Rimaibè (29,35). La prevalenza di tale fenomeno nei Fulani è elevata non solo negli individui adulti ma anche nei bambini di età compresa tra 0 e 10 anni ed è associata ad una riduzione della morbosità malarica. Sebbene questi dati suggeriscano con forza che componenti immunogenetiche condizionino la resistenza alla infezione malarica, essi non forniscono alcuna informazione utile sui componenti cellulari o molecolari della risposta immunitaria più probabilmente coinvolti.
Recentemente viene dato sempre maggior rilievo al ruolo delle cellule T regolatorie come mediatori di compromesso tra parassita e ospite (36). Queste cellule, normalmente coinvolte nel mantenimento della tolleranza verso gli antigeni “self”, esprimono costitutivamente il recettore per IL-2 (catena alpha, CD25), sono specificamente caratterizzate dall’espressione di FOX-P3 e GITR, e sono in grado di riconoscere numerosi antigeni “self” e non self (37,38).
La rimozione di queste cellule in modelli murini induce lo sviluppo di varie malattie autoimmuni. Numerose evidenze sottolineano che, in seguito a deplezione di queste cellule, anche la risposta immunitaria contro vari agenti infettivi, incluso batteri, funghi e parassiti intracellulari, è fortemente aumentata. (39-45). In modelli di malaria murini, Hisaeda et al. (8) hanno dimostrato che la deplezione delle cellule T regolatorie con fenotipo CD4+ CD25+ protegge gli animali dalla infezione con un ceppo letale di Plasmodium yoelii e che tale protezione è associata con un aumento della risposta immunitaria verso antigeni del Plasmodium.
La elevata frequenza nel gruppo etnico dei Fulani della sindrome malarica iperreattiva con splenomegalia (46), la tendenza a mostrare elevati livelli di IgM, la elevata percentuale di cellule T attivate con fenotipo CD25+ CD69+, così come la più intensa risposta immunitaria contro altri agenti patogeni, quali cytomegalovirus, Toxoplasma gondii, Schistosoma haematobium (Modiano D., dati non pubblicati) suggeriscono fortemente l’esistenza di alterazioni nella generazione di cellule con attività regolatoria, che normalmente guidano lo switch da una risposta protettiva TH1 verso una risposta TH2 nelle fasi precoci dell’infezione da Plasmodi. Per valutare questa ipotesi è necessario studiare i meccanismi regolatori della risposta immunitaria al plasmodio in questa popolazione e nei gruppi etnici simpatrici dei Mossi e Rimaibè. L’analisi fenotipica e funzionale delle cellule con attività regolatoria così come l’identificazione di polimorfismi in geni codificanti per fattori coinvolti in tale attività potrebbe fornire risposte importanti sulle basi cellulari e molecolari della resistenza all’infezione malarica.

L’obiettivo generale del progetto è di esplorare i meccanismi genetici ed immunologici alla base della resistenza alla malaria descritta nei Fulani dell’Africa occidentale. Obiettivi specifici del programma di ricerca sono:

1) Studio del ruolo di polimorfismi genetici in loci codificanti molecole del sistema immunitario correlate alla funzione delle cellule regolatorie e, in particolare: a) locus FOX-P3, localizzato sul cromosoma Xp11.23, codificante per il fattore FOXP3-scurfin, principale fattore di regolazione dello sviluppo e della funzione dei linfociti T regolatori CD4+ CD25+. b) regione cromosomica 5q31-q33, conosciuto anche come cluster Th2, contenente geni codificanti per numerose citochine di regolazione e fattori di crescita del sistema immunitario (IL4, IRF1, IL3, CSF2, IL5, IL9, ADRA1B, IL13, FGF1, CSF1R, IL12). c) geni del pathway di azione dell’IFN-gamma (IFN-gamma, IFN-gammaR1 e IFN-gammaR2, IRF)

2)Valutazione fenotipica e funzionale dei linfociti T regolatori (CD4+ CD25+, Tr1 e TH3) circolanti nel gruppo etnico malaria-resistente dei Fulani e nei gruppi simpatrici suscettibili dei Mossi e Rimaibè.

3)Valutazione fenotipica e funzionale, nei tre gruppi etnici, delle cellule dendritiche dopo stimolo con estratti di P. falciparum.

Anche lo studio della componente B cellulare del sistema immunitario non può essere sottovalutato: infatti un riarrangiamento preferenziale di catene Ig leggere (L) o pesanti (H), come espressione di attività RAG1/RAG2 indotta da livelli differenti di metilazione dei siti di riconoscimento (47), o una maggiore affinità degli anticorpi prodotti verso i vari antigeni del Plasmodium, come espressione di un produttivo ed efficace processo di ipermutazione somatica, possono contribuire a determinare la resistenza all’infezione.
In conclusione, il gruppo etnico dei Fulani rappresenta un interessante modello umano per definire le condizioni di una risposta immunitaria ottimale verso Plasmodium falciparum o verso antigeni purificati o ricombinanti. Il confronto di tale risposta immunitaria con quella di gruppi etnici simpatrici (Mossi e Rimaibè) può essere di aiuto per lo sviluppo di strategie volte a manipolare il network di citochine, al fine di aumentare la generazione di precursori T e B della risposta immunitaria verso gli attuali e futuri vaccini anti-malarici. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La malaria è una infezione endemica nelle regioni tropicali e subtropicali del mondo. La forma più grave, causata da Plasmodium falciparum, è responsabile di un numero di decessi variabile da 1 a 3 milioni all’anno (1).
Le principali strategie di controllo disponibili (chemioterapia, insetticidi ad azione residua, uso di zanzariere trattate con insetticidi) si sono dimostrate insufficienti ai fini di ottenere una significativa riduzione della morbosità e mortalità malarica. La messa a punto di una efficace immunoprofilassi è oggi considerata una delle maggiori priorità globali a tutela della salute, ma, malgrado gli sforzi compiuti nelle ultime tre decadi, non è ancora disponibile un vaccino antimalarico efficace.
E’ comunemente accettato che la risposta immunitaria acquisita verso il plasmodio sia in qualche modo difettiva, dal momento che sono necessarie infezioni multiple per ottenere una protezione efficace; i soggetti di età pediatrica rimangono suscettibili al rischio di forme gravi di malaria per tempi prolungati. Le infezioni croniche sono frequenti e i soggetti che a seguito di esposizione prolungata hanno acquisito una protezione immunitaria efficace diventano nuovamente suscettibili nel caso in cui abbandonino l’area endemica (2).
Una possibile interpretazione di queste osservazioni è che l’infezione malarica induca una memoria immunitaria a breve termine. Questa ipotesi è stata rafforzata da studi che hanno dimostrato una diffusa morte cellulare per apoptosi delle cellule T in corso di infezione (3), un effetto soppressivo esercitato dagli eritrociti infettati sulle funzioni delle cellule dendritiche (4), una risposta anticorpale contro specifici antigeni del plasmodio di breve durata anche nelle aree endemiche e l’induzione di una risposta protettiva umorale efficace, ma di breve durata, evidente nei trials clinici con i vaccini di ultima generazione (5,6).
Ad ogni modo, malgrado i meccanismi messi in atto dal parassita per sfuggire al controllo del sistema immunitario, è possibile sviluppare, dopo infezioni multiple e/o a seguito di continua esposizione, una risposta protettiva cellulare e umorale in grado di mantenere i livelli di parassitemia sotto la soglia necessaria a sviluppare la malattia nelle sue forme cliniche acute. Sebbene ciò indichi che il sistema immunitario sia potenzialmente in grado di bloccare e/o controllare l’infezione, le modalità e i tempi con cui ciò avviene suggeriscono che le cellule effettrici specifiche sia B che T debbano superare meccanismi di regolazione che limitano lo sviluppo di una risposta protettiva efficace e duratura (2).
Nella malaria umana, numerosi dati sperimentali indicano che la risposta infiammatoria-immunitaria che si sviluppa nelle fasi precoci della infezione contemporaneamente alla crescita logaritmica dei parassiti nella loro fase ematica è inibita una volta che la parassitemia è efficacemente controllata. Questa modulazione è caratterizzata da una diminuita funzione di presentazione dell’antigene da parte delle cellule dendritiche e dalla produzione di citochine con nota attività immuno-soppressiva come IL-10 e TGF-beta (2,7). Le attività svolte da cellule di varia origine (T regolatorie, cellule dendritiche) in questa fase della risposta immunitaria al plasmodio non sono ancora state definite in dettaglio.
In modelli murini di malaria, Hisaeda et al. (8) hanno dimostrato che la deplezione delle cellule T regolatorie con fenotipo CD4+ CD25+ protegge gli animali dalla infezione con un ceppo letale di Plasmodium yoelii e che tale protezione è associata ad un aumento della risposta immunitaria verso antigeni di Plasmodium. Oltre ai linfociti T regolatori anche le cellule dendritiche possono, in alcune fasi dell’infezione, svolgere attività regolatorie. Sia nell’uomo che in modelli murini di malaria è stato dimostrato che le cellule dendritiche sono in grado di mediare attività inibitoria in seguito all’incubazione con eritrociti infetti (7,9). A tutt’oggi non si conoscono né i recettori che le cellule dendritiche utilizzano per riconoscere tali eritrociti infetti, né le vie metaboliche utilizzate per catturare e processare gli antigeni del parassita. E’ altamente probabile, tuttavia, che la loro attività si esplichi, non solo durante l’infezione parassitaria naturale ma anche durante la risposta immunitaria a vaccini anti-malarici compromettendo pertanto l’instaurarsi di una efficace protezione.
A tutt’oggi, i ricercatori concentrano la maggior parte dei loro sforzi nel tentativo di ottenere vettori vaccinici ad alta espressività antigenica. Noi riteniamo che la definizione dettagliata dei meccanismi di regolazione della risposta immunitaria agli antigeni del plasmodio possa contribuire allo sviluppo di strategie che incrementino la generazione, l’espansione e la durata di vita dei precursori B e T della memoria immunitaria. Per tale scopo, i modelli animali, che non mostrano la stessa tendenza dell’uomo all’acquisizione progressiva della immunità, risultano di valore limitato, mentre lo studio di popolazioni o gruppi etnici con diversa suscettibilità all’infezione potrebbe risultare più informativo.
La resistenza all’infezione malarica è notoriamente messa in relazione con anomalie eritrocitarie o emoglobinopatie che compromettono lo sviluppo del parassita. In aree ad alta endemia malarica, il coinvolgimento nelle risposte protettive di alleli letali allo stato omozigote indica l’esistenza di pressioni selettive così forti da disturbare anche l’equilibrio poligenico caratterizzante i meccanismi di difesa anti-infettiva. In questo contesto, differenze nella regolazione genetica della risposta immunitaria a P. falciparum non sono inattese; l’identificazione dei fattori coinvolti potrebbe, a differenza dei geni "eritrocitari" di resistenza alla malaria, migliorare la comprensione delle interazioni parassita-ospite e rivelarsi di forte interesse nello sviluppo di nuovi strumenti di controllo. Considerando il ruolo dell'immunità acquisita nella malaria, è verosimile attendersi che la suscettibilità/resistenza a questa malattia sia influenzata da un ampio numero di geni polimorfici MHC (10) e non-MHC (11,12)coinvolti nella risposta immunitaria.
Negli ultimi anni, oltre a geni che contribuiscono alla differenza tra individui nella suscettibilità alla malaria grave sono state descritte numerose varianti geniche associate alla suscettibilità/resistenza alla malattia in generale. Tra queste ricordiamo varianti nei geni di CD36 (13, 14), CR1, complement receptor 1 (15), HLA-B (10), HLA-DR (10), ICAM1 (16,17), IFNAR1 (18), IFNGR1 (19), IL12B (20), IL4 (21), MBL2 - mannose binding lectin (22), NOS2A - inducible nitric oxide synthase (23,24), TNF - tumour necrosis factor (25,26), TNFSF5 encoding CD40 ligand (27-28). Malgrado ciò, il livello delle conoscenze sul ruolo dei fattori immunogenetici nel determinismo della resistenza/suscettibilità all’infezione malarica rimane ancora molto limitato. Non si conoscono infatti in dettaglio le ripercussioni funzionali delle singole varianti immunogenetiche sulla capacità di montare una efficace risposta immunitaria primaria all’agente infettivo, sulla capacità di superare i molteplici meccanismi di regolazione della risposta immunitaria e, pertanto, di consentire la generazione e il mantenimento di numeri adeguati di precursori di cellule B e T della memoria immunitaria. <<<