RICERCA ITALIANA     

Utilizzo di cellule staminali per la terapia dello scompenso cardiaco

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

La presente proposta è un progetto multifasico che si propone di valutare il ruolo potenziale delle cellule staminali come fonte per la generazione di un miocardio funzionale allo scopo di individuare nuove strategie teraputiche per la cura dello scompenso cardiaco.
L'Unita' Condorelli si occupera’ della messa a punto e della caratterizzazione del differenziamento cardiomiocitico da cellule staminali embrionali (CSE) sia di topo che di uomo. La metodologia messa a punto nel suo laboratorio riguardo la generazione di vettori virali per la traduzione di geni in cellule staminali verra’ utilizzata da entrambe le Unità Operative. Inoltre, i cardiomiociti differenziati ottenuti da CSE verranno sperimentati nella loro capacita’ di migliorare la funzione contrattile in modelli animali di piccola taglia con l’unita’ Esposito e, successivamente anche di grossa taglia. Obiettivi specifici dello studio saranno:
1) Valutare se l’efficacia della terapia con cellule staminali nello scompenso cardiaco dipende dall’ezipatogenesi alla base della disfunzione cardiaca.
2) Valutare se la terapia con cellule staminali è in grado di ristabilire una normale funzione del signaling beta-adrenergico.
3) Studiare gli effetti a lungo termine della terapia con cellule staminali sulla sopravvivenza nei modelli animali inclusi nello studio. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Gianluigi Condorelli Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

La presente proposta è un progetto multifasico che si propone di valutare il ruolo potenziale delle cellule staminali come fonte per la generazione di miocardio funzionale per la terapia dello scompenso cardiaco di diversa eziologia.

L’unita Condorelli si occupera’ della messa a punto e della caratterizzazione del differenziamento cardiomiocitico da cellule staminali embrionali (CSE) sia di topo che di uomo. La metodologia messa a punto nel suo laboratorio riguardo la generazione di vettori virali per la traduzione di geni in cellule staminali verra’ utilizzata anche dall'Unita’ Esposito. Inoltre, i cardiomiociti differenziati ottenuti da CSE verranno sperimentati nella loro capacita’ di migliorare la funzione contrattile in modelli animali di piccola taglia e, potenzialmente, anche di grossa taglia con l’unita’ Esposito.

Oltre ad obiettivi comuni, le due unita’ avranno anche obiettivi specifici.

Obiettivi specifici unita’ Condorelli:
Obiettivo 1: Caratterizzazione e selezione di cardiomiociti derivati da CSE umane e murine.
Obiettivo 1a: Generare un sistema di differenziazione di cardiomiociti riproducibile e ben controllato e mettere a punto tecniche per caratterizzare le proprietà molecolari, strutturali e funzionali delle cellule cardiache generate. Obiettivo 1b: Produrre cloni stabili di CSE transgeniche che contengono un gene reporter e un marker di selezione sotto il controllo trascrizionale di differenti promotori cardiaco-specifici. Questi cloni saranno utilizzati per identificare precursori cardiaci precoci, per quantificare il grado di differenziazione cardiomiocitica, per marcare le cellule per studi in vivo e per permettere la selezione di cardiomiociti e la derivazione di colture purificate.
Obiettivo 2: Valutazione dei meccanismi di trasduzione del segnale coinvolti nella differenziazione delle CSE umane e messa a punto di un sistema di differenziazione diretto. Testare il potenziale di induzione cardiogenica delle vie metaboliche canoniche e non canoniche del sistema Wnt e delle proteine esogene e endogene della famiglia delle BMP. Parimenti, ci proponiamo anche di testare l’abilità del microambiente cardiaco sulla promozione della differenziazione delle CSE umane verso la linea cardiomiocitica.
Obiettivo 3 (assieme alle Unita’ Esposito): Valutazione della capacità dei cardiomiociti derivati dalle CSE umane di attecchire, sopravvivere, proliferare, maturare ed integrarsi, sia strutturalmente che funzionalmente, nel tessuto dell’ospite.
Obiettivo 3a: Valutare la capacità dei cardiomiociti derivati dalle CSE umane di integrarsi strutturalmente e funzionalmente nel tessuto cardiaco preesistente. Obiettivo 3b: Valutare la capacità dei cardiomiociti derivati dalle CSE umane di attecchire, sopravvivere, proliferare, maturare e integrarsi, sia strutturalmente che funzionalmente nel tessuto dell’ospite.

Obiettivi specifici dell’Unita’ Esposito
1) Valutare se l’efficacia della terapia con cellule staminali nello scompenso cardiaco dipende dall’ezipatogenesi alla base della disfunzione cardiaca.
2) Valutare se la terapia con cellule staminali è in grado di ristabilire una normale funzione del signaling beta-adrenergico.
3) Studiare gli effetti a lungo termine della terapia con cellule staminali sulla sopravvivenza nei modelli animali inclusi nello studio.

Verranno inoltre valutate:
1) Differenziazione ed organizzazione di cellule contrattili in una nuova matrice con proprietà angiogeniche;
2) Ottimizazione della sopravvivenza cellulare mediante stimolazione dell’angiogenesi (iniezioni di GCSF);
3) Messa a punto di nuove metodologie per il trapianto cellulare (iniezioni via seno coronario mediante cateterismo cardiaco);
4) Estensione delle indicazioni del trapianto cellulare all’insufficienza mitralica ischemica. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il cuore adulto non possiede efficaci meccanismi di riparo e per questo motivo ogni significativa perdita cellulare o disfunzione tissutale, come avviene nell’infarto miocardio, è quasi completamente irreversibile e può portare a una progressiva insufficienza cardiaca (1). Lo scompenso cardiaco può attualmente essere considerato come un’epidemia in aumento, poichè colpisce più di 5 milioni di Americani con 400.000 nuovi casi l'anno (2). Esso pone un grosso aggravio sul sistema sanitario nazionale. Malgrado i progressi compiuti nelle terapie farmacologiche e nelle procedure chirurgiche, la prognosi per i pazienti con questa malattia rimane grave. I recenti progressi in biologia cellulare e molecolare come pure nelle tecnologie di bioingegneria tissutale hanno aperto la via allo sviluppo di un nuovo campo della biomedicina: la medicina rigenerativa. Questo approccio cerca di aggirare il problema della scarsità di organi per trapianti combinando le tecnologie sopramenzionate con lo scopo di rimpiazzare tessuti malati o assenti. Il cuore rappresenta certamente un candidato per questi nuovi paradigmi.
L’approccio basato sulla terapia cellulare e sull’ingegneria tissutale sta emergendo come un nuovo interessante paradigma per il riparo del tessuto miocardio. Questa promettente strategia presenta tuttavia il problema della scarsa disponibilità di cellule in grado di dare origine a cardiomiociti umani, della notevole mortalità delle cellule donatrici dopo l’attecchimento e dai dati che mostrano una modesta integrazione delle cellule donatrici nel tessuto dell’ospite.

In studi precedenti, è stato dimostrato che i cardiomiociti fetali trapiantati negli animali sani sopravvivono, si appaiano con le cellule del ricevente e formano contatti intercellulari con il miocardio ospitante (3). E’ interessante notare come cardiomiociti ad un precoce stadio differenziativo (fetali o neonatale) sono candidati migliori che non le cellule mature, per via di una loro maggior sopravvivenza dopo trapianto in cuori di ratto sia sani che infartuati. Più recentemente, è stato dimostrato che queste cellule possono sopravvivere e migliorare la funzione cardiaca per 6 mesi in un modello di infarto miocardio cronico nel ratto (4). Il trapianto di cardiomiociti era associato ad infarti più piccoli, preveniva la dilatazione cardiaca e il rimodellamento che consegue all’infarto miocardico e migliorava anche la funzione ventricolare in alcuni di questi studi. Il meccanismo che causa questo miglioramento funzionale non è del tutto conosciuto. Vari potenziali meccanismi sono stati proposti, compreso quello di un diretto contributo alla contrattilità miocardia da parte dei miociti trapiantati, l’attenuazione dei processi di rimodellamento per alterazione delle proprietà meccaniche del tessuto cicatriziale, la preservazione di tessuto miocardio vitale attraverso l’induzione di nuovi vasi, e l’amplificazione di un sistema di riparo endogeno.
Le cellule staminali embrionali (CSE) sono cellule staminali pluripotenti di origine embrionale isolate inizialmente dalla massa cellulare interna della blastocisti (5). Queste cellule uniche sono caratterizzate per la loro capacità di crescere indefinitivamente in coltura rimanendo indifferenziate, ma mantenendo la capacità di differenziarsi in tutti i tipi di cellule somatiche, cardiomiociti inclusi (5). La formazione di cardiomiociti all’interno dei “corpi embrioidi” (CE) fornisce uno strumento unico per lo studio in vitro della cardiomiogenesi precoce. Questa proprietà è stata utile per testare molecole candidate ad essere coinvolte nel dirigere la differenziazione delle cellule verso la linea cardiaca (LIF come repressore, acido retinico come induttore) come pure per il clonaggio d’espressione o l’ibridazione sottrattiva per scoprire nuovi regolatori della crescita e differenziazione dei cardiomiociti. L’avvento del modello murino basato sulle CSE ha anche fornito una descrizione dettagliata circa lo sviluppo dell’eccitabilità nei tessuti cardiaci precoci. Inoltre, l’uso di promoter specifici per il tessuto cardiaco in grado di dirigere l’espressione di marker selettivi ha permesso l’isolamento di popolazioni cardiache pure da questa fonte rinnovabile.

E’ stato dimostrato che alcune delle linee CSE umane soddisfano i criteri richiesti per la definizione di CSE (6): esse sono state derivate da blastocisti umane pre-impianto, erano in grado di proliferare per lungo tempo mantenendosi indifferenziate, e dimostravano una stabile capacità di differenziamento per formare cellule derivate da tutti e tre i foglietti embrionali. Le cellule esprimevano anche elevati livelli di telomerasi e mantenevano il normale corredo cromosomico. Cellule isolate dalle aree degli CE che pulsavano spontaneamente mostravano ultrastruttura, espressione genica e proprietà funzionali che erano compatibili con un fenotipo cardiaco ad uno stadio precoce (7). Più recentemente, il laboratorio di Gepstein ha dimostrato che questo sistema non è limitato alla generazione di cardiomiociti isolati, ma piuttosto che viene generato un sincizio funzionale cardiomiocitico con una spontanea capacità di pacemaker e di propagazione del potenziale d’azione (8). Ulteriori studi dello stesso gruppo hanno dimostrato un pattern temporale riproducibile di proliferazione dei cardiomiociti derivati dalle CSE umane, di uscita dal ciclo e di maturazione ultrastrutturale (9). Studi elettrofisiologici hanno rivelato la presenza di tipici potenziali d’azione fornendo indizi importanti per comprendere la base dell’eccitabilità spontanea di queste cellule.

Tuttavia, malgrado questi importanti risultati e l’enorme potenziale delle CSE, numerosi ostacoli devono ancora essere superati prima che questa strategia possa diventare una realtà clinica. Tra questi vi è la necessità di studiare i meccanismi che stanno alla base della cardiomiogenesi così da generare un sistema di differenziamento cellulare più diretto ed efficiente, di stabilire protocolli di selezione per derivare popolazioni pure di cellule cardiache, di amplificare l’intero processo per derivare un numero di cellule adatto ad effettuare studi clinici, e di sviluppare metodi per il miglioramento dell’attecchimento, della sopravvivenza, della funzione e delle proprietà rigenerative delle cellule trapiantate. Parimenti, dovrebbe essere valutata l’abilità delle cellule donatrici di integrarsi strutturalmente e funzionalmente con le cellule dell’ospite, come pure la loro capacità di migliorare le performance del miocardio nelle malattie cardiache.


L’impiego di cellule staminali embrionali (ESC) è stato proposto negli ultimi anni come una potenziale nuova terapia per varie malattie cardiovascolari quali l’infarto miocardico e lo scompenso cardiaco cronico. Tuttavia i risultati degli studi clinici condotti fino ad ora hanno parzialmente ridimensionato l’entusiasmo iniziale in considerazione della relativa mancanza di informazioni sui meccanismi che controllano il processo di differenziamento sia in vivo che in vitro e per il loro potenziale proaritmco (10). Ciononostante, lo studio delle cellule staminali costituisce ad oggi uno strumento dalle notevoli potenzialità sia in ambito terapeutico che per lo studio della fisiopatologia delle malattie cardiovascolari. <<<