RICERCA ITALIANA     

Nuove strategie immunomodulatorie nella Malattia di Graves: ruolo delle chemochine e delle cellule T regolatorie

Università degli Studi di Firenze

Abstract

La tiroide è il principale bersaglio delle malattie autoimmuni, come la tiroidite di Hashimoto e il morbo di Graves (GD). La proteina 10 kDa indotta da interferone (CXCL10/IP-10) è stata recentemente identificata svolgere un ruolo importante nella patogenesi dell'autoimmunità ghiandolare. L'importanza dell'immunità Th1 nella GD in fase attiva è stata suggerita da numerosi studi e recenti evidenze sperimentali hanno mostrato che le chemochine CXC, in particolare CXCL10, svolgono un ruolo importante nelle fasi iniziali delle patologie tiroidee autoimmuni. Infatti, è stato recentemente dimostrato che i livelli sierici di CXCL10 sono aumentati in pazienti con tiroidite autoimmune di recente diagnosi e sono correlati con l'ipotiroidismo. Ciò suggerisce che CXCL10 possa essere un marker di tiroidite più aggressiva e a carattere distruttivo. Recentemente è stata descritta, sia nell'uomo che nel topo, una nuova classe di linfociti denominati cellule T regolatorie, ossia cellule Th dotate di attività immunosoppressiva. Alcuni studi hanno dimostrato che le cellule T regolatorie hanno un ruolo importante nella predisposizione e nella gravità della malattia nel modello murino di GD.
Da queste considerazioni, è evidente che varie strategie di immunosoppressione, indirizzate contro diverse componenti della risposta immunitaria innata e adattativa, possono essere utili nell'inibire lo sviluppo della GD.
Scopo di questo progetto sarà quello di valutare il ruolo di CXCL10 nella GD, verificare se i livelli sierici di CXCL10 possano rappresentare un marker utilizzabile nel monitoraggio clinico dei pazienti affetti da GD e studiare il coinvolgimento delle cellule T regolatorie nella patogenesi della GD. Particolare attenzione sarà rivolta a valutare l'utilità di nuovi agenti immunomodulatori, quali i ligandi del PPARgamma (tiazolidinedioni, TZD) e gli analoghi della vitamina D (VDA), nella GD usando modelli in vitro e in vitro.
In particolare gli scopi di questo progetto saranno:
1) valutare gli effetti di TZD e VDA sulla secrezione di CXCL10 indotta da IFNgamma e sull'espressione dei recettori di IFNgamma e TNFalfa sia a livello proteico che di RNAm in tireociti umani, cellule endoteliali e linfociti intratiroidei di pazienti affetti da GD;
2) valutare gli effetti di TZD e VDA sull'espressione di molecole di adesione sui linfociti T e sulle cellule endoteliali vascolari, l'adesione e la trasmigrazione leucocitaria;
3) studiare la via di trasduzione del segnale attraverso la quale TZD e VDA inibiscono la produzione di chemochine proinfiammatorie, con particolare attenzione alla via di segnalazione di NF-kB;
4) testare i possibili effetti terapeutici del trattamento con TZD e VDA sulla induzione e la progressione di tiroiditi autoimmuni sperimentali.
Per verificare l'utilità del dosaggio sierico di CXCL10 in pazienti affetti da GD, in una seconda parte del progetto, ci proponiamo di:
1) dosare le chemochine sieriche CXCL10 e CCL2 in pazienti affetti da GD prima, durante e dopo diverse trattamenti terapeutici;
2) dosare i livelli sierici delle chemochine in pazienti affetti da oftalmopatia di Graves, prima e dopo il trattamento con corticosteroidi ad alte dosi;
3) effettuare uno studio pilota per valutare l'utilizzo di agenti immunomodulatori nel trattamento della oftalmopatia di Graves. In particolare correleremo gli effetti terapeutici sulla oftalmopatia con le variazioni dei livelli di chemochine sieriche.
Il coinvolgimento delle cellule T regolatorie nella patogenesi della GD sarà studiato in un'altra parte del progetto, mediante:
1) caratterizzazione fenotipica di sottopopolazioni di leucociti infiltranti la tiroide nella GD e la caratterizzazione fenotipica delle diverse sottopopolazioni di linfociti (Th1, Th2 Treg) infiltranti la tiroide nella GD;
2) valutazione degli effetti dei farmaci immunosoppressivi sulle colture in vitro di linfociti Th1 e Th2 e sulle colture in vitro dei linfociti Treg. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Mario Serio Università degli Studi di FIRENZE

Obiettivo del Programma di Ricerca

Scopo di questo progetto sarà quello di valutare il ruolo di CXCL10 in GD, verificando se i livelli sierici di CXCL10 potrebbero rappresentare un marker facilmente valutabile nel trattamento clinico dei pazienti affetti da GD e verificando il coinvolgimento delle cellule T CD24+ CD25+ nella patogenesi della GD. Particolare attenzione sarà rivolta a verificare l’utilità di nuovi agenti immunomodulatori, come TZA e VDA, nella GD usando modelli in vivo e in vitro.
In particolare gli scopi di questo lavoro saranno:
1) valutare gli effetti di TZD e VDA sulla secrezione di CXCL10 indotta dall’IFN-gamma sia a livello di proteina che di mRNA nei tireociti umani, cellule endoteliali e linfociti intratiroidei di pazienti con GD;
2) valutare gli effetti di TZD e VDA sull’espressione del recettore di IFN-gamma e TNF-alfa sia a livello di proteina che di mRNA nei tireociti, cellule endoteliali e linfociti intratiroidei di pazienti con GD;
3) valutare gli effetti di TZD e VDA sull’espressione di molecole di adesione su linfociti T e cellule endoteliali vascolari, l’adesione e la trasmigrazione leucocitaria;
4) studiare la via di trasduzione del segnale attraverso la quale TZD e VDA inibiscono la produzione di chemochine proinfiammatorie, con particolare attenzione alla via di segnalazione di NF-kB, in tireociti umani, cellule endoteliali e linfociti intra-tiroidei di pazienti con GD;
5) testare i possibili effetti terapeutici del trattamento con TZD e VDA sulla induzione e la progressione di tiroiditi autoimmuni sperimentali, con particolare attenzione al loro effetto sulla infiltrazione di cellule mononucleate e sulla distruzione dei follicoli tiroiditi; la correlazione tra i livelli sierici di CXCL10 e altri marker biochimici sarà valutata in gruppi di topi trattati e non trattati con TZD/VDA.
Nella seconda parte del progetto:
1) valuteremo chemochine sieriche (CXCL10 e CCL2) in pazienti affetti da GD prima, durante e dopo le differenti terapie per l’ipertiroidismo;
2) valuteremo i livelli sierici delle chemochine in pazienti con oftalmopatia di Graves, prima e dopo il trattamento con corticosteroidi ad alte dosi;
3) effettueremo uno studio pilota per valutare l’utilizzo di agenti immunomodulatori (diversi dai corticosteroidi) nel trattamento della oftalmopatia di Graves. Di particolare interesse sarà la correlazione tra gli effetti terapeutici sulla oftalmopatia e i cambiamenti delle chemochine sieriche.
In un’altra parte del progetto verrà studiato il coinvolgimento delle cellule T- regolatorie nella patogenesi della GD. Scopi principali di questa parte del progetto saranno:
1) caratterizzazione fenotipica di sottopopolazioni di leucociti infiltranti la tiroide nella GD e la caratterizzazione fenotipica delle diverse sottopopolazioni di linfociti (Th1, Th2 e Treg) infiltranti la tiroide nella malattia di Graves;
2) valutazione degli effetti dei farmaci immunosoppressivi sulle colture in vitro dei linfociti Th1 e Th2 e sulle colture in vitro dei linfociti Treg. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La tiroide è il principale bersaglio delle malattie autoimmuni, quali la tiroidite di Hashimoto e il morbo di Graves (GD). Quest’ultimo è caratterizzato dalla reattività verso antigeni self della tiroide, che può determinare patologie infiammatorie distruttive o malattie autoimmuni anti-recettoriali. I linfociti intratiroidei sembrano svolgere un ruolo centrale nella patogenesi della GD attraverso il riconoscimento degli antigeni della tiroide nei tireociti, passo essenziale per la stimolazione delle cellule T e/o B (1). Inoltre, mediano importanti effetti infiammatori, come il rilascio di citochine (1). Sono stati condotti numerosi studi sulla produzione di citochine nella malattia tiroidea autoimmune, nei quali è stata dimostrata l’espressione di IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, interferone-gamma(IFNgamma) e il fattore di necrosi tumorale (TNFalfa) da parte dei linfociti T infiltranti e dei macrofagi (2). Altri studi basati sulla metodica della PCR hanno dimostrato l’espressione sia dell’IFNgamma che dell’IL-4 nell’infiltrato della GD (3). Recentemente, è stato descritto che le cellule T coinvolte nella GD possono cambiare nel corso della malattia in quanto il sottotipo predominante di cellule T CD4+ in pazienti con ipertiroidismo di recente insorgenza è Th1, mentre i cloni di cellule T nei pazienti con malattia a lunga durata mostrano prevalentemente il fenotipo Th2 (4). Inoltre, le cellule follicolari tiroidee (TCF) producono esse stesse molte citochine (5). E’ noto che il reclutamento dei linfociti è un processo a più tappe basato sulla adesione e sulla migrazione attraverso l’endotelio, sul passaggio attraverso l’interstizio e infine sul movimento verso i tireociti. Le chemochine sono state recentemente identificate come una famiglia di citochine che regolano la normale migrazione leucocitaria e sono coinvolte nelle vie di segnalazione dello sviluppo leucocitario, nella angiogenesi, nella crescita tumorale e nelle metastasi (6). Tra le chemochine della famiglia CXC, è stato recentemente osservato che la proteina 10 kDa indotta dall’interferone (CXCL10/IP-10) svolge un ruolo importante nella patogenesi della autoimmunità ghiandolare (7). L’importanza della immunità Th1 nella GD in fase attiva è stato suggerito da numerosi studi e recenti evidenze sperimentali hanno mostrato che le chemochine CXC, in particolare CXCL10, svolgono un ruolo importante nelle fasi iniziali delle patologie tiroidee autoimmuni (8,9). Nella GD, CXCR3 è espresso sulle cellule endoteliali e su quelle infiammatorie, così come sui tireociti (8,10), e i livelli sierici di CXCL10 aumentano significativamente nelle fasi iniziali della malattia dei pazienti affetti da GD (8). Queste osservazioni cliniche, unitamente alla dimostrazione che i tireociti umani in colture primarie producono grandi quantità di CXCL10 quando stimolati con IFNgamma e TNFalfa (11), suggeriscono che le cellule follicolari tiroidee possono modulare la risposta autoimmune attraverso la produzione di CXCL10 (8,12,13). Queste chemochine possono indurre la migrazione dei linfociti Th1 nella ghiandola dove secernono IFNgamma. A sua volta l’IFNgamma stimola la produzione di chemochine da parte delle cellule follicolari, mantenendo nel tempo il processo autoimmune. E’ stato recentemente dimostrato che i livelli sierici di CXCL10 sono aumentati in pazienti con tiroidite autoimmune di nuova diagnosi e sono correlati con l’ipotiroidismo. Ciò suggerisce che CXCL10 possa essere un marker di tiroidite più aggressiva e a carattere distruttivo (12,13). Un’aumentata espressione di CXCL9 e CXCL10 è stata dimostrata mediante immunoistochimica anche su frammenti chirurgici di tessuto tiroideo ottenuti da pazienti con tiroidite autoimmune (11). Nell’oftalmopatia di Graves, dati preliminari suggeriscono che i livelli circolanti di CXCL10 ed interferone-gamma sono elevati in pazienti oftalmopatici, specialmente in quelli con malattia attiva; sia IFN-gamma che TNF-alfa (sinergisticamente con IFN-gamma) inducono in maniera dose-dipendente la secrezione di CXCL10 non solo in colture primarie di tireociti, ma anche in colture di fibroblasti e preadipociti orbitari ottenuti da pazienti con oftalmopatia di Graves; un agonista del recettore del PPAR-gamma (rosiglitazone) inibisce in maniera dose-dipendente la secrezione di CXCL10 indotta da IFNgamma e TNFalfa sia in tireociti, sia in fibroblasti e preadipociti orbitari (14). Il riscontro di livelli aumentati di CXCL10 nell’oftalmopatia attiva è in accordo con la dimostrazione, ottenuta in studi precedenti, che le citochine a fenotipo Th1 sono coinvolte nella patogenesi della malattia di Graves e dell’oftalmopatia (14-18). In particolare, è stato dimostrato che la fase attiva del Graves è caratterizzata dalla presenza di citochine pro-infiammatorie Th1, mentre altre citochine, prevalentemente a fenotipo Th2, non sono associate a fasi specifiche della malattia (19). La iperproduzione di citochine nelle malattie autoimmuni della tiroide (20) è stata variamente attribuita ai tireociti (21) o ai linfociti intratiroidei (22), o un’origine extratiroidea (23). Resta quindi da chiarire se gli aumentati livelli sierici di CXCL10 nei pazienti con oftalmopatia attiva riflettano esclusivamente o prevalentemente la reazione autoimmune orbitaria.
Sebbene i meccanismi che regolano la produzione degli autoanticorpi non siano ancora completamente chiariti, recentemente l’attenzione si è rivolta allo studio dei linfociti T ad attività regolatoria. Nel corso degli ultimi anni, oltre ai linfociti T effettori con fenotipo Th1 o Th2, sono state individuate, sia nel topo che nell’uomo, alcune sottopopolazioni di Th caratterizzate da una spiccata attività immunosoppressiva (T regolatorie, Treg)(24, 25). Sulla base di ampi studi in modelli murini, due sottopopolazioni di cellule Treg sono state proposte che differiscono per specificità e meccanismi effettori: le cosiddette Treg naturali (CD3+CD4+CD25+) che si sviluppano nel timo e danno vita ad una popolazione endogena circolante a vita lunga di cellule specifiche per antigeni self deputate a prevenire potenziali reazioni autoimmuni. La seconda popolazione di "cellule regolatorie adattive" (Tr1 e Th3) si sviluppano come conseguenza di un’attivazione di cellule T mature in particolari condizioni di esposizione sub-ottimale di antigene e/o di costimolo (26). In particolare, la somministrazione orale dell’antigene o la stimolazione di cellule T CD4+CD25- in vitro in presenza di TGF-beta1 esogeno induce cellule T CD4+ a produrre TGF-beta1 solubile (Th3 cells). Le cellule Th3 sono capaci di inibire l’insogenza di alcune malattie autoimmuni come la encefalomielite autoimmune sperimentale, il diabete mellito insulino-dipendente e la colite (26, 27). Stimolazioni ripetute di linfociti T CD4+ in vitro in presenza di IL-10 esogena inducono la generazione di cellule T regolatorie di tipo 1 (Tr1) capaci di produrre alti livelli di IL-10 e di inibire risposte T effettrici in vivo. Questa particolare sottopolazione di linfociti Th può essere ottenuta in vitro anche attraverso la stimolazione ripetuta di cellule T naïve con cellule dendritiche (CD) allogeniche immature (28). Un’altra popolazione di cellule T ad attività regolatoria è quella caratterizzata dall’espressione sulla membrana di grandi quantità della catena alfa del recettore della IL-2 (CD25high); si tratta delle cellule T regolatorie CD4+CD25+ (definita da qui in avanti come Treg). Le cellule Treg CD4+CD25+ sono state individuate nel timo e nel sangue periferico (SP) sia nel topo che nell’uomo (29, 30). Topi timectomizzati alla nascita che risultano deficitari in tale sottopopolazione sviluppano malattie autoimmuni multiorgano e il trasferimento adottivo di cellule T CD4+CD25+ da topo normale può proteggere questi animali da malattie autoimmuni, suggerendo un ruolo centrale di tali cellule nella tolleranza verso gli antigeni "self" (31). Per quanto attiene alle cellule Treg naturali, recentemente il nostro gruppo ha individuato e caratterizzato la popolazione di Treg naturali nel timo umano (32). Inoltre, sempre a livello del timo umano abbiamo dimostrato l’esistenza di una popolazione linfocitaria non descritta precedentemente di cellule T CD8+CD25+ che condividono con le Treg CD4+ aspetti fenotipici, funzioni e meccanismo di azione (33). Il ruolo delle cellule T regolatorie nella patogenesi della GD è stato studiato in un modello murino. Gli studi compiuti nel topo si sono avvalsi di un modello di induzione di malattia di Graves basato sulla somministrazione di adenovirus codificanti per il recettore del TSH, in ceppi murini BALB/c e C57/BL6, rispettivamente suscettibili e resistenti all’induzione della malattia (34). La deplezione delle cellule CD4+CD25+ non solo determina l’insorgenza di una forma di malattia più grave nel ceppo di topi suscettibile, ma è anche in grado di causare nel ceppo resistente la comparsa della malattia stessa (34). Ciò dimostra inequivocabilmente il ruolo protettivo sullo sviluppo della Malattia di Graves esercitato dalle cellule CD4+CD25+ Treg, e, qualora il dato venga confermato nell’uomo, rende possibile l’ipotesi di strategie terapeutiche mirate ad un potenziamento della loro attività.
Nel corso degli ultimi anni sono stati descritti gli effetti di trattamenti farmacologici immunosoppressivi sulle cellule Treg. Infatti molte delle patologie nelle quali si rende necessaria una soppressione della risposta immunitaria sono caratterizzate da alterazioni funzionali del compartimento Treg. Da studi condotti sia nel LES che nell’asma bronchiale è emerso che il trattamento steroideo cronico incrementa la frequenza di cellule Treg ad indicare che queste sono probabilmente meno sensibili, rispetto ai linfociti effettori, agli effetti immunosoppressivi del cortisone (35,36). Studi condotti su altri farmaci ad azione immunosoppressiva, come la rapamicina, il micofenolato e la ciclosporina, hanno dimostrato che solo quest’ultima è in grado di interferire con la funzione delle cellule Treg poichè impedisce la produzione di IL-2, essenziale per l’attività delle cellule Treg (37,38).
Da queste considerazioni, è evidente che varie strategie di immunosoppressione, indirizzate contro diverse componenti della risposta immunitaria innata e adattativa e finalizzate a risolvere lo sbilancio immunitario senza interferire con il complessivo sistema immunitario, possono essere utili nell’inibire lo sviluppo del GD.
E’ stato recentemente dimostrato che due classi di agenti immunoregolatori sono capaci di modulare la risposta immunitaria nelle patologie autoimmuni, quali il diabete di tipo 1: 1) agonisti del recettore gamma attivante la proliferazione dei perossisomi (PPARgamma) (tiazolidinedioni, TZD) e 2) analoghi della vitamina D (VDA).
Sebbene inizialmente implicato nella differenziazione adipocitaria e nella omeostasi glicidica (39), è stato recentemente dimostrato che il PPARgamma è coinvolto nella modulazione della risposta infiammatoria. Di recente il PPARgamma è stato identificato nei tessuti tiroidei (40) e nei tessuti orbitali di pazienti affetti da oftalmopatia di Graves (41). I TZD sono una classe di farmaci antidiabetici e ligandi sintetici del PPARgamma. In particolare, l’attivazione di PPARgamma indotta dai TZD nei monociti o nei macrofagi blocca l’induzione di molti mediatori infiammatori e immunitari (42). In modelli murini di enterocolite, gli agonisti del PPAR-gamma diminuiscono l’entità del processo infiammatorio, in parte mediante la ridotta secrezione di CXCL10 (43) mentre nelle cellule dendritiche, gli agonisti del PPAR-gamma down-regolano la sintesi di CXCL10 e CCL5 (44), chemochine entrambe coinvolte nel reclutamento di linfociti a fenotipo Th1.
La forma attiva della vitamina D, 1,25-diidrossivitamina D3 [1,25-(OH)2D3], e i suoi analoghi (VDA) non ipercalcemizzanti, svolgono un ruolo di immunomodulazione, ma non inducono una immunosoppressione generalizzata (45). L’azione di questa famiglia di molecole sul sistema immunitario è mediata dal recettore per 1,25-(OH)2D3 che è presente su molte cellule del sistema immunitario, quali i monociti/macrofagi, i linfociti T attivati e i linfociti B. 1,25-(OH)2D3 e alcuni suoi analoghi inducono la differenziazione dei monociti in macrofagi e stimolano la loro attività (46-48). D’altra parte queste sostanze inibiscono la proliferazione delle cellule T e la produzione delle citochine quali IL-2, IL-12, e IFNgamma (49). Questi effetti in vitro si manifestano in vivo con la protezione verso molte malattie autoimmuni e nel prolungamento della sopravvivenza del trapianto (49).
La scoperta del ruolo immunomodulatore sia dei ligandi di PPARgamma che degli analoghi non ipercalcemizzanti della vitamina D può portare allo sviluppo di nuove strategie di trattamento clinico delle patologie autoimmuni e in particolare della GD. <<<