RICERCA ITALIANA     

Patogenesi molecolare ed evoluzione clinica delle miopatie dei cingoli

Università degli Studi di Padova

Abstract

Ci proponiamo un progetto innovativo che utilizzi la diagnostica molecolare di recente sviluppata nelle distrofie dei cingoli, per studiarne i meccanismi patogenetici a livello di espressione genetica e fenotipo clinico, ed individuare strategie terapeutiche in queste malattie. Un gruppo di centri clinici con interesse rilevante e con una grande raccolta di casi di malattie neuromuscolari ha costituito una rete di eccellenza per lo studio degli aspetti clinici ed eziopatogenetici a livello molecolare nelle miopatie dei cingoli. La definizione genetica e clinica di distrofia muscolare dei cingoli copre un ampio spettro di miopatie ereditarie in cui sono presenti una progressiva debolezza dei muscoli scheletrici ed in cui si verifica una progressiva perdita del trofismo muscolare, esse possono associarsi a vari disturbi cardiaci, ad insufficienza respiratoria e talora anche a sintomi ad espressione neuropatica (es. laminopatie), mentre gli aspetti cognitivi non sono stati adeguatamente indagati e così la qualità di vita. Tali malattie possono essere caratterizzate da eredità recessiva autosomale (DM dei cingoli tipo 2A-2J) ed eredità dominante (es.distrofia dei cingoli tipo 1A-1E)(Tabella 1). I nostri gruppi di ricerca utilizzano una banca di tessuti muscolari situata nel centro coordinatore contenente oltre 6000 biopsie muscolari, con varie linee cellulari e DNA che nello spazio di 30 anni ha raccolto la maggior parte delle malattie neuromuscolari e fornisce una risorsa scientifica cospicua, utilizzabile sia a scopi di diagnosi che di ricerca, inoltre la unità di Messina dispone di una propria raccolta di casi e di biopsie muscolari (inclusi pazienti con miopatie dei cingoli), l'unità di Pisa dispone di una raccolta di circa 100 pazienti definiti clinico-molecolarmente e così quella di Torino. La cooperazione tra questi centri permetterà di realizzare i seguenti obiettivi:
1. chiarire quali siano i difetti molecolari (proteici e di mutazione) alla base delle distrofie dei cingoli recessive (deficit da calpaina, disferlina, sarcoglicani, etc.) e dominanti (lamina A/C, caveolina etc.) ed indagare il meccanismo molecolare delle corrispondenti alterazioni muscolari.
2. identificare nuovi fenotipi clinici nella distrofia dei cingoli ed il loro corrispondente difetto di mutazione genica e proteico muscolo-specifico.
3. identificare le anomalie di espressione genetica con esperimenti di microarrays e RT-PCR nelle distrofie dei cingoli 1B, 1C, 2A, 2I, 4, correlare i dati molecolari con le alterazioni muscolari, compiere studi di imaging radiologico con RMN muscolare, prove di sforzo muscolare con esercizio aerobico per analizzare il coinvolgimento e l'atrofia e la fatica dei singoli gruppi muscolari ed alterazioni extramuscolari osservate nei singoli casi, cioè con le alterazioni cardiache, respiratorie, cognitive e del sistema nervoso periferico, in una delle più ampie serie di pazienti, disponibile a livello europeo, affetti da tali miopatie.
L’insieme di questi obiettivi permetterà di creare una rete di eccellenza la cui cooperazione mira a chiarire il fenotipo clinico e la sua patogenesi molecolare in pazienti con tali malattie muscolari; da tale cooperazione i medesimi pazienti si gioveranno sia in termine di prevenzione primitiva (consiglio genetico) che secondaria (es. prevenzione a livello di cardiopatia), tale beneficio immediato potrà essere implementato in futuro da nuove strategie terapeutiche.
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Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Corrado Angelini Università degli Studi di PADOVA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Un gruppo di centri clinici con interesse per le malattie neuromuscolari ha costituito una rete di eccellenza per lo studio della patogenesi dei difetti molecolari nelle distrofie muscolari dei cingoli. Tali disordini costituiscono un gruppo di malattie ereditarie in cui sono preminenti la debolezza del muscolo scheletrico e la perdita di trofismo muscolare, ma con frequente riscontro di interessamento cardiaco. Il gruppo si serve di un una banca di tessuti muscolari Telethon contenente oltre 6000 biopsie da analizzare, situata nel centro coordinatore di Padova e di una vasta collezione di biopsie muscolari raccolta nelle altre unità (Messina, Pisa e Torino). Uno dei primi scopi è quello di permettere uno scambio di metodologie molecolari per l'analisi di biopsie e l'utilizzo di tecniche comuni di MRI imaging muscolare tra i centri di Pisa e Padova a scopo diagnostico onde implementare la conoscenza scientifica delle conseguenze a livello fenotipo dei difetti di mutazioni riscontrate a livello molecolare. La cooperazione in rete di questi centri permetterà di realizzare i seguenti obiettivi:
1. chiarire la frequenza delle mutazioni genetiche note e nuove ed i difetti molecolari alla base delle distrofie dei cingoli (gruppo di Padova, Torino e Messina). In particolare saranno investigati per le mutazioni patogenetiche in oltre 100 casi di difetti di calpaina, 50 casi con difetto di alfa-sarcoglicano, 20 casi con difetto di alfa-distroglicano e circa 20 casi con sospetto difetto di lamina A/C e 10 con difetto di caveolina.
2. identificare nuovi fenotipi clinici ed il loro corrispondente difetto proteico muscolo specifico (gruppo di Padova,Pisa). L'identificazione di fenotipi clinici prossimo-distali o di sola iperCKemia si rileva sia nel difetto clinico di disferlina che di caveolina, mentre i difetti di laminina A/C presentano coesistenza di disturbi miogeni e neurogeni. Le forme miti ed asintomatiche di miopatia, con solo iperckemia rappresentano un altro campo di interesse e di approfondimento in cui è possibile riscontrare in diversi geni delle mutazioni patogenetiche.
3. studiare con la tecnica di MRI imaging la espressione clinica delle LGMD onde indagare l'evoluzione e la progressione alla base del danno muscolare delle distrofie dei cingoli (gruppo di Padova e Pisa).
4. costituzione di un database accessibile in rete per monitorare l'espressione clinico-genetica. Nel corso di questo progetto produrremo una serie di dati rilevanti ai fini di espressione genetica e di espressione clinica. Saranno anche messi a punto dei protocolli comuni clinici e diagnostici di carattere innovativo.
Verranno raccolti dati clinico-molecolari rilevanti nei vari casi di distrofie dei cingoli e correlati con studi di espressione genetica riguardante sia geni a carattere muscolare che non muscolare (i.e. infiammazioni, apoptosi). L'insieme di questi dati fornirà un database integrato la cui costruzione avverrà nel corso del progetto, coordinato da meetings periodici dei gruppi di ricerca partecipanti.
L'insieme di questi obiettivi contribuirà a creare una rete di cooperazione per la ricerca clinica e molecolare dei pazienti muscolari da cui i medesimi si gioveranno, ciò potrà porre le basi per nuove strategie di trattamento di queste malattie. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Negli ultimi 15 anni un numero sempre maggiore di geni sono stati identificati che causano le diverse forme di distrofia muscolare (Fig. 1)(1-10) ed in particolare sono numerosi i locus genetici e le proteine coinvolte nelle miopatie dei cingoli (11-12). Il nostro progetto si indirizzerà in particolare allo studio clinico molecolare e di espressione genetica delle seguenti malattie: a) distrofie dei cingoli autosomali dominanti (1C) e recessive (2A,2B, 2C-2E, 2I); b) miopatie prossimali e forme distali da laminopatia (10). Una serie di studi preliminari sono già stati compiuti da parte dei nostri gruppi che hanno permesso di avere una solida base scientifica di tipo molecolare e protocolli clinici di esami in comune. In particolare è stata approntata dal nostro gruppo una metodica di screening delle proteine muscolari con Western blot (2) che verrà applicata su larga scala nelle biopsie raccolte nella banca Telethon a Padova e nelle altra raccolte di biopsie nei centri collaboranti. Ciò permette un approccio di diagnosi molecolare alle distrofie dei cingoli o nei casi di altre miopatie non ancora identificate (iperCkemie, miopatie miti). L'apporto genetico e biochimico molecolare ha portato ad un profondo cambiamento nella classificazione di questi tipi di miopatie con una nuova classificazione basata sia sul loro difetto genetico e molecolare, che sul loro aspetto clinico; è quindi necessario poi una volta identificato il difetto molecolare risalire al loro fenotipo clinico. E' importante verificare se la marcata eterogeneità clinica che si osserva talora anche nella stessa famiglia sia dovuta all’espressione modificante di altri geni che interferiscono con quello mutato od a fattori epigenetici (i.e ambiente, dieta, esercizio fisico), a questo fine ci si avvarrà del contributo della nuova tecnica dei microchips. L'uso dei microarray si sta rivelando un potente mezzo per studiare sia la componente genetica che gli altri meccanismi patogenetici, in parte già da noi analizzati nella distrofia muscolare tipo cingoli 2B causata da disferlinopatia (3), la produttività di tale approccio di ricerca è mostrato dal fatto che attualmente è largamente utilizzata da vari ricercatori sia in altre malattie neurologiche (4) che nelle miopatie infiammatorie (5), nella distrofia muscolare di Duchenne (6-8), nelle distrofie dei cingoli da alfa- sarcoglicanopatia (6). Tale tecnologia documenta l'espressione di transcritti correlati sia con gli aspetti di necrosi ed apoptosi, che con la risposta infiammatoria e la rigenerazione muscolare. Resta da stabilire se i profili di espressione nel muscolo siano diversi in varie malattie muscolari e rappresentino distinti patterns di espressione genica per ogni forma di distrofia, con valenza diagnostica, o chiariscano principalmente eventi patogenetici. Una delle maggiori difficoltà negli studi di espressione genica sarà quindi quella di distinguere tra alterazioni comuni ai vari tipi di distrofie dovute alla necrosi, degenerazione, rigenerazione, dalle alterazioni specifiche di ogni patologia. Con una tecnica statistica di raggruppamento gerarchico "hierarchical clustering" dell'espressione genica nei singoli pazienti questo potrà essere ottenuto. Il nostro gruppo ha di recente proposto in base ad un lavoro di espressione genica con ampia collaborazione internazionale un nuovo meccanismo patogenetico nelle laminopatie in base ai dati di espressione genica (10) che coinvolge la rigenerazione muscolare. Una alternativa per comprendere ciò che è primario e ciò che è secondario nei vari tipi di distrofia è quello di utilizzare come possibile chiave interpretativa ad ogni esperimento di microarrays tutti i geni sovra e sotto espressi a livello di RNA, convalidarli con esperimenti di RT-PCR (che abbiamo di recente acquisito) e tornare poi al fenotipo clinico-patologico del singolo paziente. Per studiare l'aspetto clinico del paziente ci proponiamo di usare tests di forza muscolare in vari gruppi muscolari e scale di carattere funzionale (GSGC index) già validati. I pazienti saranno anche investigati con uno score clinico-radiologico innovativo e ove possibile indagati con protocolli muscolari per esaminare la fatica e la debolezza muscolare. Inoltre ci proponiamo di studiare gli aspetti cognitivi e di qualità di vita nelle LGMD i cui aspetti sono stati poco indagati (13) con scale validate. I meccanismi patogenetici e la variabilità di espressione delle distrofie muscolari non dipendenti da sarcolemmopatie (e.g. sarcoglicani) restano elusivi e dipendono da interazioni proteiche da indagare (14).
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