RICERCA ITALIANA     

RUOLO DEL SEGNALE LIPIDICO NUCLEARE NEL PASSAGGIO G1/S DEL CICLO CELLULARE

Università degli Studi di Perugia

Abstract

La trasmissione del segnale è un importante meccanismo di regolazione delle funzioni cellulari. Diversi segnali intracellulari che coinvolgono molecole lipidiche sono stati descritti come eventi “regolatori” che controllano il passaggio delle cellule nelle varie fasi del ciclo cellulare ma il loro ruolo è stato solo in parte chiarito. Alcuni secondi messaggeri lipidici, come molecole originate da glicerofosfolipidi e sfingolipidi quali diacilglicerolo, ceramide e sfingosina, sono stati descritti come modulatori della proteina chinasi C. Le diverse isoforme della proteina, con varia localizzazione intracellulare, sono modulate da lipidi e loro derivati. La dimostrazione della presenza nel nucleo della PKC-zeta e di lipidi associati della cromatina può suggerire l’esistenza di un sistema regolatore nucleare delle funzioni cellulari. In particolare è stato dimostrato che nella cromatina sono presenti alcuni glicerolipidi, sfingolipidi ed enzimi responsabili del loro metabolismo e che l’attività di quest’ultimi cambia in rapporto all’inizio della sintesi del DNA. Inoltre, nel nucleo, è stato individuato il complesso ciclina D-antigene nucleare della proliferazione cellulare- ciclina E-chinasi ciclina dipendente2 che è importante per il passaggio dalla fase G1 alla S del ciclo cellulare.
Lo scopo del presente progetto di ricerca è verificare se secondi messaggeri prodotti all’interno del nucleo possano rappresentare un meccanismo di regolazione della proliferazione cellulare in stati fisiologici e patologici e se questi possano rappresentare nuovi targets per lo sviluppo di agenti terapeutici specifici per patologie tumorali. In particolare noi vogliamo chiarire se molecole intranucleari lipidi-derivate possano regolare la progressione del ciclo cellulare agendo sulla PKC-zeta e/o sul complesso ciclina D-antigene nucleare della proliferazione cellulare- ciclina E-chinasi ciclina dipendente2. Vogliamo inoltre stabilire la relazione tra il metabolismo del fosfatidilinositolo, fosfatidilcolina e sfingomielina nucleari in rapporto allo “start point” del ciclo cellulare.
La ricerca verrà condotta: a) in vivo, su fegato di ratto in condizioni normali, dopo epatectomia e dopo trattamento con inibitori della proliferazione; b) in vitro, su cellule di epatoma poste in coltura in presenza di agenti proliferanti, o con inibitori del metabolismo dei fosfolipidi e su cellule di epatoma overesprimenti PKCzeta. Nella cromatina isolata dai vari campioni verranno valutati l’attività degli enzimi del metabolismo lipidico, il contenuto di diacilglicerolo, ceramide e sfingosina prodotti, l’attività della PKC-zeta e l’espressione della ciclina D, dell’antigene nucleare della proliferazione cellulare, della ciclina E e della chinasi ciclina dipendente2.
I risultati ottenuti potranno chiarire: 1) l’esistenza di differenti segnali prodotti da metabolismi lipidici intranucleari; 2) il loro ruolo nel passaggio G1/S del ciclo cellulare in cellule normali e in cellule tumorali; 3) l’indipendenza di questi dai segnali citosolici nel promuovere lo “start point”; 4) l’interazione della trasmissione del segnale dei diversi metabolismi lipidici intranucleari e il suo ruolo nella crescita tumorale; 5) l’identificazione degli enzimi del metabolismo lipidico intranucleare e/o dei metaboliti lipidici come nuovi targets di agenti terapeutici.
I risultati potranno dunque aiutare a comprendere, per la prima volta, i controversi ruoli attribuiti ai lipidi cromatinici. Ciò potrebbe essere un forte goal considerando il crescente interesse internazionale riguardo il ceramide, la sfingosina e il diacilglicerolo prodotti nel nucleo.
L’unità operativa è l’unico gruppo in Italia che lavora su lipidi associati alla cromatina e ha una larga esperienza in questo campo (vedi Descrizione unità operativa).
Tale ricerca è stata giudicata di livello A da ambedue gli esperti nell'anno 2003 e 2004. Il progetto è stato rivisto seguendo i suggerimenti dei referees ed è stato aggiornato. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Maria Pia Viola Magni Università degli Studi di PERUGIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo scopo generale del nostro progetto è quello di verificare se secondi messaggeri prodotti all’interno del nucleo possano rappresentare un meccanismo di regolazione interna della funzione cellulare. Lo scopo specifico del programma è verificare se secondi messaggeri lipidici, come diacilglicerolo (DAG), ceramide e sfingosina possono essere prodotti all’interno dei nuclei di epatociti di ratto durante il passaggio G1/S del ciclo cellulare e se questi agiscono direttamente sul complesso ciclina D-antigene nucleare della proliferazione cellulare (PCNA)-ciclina E-chinasi ciclina dipendente “ (cdk2) oppure via proteina chinasi C-zeta (PKC-zeta). Per verificare il ruolo della PKCzeta, saranno utilizzate cellule che overesprimono tale proteina.
Questo studio può aiutare a chiarire il ruolo del fosfatidilinositolo (PI), fosfatidilcolina (PC) e sfingomielina (SM) cromatini in rapporto alla proliferazione cellulare. E’ noto che, nella cromatina, esistono diversi enzimi deputati al metabolismo dei fosfolipidi (PLs) intranucleari con produzione di DAG, ceramide e sfingosina, considerati importanti secondi messaggeri a livello cellulare.
L’ipotetica relazione che intendiamo studiare è descritta nel seguente schema
Fig.1


Gli specifici obiettivi sono quindi:
1) valutare la produzione all’interno dei nucleo di DAG, ceramide, sfingosina e il loro effetto sull’attivazione della PKC-zeta;
2) studiare il comportamento di PI, PC e SM in relazione alla PKC-zeta e/o al complesso ciclina D-PCNA-ciclina E-cdk2 durante il passaggio G1/S del ciclo cellulare;
3) provare a differenziare, con inibitori, la funzione degli enzimi del metabolismo lipidico presenti nel citoplasma e nelle membrane nucleari da quella degli enzimi cromatinici nel promuovere lo “start point”;
4) valutare l’interazione tra i differenti metabolismi lipidici intranucleari usando inibitori della SMasi in cellule di epatoma e analizzando il metabolismo di PI, PC, SM;
5) studiare la relazione tra ceramide, DAG e PKC-zeta e/o al complesso ciclina D-PCNA-ciclina E-cdk2 in cellule tumorali trattate con farmaci che riducono la crescita cellulare per identificare nuovi targets per lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici.

1) Il primo obiettivo sarà investigato misurando il livello di DAG, ceramide e sfingosina nei nuclei e l’attività della PKC-zeta. Inoltre verrà valutata, nei nuclei, l’attività della sfingomielinasi neutra (N-SMase), sfingomielina-sintasi (SM-sintasi), fosfolipasi C fosfatidilcolina-dipendente (PC-PLC), fosfolipasi C fosfatidilinositolo-dipendente (PI-PLC) e la sfingomielina-sintasi inversa (SM-sintasi inversa). Il loro comportamento sarà studiato nelle membrane nucleari isolate e nella cromatina al fine di stabilire se le modificazioni sono specifiche della frazione fosfolipidica cromatinica. Tali esperimenti saranno fatti su fegato normale. I risultati ottenuti nel raggiungimento del primo obiettivo rappresentano il punto di riferimento per lo studio proposto nel secondo obiettivo.

2) Precedenti risultati hanno dimostrato che i PLs cromatinici cambiano in rigenerazione epatica in cui aumenta anche l’attività della N-SMasi in coincidenza con l’inizio della sintesi del DNA. E’ stato inoltre dimostrato che l’attività degli enzimi del metabolismo dei PLs associati alla cromatina è regolata dai loro prodotti, per es. l’aumento della SM stimola la SMasi con conseguente produzione di ceramide; tale molecola, a sua volta, aumenta l’attività della PC-PLC con conseguente produzione di DAG che controbilancia l’aumento del ceramide (Base di partenza scientifica, fig.4). Questi dati suggeriscono l’esistenza di un sistema nucleare interno che può controllare la proliferazione cellulare. A questo punto si pone il problema di come il sistema di regolazione interna possa influenzare l’entrata delle cellule in fase S del ciclo cellulare. Per chiarire questo punto, sarà valutata innanzitutto la presenza nella cromatina isolata del complesso ciclina D-PCNA-ciclina E-cdk2. Il possibile ruolo di PI, PC, SM e/o DAG, ceramide, sfingosina sulla modulazione dell’attività del complesso verrà studiato nel fegato rigenerante dopo parziale epatectomia. La specificità dei risultati sarà testata usando inibitori della proliferazione cellulare come la trifluoroperazina.

3) Poiché precedenti lavori hanno evidneziato che la N-SMasi, SM-sintasi, PC-PLC e PI-PLC cromatiniche possono essere distinte da quelle presenti a livello citoplasmatico e nelle membrane nucleari sulla base dell’optimum di pH e Km, noi intendiamo in primo luogo stabilire se il ruolo del DAG, ceramide e sfingosina intranucleari è specifico nel promuovere lo “start point”. Inoltre è nostro intento differenziare gli effetti ripetendo gli esperimenti con differenti concentrazioni di inibitori e per differenti tempi. Dopo tali trattamenti, verrà valutata l’attività della N-SMasi, SM-sintasi, PC-PLC, PI-PLC e SM-sintasi inversa e dosati il ceramide, la sfingosina e il DAG nel citoplasma, membrane nucleari e cromatina. Inoltre verrà valutata l’attivazione della PKC-zeta, l’attivazione e l’espressione della ciclina D e E. Allo scopo di chiarire se la PKC zeta è fondamentale nell'attivazione delle cicline, verranno usate cellule di epatoma in cui sarà indotta una overespressione della PKCzeta

4) Se verrà trovato qualche effetto specifico, noi proveremo ad esplorare i meccanismi e le loro interazioni. A tal fine l’attività della SMasi sarà inibita con specifici inibitori farmacologici. Lo studio sarà fatto su cellule di epatoma. L’attività degli enzimi del metabolismo della PI e della PC saranno valutati in rapporto alle modificazioni della SM e i risultati permetteranno di stabilire l’interazione tra i metabolismi lipidici intranucleari.
6) Se sarà dimostrata una interazione tra ceramide, sfingosina, DAG intranucleari e PKC-zeta nel passaggio G1/S, verranno utilizzati farmaci che rallentano la crescita tumorale e verranno valutate le modificazioni metaboliche della PI, PC e SM in rapporto alla PKC-zeta, e/o al complesso ciclina D-PCNA-ciclina E-cdk2.

I risultati ottenuti dalla realizzazione di tali obiettivi permetteranno: 1) di stabilire l’esistenza di un sistema regolatorio lipidico nucleare che agisce durante il passaggio G1/S del ciclo cellulare; 2) di chiarire il possibile ruolo dei PLs cromatinici; 3) di stabilire la specificità delle interazioni di biomodulatori lipidici intranucleari durante il processo tumorale.
Per raggiungere questi goals è necessario utilizzare differenti metodologie comprese la biologia molecolare. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il ciclo cellulare negli eucarioti è costituito da una serie di processi alla fine dei quali una cellula origina due cellule geneticamente identiche. Questo significa che il materiale genetico deve essere duplicato prima della divisione ed egualmente suddiviso tra le cellule figlie. Ciò può essere realizzato attraverso eventi “meccanici” correlati alla replicazione del DNA, alla mitosi e alla citochinesi e eventi “regolatori” che controllano il passaggio delle cellule attraverso le varie fasi del ciclo cellulare (1). Il ciclo cellulare può essere rappresentato come un orologio. La sintesi del DNA e la mitosi sono eventi ben caratterizzati separati da due intervalli o “gaps” chiamati G2, tra le fasi S e M, e G1 dopo la fase M e prima della successiva S. Questi due “gaps” rappresentano importanti punti, chiamati punti di restrizione, che regolano il transito cellulare (1). Ciò può essere dovuto alle differenti combinazioni di specifiche proteine, le cicline, con chinasi cicline-dipendenti (cdk). Il loro comportamento in relazione a varie fasi è stato ampiamente descritto e può essere schematizzato come mostra la figura 2:

Fig.2



- I FOSFOLIPIDI
I fosfolipidi (PLs) sono componenti essenziali delle membrane cellulari, della mielina e delle lipoproteine plasmatiche; la loro presenza è stata dimostrata anche nel nucleo e nella cromatina di cellule vegetali e animali (2-3) dove vengono sintetizzati in rapporto alla sintesi del DNA (4)e hanno un comportamento diverso dai PLs presenti nei microsomi o nella membrana nucleare (5-7). Recentemente nel nucleo sono stati dimostrati anche enzimi responsabili della loro degradazione e sintesi (8-12), suggerendo l’esistenza di un metabolismo intranucleare dei PLs il cui ruolo nella regolazione delle funzioni cellulari è ancora largamente sconosciuto. E’ noto che stimoli esterni possono modificare lo stato cellulare attraverso l’attivazione di segnali intracellulari. La storia della trasduzione del segnale è cominciata nel 1950 (13) e nel 1960, con la scoperta del fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2, 13), derivante dal ciclo del fosfatidilinositolo (PI), è stato definitivamente stabilito che anche i PLs sono coinvolti nella trasmissione del segnale intracellulare. Venivano poi identificati altri secondi messaggeri derivati dai PLs, quali DAG, inositolo (1,4,5) trisfsosfato (IP3), fosfatidilinositolo 3,4,5-trisfosfato (PIP3) e, più recentemente, inositolo 4-fosfato (IP4) e inositolo 6-fosfato (IP6) (14).

- SECONDI MESSAGGERI DERIVATI DAI FOSFOINOSITIDI.
I lipidi contenenti inositolo (Poly-PtdIns)sono da lungo tempo noti come componenti minori delle membrane biologiche(15) e del citoscheletro (16). Il ciclo degli inositidi è stato dimostrato anche nel nucleo di numerosi tipi cellulari, tra cui gli epatociti di ratto. Mentre scarse evidenze sperimentali suggeriscono l’esistenza di una sintesi de novo di PI nel compartimento nucleare, un numero sempre più grande di lavori riporta che il nucleo contiene gli enzimi necessari per il suo metabolismo, quali lipide chinasi e fosfatasi associati alla matrice nucleare, in maniera indipendente dagli eventi che si svolgono a livello della membrana plasmatica (17, 18). Riguardo al possibile ruolo intranucleare dei fosfoinositidi, è stato dimostrato che PI 4-fosfato e Ins (1,4)IP2 sono in grado di attivare la DNA polimerasi, e che PIP2 sembra essere coinvolto nel riassemblaggio della membrana nucleare dopo divisione cellulare (15).Inoltre il PI (4, 5)bifosfato è coinvolto nel mantenimento della cromatina in una conformazione trascrizionalmente attiva(19). La famiglia delle PI-PLC, responsabili dell’idrolisi dei fosfoinositidi, comprende tre sottogruppi, beta, gamma e delta, di proteine a struttura modulare e peso molecolare compreso tra 85 e 150 kDa (20). L’attivazione delle diverse isoforme di PLC porta alla formazione di DAG e IP3, che agiscono come secondi messaggeri intracellulari (21)e intranucleari (15, 22-24). In particolare, in cellule epatiche, la presenza di attività PI-PLC nonché l’aumento di DAG all’interno del nucleo sembrano essere correlati alla proliferazione cellulare indotta da epatectomia parziale (15, 25). Inoltre è stato recentemente descritto il possibile coinvolgimento della attività della PI-PLC-beta1 nella progressione della sindrome mielodisplastica verso la leucemia mieloide acuta (26,27). E' possibile che la traslocazione nucleare delle isoforme di PLC con il ciclo cellulare può portare a cambiamenti dell'ambiente intranucleare e dell'architettura della membrana che modulano la proliferazione e la differenziazione (28).


- 3-FOSFOINOSITIDI COME SECONDI MESSAGGERI.
I fosfoinositidi possono essere fosforilati dalla PI 3-Kinase nella posizione D-3 dell’anello dell’inositolo. I prodotti di questa reazione, 3-fosfoinositidi, sono attualmente considerati importanti secondi messaggeri (29). Aumentati livelli di 3-fosfoinositidi sono stati evidenziati sia nel citoplasma e sia nel nucleo durante la crescita e maturazione cellulare (29, 30-34) e sembrano svolgere un ruolo antiapoptotico (35). In cellule epatiche sembrano essere coinvolti sia in processi proliferativi che apoptotici. In cellule di epatoma PI 3-K sembra infine giocare un ruolo importante nella sintesi di glicogeno indotta da insulina via Akt/PKB(36). L’attivazione di PKC-zeta a valle di PI 3-K osservata in monociti umani (37) e in cellule HL-60 (38) fornisce un esempio del ruolo funzionale dei prodotti di PI 3-K. Recentemente è stato descritto un rapporto di PI3K/PtdIns(3,4,5)P(3)/Akt con l'inizio del processo tumorale e con la soppressione dello stimolo apoptotico (39).

- PC COME FONTE DI SECONDI MESSAGGERI.
Un’altra sorgente di messaggeri lipidici è rappresentata dalla fosfatidilcolina, che è idrolizzata da diverse fosfolipasi (14) attivate da numerosi fattori di crescita, citochine, neurotrasmettitori ed ormoni (40-48). Il DAG derivato dal PC possiede specifiche funzioni (40): attiva le isoforme di PKC calcio indipendente, poiché gli isoenzimi calcio dipendente richiedono il simultaneo aumento del calcio intracellulare e di DAG (40). I fattori capaci di stimolare l’idrolisi del PI e del PC producono due picchi diversi del DAG: il primo, dovuto all’idrolisi del PI è transiente ed associato ad aumento del calcio; il secondo, dovuto all’idrolisi di PC, è più prolungato ed non comporta variazioni di Ca2+. E’ quindi possibile concludere che l’attivazione da parte di DAG delle PKCs calcio indipendenti è più prolungata nel tempo (49). La presenza di PC-PLC è stata dimostrata nella cromatina isolata (11) ed è stato visto che questo enzima ha caratteristiche fisico-chimiche diverse rispetto a quello presente nella membrana nucleare. Inoltre è stato studiato il suo comportamento nel fegato rigenerante ed è stata confermata la differenza rispetto a quello della membrana nucleare in quanto l’attività della PC-PLC cromatinica aumenta in corrispondenza dell’ inizio della sintesi di DNA (11). Il DAG prodotto può attivare la PKC, che è stata dimostrata fosforilare la lamina B, proteina presente nei siti di duplicazione del DNA (50).
Al momento non ci sono dati indicanti che il DAG, derivato dal PC, attiva direttamente la PKC-zeta. Questa isoforma, d’altro canto, è attivata indirettamente dal DAG; infatti, il DAG derivato dal PC e dal PI attivano la SMasi con produzione di ceramide (51, 52) che stimola la PKC-zeta (53). Inoltre la PI-PLC stimola la PC-PLC (49) con conseguente produzione di DAG che stimola la Smasi (51). E' stato dimostrato che esiste la sintesi e il rimodellamento della PC fortemente satura vicino al sito del trasporto citoplasma-nucleo del PI o di altri PLs(52). Recentemente è stata individuata nel nucleo anche la DAG chinasi (DGKs), che converte il DAG a acido fosfatidico; in particolare la DGKgamma regola il ciclo cellulare (53).


- IL SECONDO MESSAGGERO CERAMIDE.
Il ceramide può essere considerato lo sfingolipide con caratteristiche opposte al DAG. È prodotto dall’idrolisi della sfingomielina (SM) ed è stato dimostrato che il ceramide stesso o i suoi derivati, possono agire come secondi messaggeri (54-55, fig.3).

Fig.3



La sfingomielinasi (SMasi) idrolizza la SM formando fosforilcolina e ceramide. Sono stati descritti diversi tipi di SMasi, acida e neutra, aventi diverse localizzazioni; una forma neutra è stata descritta nella cromatina di epatociti di ratto (9), in cui è presente la SM (56). Gli attivatori di questo enzima sono molteplici e tra essi il TNFalfa, l’interferone, l’interleuchina-1 (57) e la vitamina D3 (58). E’ stato dimostrato che la SMasi è stimolata dal DAG nelle cellule ipofisarie GH3 (59). L’idrolisi della SM può indurre sia apoptosi sia differenziamento cellulare in relazione ai diversi stimoli (60). E’ stato dimostrato che l’attivazione degli enzimi ceramide-chinasi e ceramide-fosfatasi porta alla formazione di sfingosine (61). Non ci sono informazioni al momento se i loro effetti sono diversi o simili a quelli del ceramide; in caso di effetti diversi possono essere prospettate diverse vie di attivazione. E’ stato inoltre dimostrato nelle cellule GH3 che il DAG può attivare SMasi con la conseguente inattivazione di PKC (59). Nelle cellule HL-60 indotte al differenziamento dagli esteri di forbolo, la SMasi inibisce la differenziazione in macrofagi suggerendo così che la produzione di basi sfingoidi e inibizione di PKC gioca un ruolo importante nelle funzioni cellulari (62). La specificità delle vie di trasduzione del segnale sopra riportate è stata dimostrata in vitro valutando l’attività della SMasi e la produzione di ceramide (63). E’ stato dimostrato che il TNFalfa si lega ai recettori di membrana, attiva la SMasi che idrolizza la SM di membrana con conseguente formazione di ceramide. Quest’ultimo attiva la corrispondente chinasi presente a livello di membrana con conseguente fosforilazione di proteine citoplasmatiche (64). Il ruolo della via di attivazione della SM può essere duplice; infatti, se la produzione di sfingosina inibisce la PKC, la sintesi di SM, catalizzata dalla SM sintasi, causa un aumento di DAG derivato dall’idrolisi del PC con positivo effetto sul PKC (65). La possibile cooperazione tra le diverse vie di trasduzione del segnale è stata dimostrata in cellule stimolate con TNFalfa. L’influenza di questo fattore sull’espressione di alcuni geni è mediata dall’attivazione del sistema nucleare trascrizionale NF-kB (57). E’ stato dimostrato che l’attivazione del NF-kB da parte del TNFalfa è dovuta ad una attivazione della PC-PLC con produzione di DAG dal PC che a sua volta stimola la SMasi con formazione di ceramide e attivazione di specifiche chinasi (63, fig. 4).
Fig.4


- PKC COME BERSAGLIO COMUNE DEI SECONDI MESSAGGERI INTRANUCLEARI.
DAG, 3-fosfoinositidi e ceramide agiscono sulla proteina chinasi C. PKC comprende una famiglia di serina/treonina chinasi coinvolte nella trasduzione del segnale in diversi tipi cellulari e in numerose funzioni intracellulari. Dodici diverse isoforme di PKC sono state caratterizzate (66, 67), raggruppate in tre categorie a seconda del fabbisogno di Ca2+ ed esteri del forbolo per la loro attivazione. La maggior parte delle isoforme esistono nel citoplasma di cellule quiescenti in forma inattiva, con una sequenza pseudosubstrato occupante il sito attivo. La generazione di DAG nella membrana plasmatica causa una redistribuzione delle isoforme convenzionali e nuove nella membrana mediante legame del dominio regolatore della chinasi stessa (68-71). L’analisi dell’espressione delle diverse isoforme di PKC in diverse linee cellulari ha rivelato che la maggior parte, se non tutte, esprimono l’isoforma zeta (72). La presenza di PKC-zeta in diversi tipi cellulari suggerisce che questa isoforma è coinvolta in varie attività fisiologiche. In particolare, evidenze ottenute su HL-60, indicano che PKC-zeta sembra essere critica, in termini di localizzazione subcellulare e stato funzionale, per il differenziamento granulocitario di questa linea cellulare indotto da ATRA (73-75). Esperimenti compiuti con PKC-zeta purificata hanno dimostrato che questa isoforma di PKC può essere moderatamente stimolata da concentrazioni micromolari di PS o altri fosfolipidi acidici, ma non da Ca2+, esteri del forbolo o DAG. La mancanza di regolazione da parte di Ca2+ e esteri del forbolo è consistente con la presenza di uno anziché due motivi ricchi di cisteina nel dominio C1, responsabile del legame con gli esteri del forbolo (72). Sulla base di queste informazioni, PKC-zeta è stata classificata come esteri del forbolo-indipendente, atipica PKC, la quale non sembra essere né traslocata alla frazione di membrana, né down-regolata in risposta a esposizione acuta o cronica agli esteri del forbolo. Sebbene l’esatta localizzazione della PKC-zeta all’interno di segnali intracellulari già noti è oggetto di numerosi studi, l’attivatore meglio caratterizzato di questa chinase è, per il momento, ceramide (76, 77). Ceramide ha quindi un effetto inibitore sulle chinasi attivate dal DAG o un effetto attivatore sul terzo gruppo di PKC.

IN CONCLUSIONE:
molte ricerche sono state compiute negli ultimi 10 anni, sui prodotti lipidici, per chiarire i vari tipi di agonisti, i meccanismi di trasduzione del segnale ed i corrispondenti effetti sulle diverse funzioni cellulari. Molti problemi rimangono ancora da risolvere, quali la localizzazione intranucleare di molte delle molecole implicate nei diversi segnali, il modo nel quale un complesso attivato può essere trasferito dal citoplasma al nucleo e in che modo un messaggero presente nel nucleo può agire su specifiche funzioni cellulari quali proliferazione, differenziamento e apoptosi. Le diverse isoforme della PKC possono essere le proteine che trasferiscono il segnale al nucleo (78, Fig.5).


Fig.5


Gli attivatori di PKC all’interno del nucleo possono essere DAG, CA2+, 3-fosfoinositidi, ceramide o altri prodotti di idrolisi dei PLs quali l’acido arachidonico. La presenza di PLs è stata descritta nei nuclei anche dopo aver accuratamente allontanate le membrane nucleari. In particolare, PolyPtdIns sono stati evidenziati in associazione alla matrice nucleare. Sempre in nuclei privi di membrana, altre ricerche hanno dimostrato la presenza di PLs come componenti della cromatina. La frazione cromatinica di PLs rappresenta il 10% di quella presente nella membrana nucleare (3) ed ha una diversa composizione ed un diverso turnover (4) oltre ad un diverso comportamento in relazione alla funzione cellulare (5). La SM è presente in alta percentuale nella cromatina (56), nella cui frazione subnucleare sono pure presenti la SMasi (9) e la SM-sintasi (10). In particolare, la quantità di SM varia in relazione alla proliferazione cellulare (79). Anche l’enzima PC-PLC è presente nella cromatina e la sua attività varia parallelamente a quella della SM-sintasi. D’altra parte l’incremento di DAG, accompagnato dalla sintesi di SM, stimola l’attività della SMasi e della SM-sintasi inversa (80) causando un aumento di ceramide ed una diminuzione di DAG (Fig.6).


Fig.6


Il comportamento degli enzimi descritti a livello nucleare suggerisce che i PLs intranucleari e cromatinici possono essere metabolizzati nel nucleo con la conseguente produzione intranucleare di secondi messaggeri. Questo porta ad ipotizzare l’esistenza di un esteso interscambio tra i molteplici sistemi di traduzione intranucleare, la interconversione di un secondo messaggero lipidico in un altro e la produzione di molecole bioregolatrici, specificamente coinvolte nelle diverse funzioni cellulari quali proliferazione, differenziamento e apoptosi. Lo studio di questo complesso fenomeno può aiutare a comprendere il ruolo dei lipidi nei sistemi di segnale intranucleare. Le molecole coinvolte specificamente nei diversi segnali potranno costituire nuovi bersagli per lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici. <<<