RICERCA ITALIANA     

SVILUPPO E VALIDAZIONE DELL'IMAGING MOLECOLARE CON TOMOGRAFIA AD EMISSIONE DI POSITRONI (PET) NELLA VALUTAZIONE DELLA PROGRESSIONE FIBROGENICA DELLE EPATOPATIE CRONICHE

Università degli Studi di Firenze

Abstract

Uno dei principali problemi nella moderna Epatologia è rappresentato dalla difficoltà di effettuare un adeguato monitoraggio diagnostico della progressione delle epatopatie croniche sclerogene (virali, conseguenti ad abuso alcolico, metaboliche) dalle fasi iniziali di trasformazione fibrotica del tessuto epatico fino alla cirrosi. La biopsia epatica rappresenta ancora il gold standard. Tuttavia, negli ultimi dieci anni è emersa in modo sempre più impellente la necessità di poter utilizzare metodologie non invasive o minimamente invasive e capaci di fornire un’indicazione dell’andamento dinamico della malattia. Ciò in relazione alla necessità di un monitoraggio ravvicinato durante e dopo cicli di terapia soprattutto con farmaci antivirali. La validità dei cosiddetti marcatori sierici di fibrogenesi è tuttora in discussione, nonostante i dati attualmente disponibili conducano a pensare che la loro efficacia diagnostica sia di qualche valore solo nelle forme molto avanzate e quindi al di fuori del range clinico di attuale maggiore interesse. Le tecnologie di imaging (ecografia, TC, RM) hanno fornito finora importanti indicazioni diagnostiche anche se anch’esse limitate alle fasi avanzate della malattia. Tuttavia è opinione sempre più diffusa che il futuro nella diagnosi di questa importante problematica clinica risiede in metodologie che possano abbinare la rapidità, globalità, non invasività ed efficienza delle tecnologie di imaging con marcatori biologici, derivati dalla ricerca di base nel campo della fibrogenesi epatica e processi correlati. Lo scopo della presente ricerca è fondamentalmente quello di utilizzare la conoscenza relativa ad alcuni fenomeni chiave del processo fibrogenetico, quali la progressiva ipossia tissutale e la conseguente stimolazione del processo angiogenetico, come marcatori biologici da impiegare in tecnologie di imaging cosiddetto molecolare e di poter fornire le basi per uno sviluppo di questo tipo di metodologia diagnostica nel monitoraggio dell’evoluzione fibrogenica delle epatopatie croniche. Il progetto sarà svolto da tre unità di ricerca deputate rispettivamente a: A. caratterizzare la dinamica temporale e le caratteristiche dei suddetti fenomeni biologici in due modelli animali di progressiva fibrogenesi, su cui verrà valutata la correlazione e l’efficacia diagnostica di potenziali biomarcatori mediante imaging molecolare (micro PET); B. valutare secondo quello che rappresenta attualmente lo stato dell’arte diagnostico tre gruppi di pazienti affetti da epatopatia cronica HCV-correlata in tre diversi stadi di evoluzione verso la cirrosi da avviare successivamente ad uno studio di imaging utilizzante RM e PET; C. misurare la ipossia tissutale epatica eseguendo nei pazienti uno studio PET con fluoromisonidazolo e correlandolo con lo stadio istopatologico di eveluzione verso la cirrosi; D. sviluppare la marcatura di nuovi biomarcatori da impiegare in associazione con tecniche di imaging in grado di correlare sia con il progesso fibrogenetico che con quello angiogenetico intraprendendo per questi uno studio di fattibilità nei modelli animali sopra citati. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giacomo Laffi Università degli Studi di FIRENZE

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il presente progetto di ricerca si propone di “tradurre” alcune acquisizioni relative ad eventi biologici fondamentali del processo fibrogenetico del tessuto epatico tipico delle epatopatie croniche evolutive in una metodologia diagnostica innovativa e non invasiva in grado di fornire informazioni sulla progressione di malattia nella globalità dell’organo, basata sulla PET e su traccianti molecolari di ipossia e di angiogenesi/fibrogenesi. In pratica il progetto si propone di trasformare alcuni meccanismi patogenetici fondamentali (in particolare la presenza di ipossia tissutale e l'espressione di recettori di fattori di crescita coinvolti sia nel processo fibrogenetico che in quello angiogenetico) in biomarcatori da utilizzare in associazione con tecniche di imaging strutturale e molecolare e di validarne la potenzialità sia in due modelli di fibrogenesi epatica nell’animale da esperimento e in una popolazione selezionata di pazienti affetti da epatopatia cronica HCV-correlata in varie fasi di evoluzione verso la cirrosi.
Questo obiettivo generale dovrà essere raggiunto attraverso l’azione congiunta ed integrata delle tre unità di ricerca incluse nel progetto rivolta all’acquisizione dei seguenti obiettivi particolari:
A. caratterizzare la dinamica temporale e le caratteristiche dei suddetti fenomeni biologici in due modelli animali di progressiva fibrogenesi, su cui verrà valutata la correlazione e l’efficacia diagnostica di potenziali biomarcatori mediante imaging molecolare (micro PET);
B. valutare secondo quello che rappresenta attualmente lo stato dell’arte diagnostico tre gruppi di pazienti affetti da epatopatia cronica HCV-correlata in tre diversi stadi di evoluzione verso la cirrosi da avviare successivamente ad uno studio di imaging utilizzante RM e PET;
C. eseguire nei pazienti uno studio PET con fluoromisonidazolo per misurare la ipossia tissutale epatica e correlarla con lo stadio clinico;
D. sviluppare la marcatura di nuovi biomarcatori da impiegare in associazione con tecniche di imaging in grado di correlare sia con il progesso fibrogenetico che con quello angiogenetico ed intraprendere uno studio di fattibilità nei modelli animali sopra citati. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L’EVOLUZIONE FIBROGENICA DELLE EPATOPATIE CRONICHE E IL CONCETTO DI “VELOCITA DI PROGRESSIONE DELLA FIBROSI”
A fronte di milioni di individui affetti a livello mondiale da malattie croniche del fegato, solo una percentuale relativamente limitata (20-30%) è suscettibile di evoluzione verso una fibrosi significativa e la cirrosi. Questo è particolarmente valido per l’epatopatia cronica da HCV per la quale si prevede un picco di incidenza di cirrosi scompensata tra il 2010 e il 2015. Indipendentemente dall’eziologia, la cirrosi epatica rappresenta la più comune malattia non-neoplastica causa di morte tra tutte le malattie epatobilodigestive sia in Europa che negli Stati Uniti d’America. Inoltre, questa condizione è associata con un’elevata incidenza di tumori primitivi del fegato con un ulteriore aumento del rate di mortalità [1,2].
La sempre migliore conoscenza dei meccanismi responsabili della fibrogenesi epatica associata all’introduzione di terapie sempre più efficaci ha condotto alla necessità di acquisire un approccio clinico più adeguato nella valutazione della progressione delle epatopatie croniche verso la cirrosi. Il concetto di “fibrosis progression rate” ha notevoli implicazioni per la stratificazione del rischio, per la prognosi e per la valutazione dell’efficacia terapeutica del trattamento proposto [3,4]. Questo concetto distingue inoltre in modo netto la fibrosi (l’evidenza statica di un risultato al momento di una singola osservazione) con la fibrogenesi (il processo dinamico).

VALUTAZIONE CLINICA DEL PROCESSO FIBROGENICO: LO STATO DELL’ARTE
La valutazione istologica mediante biopsia epatica rappresenta ovviamente l’approccio più diretto per la valutazione della fibrosi epatica. Tale indagine permette inoltre una valutazione topografica della fibrosi e offre la possibilità di effettuare studi molecolari. La biopsia epatica rappresenta tuttora il gold-standard per una conferma della diagnosi, per una valutazione della severità del processo necroinfiammatorio e fibrogenetico, per valutare la presenza di malattie concomitanti e guidare l’intervento terapeutico. Tuttavia, la biopsia epatica è associata a potenziale morbilità e mortalità ed ha diverse limitazioni quali errori di campionamento e un’alta variabilità tra diversi osservatori [3]. Inoltre, l’errore di campionamento assume un impatto negativo ancora maggiore nelle epatopatie caratterizzate da una disomogenea distribuzione della necro/infiammazione e della fibrosi (es. HCV) in cui si rende spesso necessaria una valutazione prima e dopo un ciclo di trattamento [5]. Va poi sottolineato che l’informazione fornita dalla biopsia epatica è statica e non riflette il continuo rimaneggiamento (deposizione e degradazione) e la velocità di progressione verso la cirrosi. In pratica, sebbene rappresenti ancora l’esame diagnostico di riferimento, la biopsia epatica non soddisfa il sempre crescente bisogno di mezzi diagnostici rapidi, non invasivi, ripetibili e in grado di fornire un’informazione sulla dinamicità del processo, particolarmente in risposta ai regimi terapeutici correntemente proposti.
I cosiddetti marcatori surrogati di fibrosi epatica sono stati proposti per la valutazione della fibrosi in sostituzione della biopsia epatica o più propriamente per essere impiegati in associazione con essa per monitorare la progressione o la regressione della fibrosi in seguito a trattamento. Idealmente, questi marcatori dovrebbero essere basati su test accurati e riproducibili da ripetere frequentemente con minimo disturbo per il paziente. Un tentativo in questo senso proposto negli ultimi anni è rappresentato dai cosiddetti “marcatori sierici”. Tra questi, alcuni sono basati su comuni alterazioni biochimiche associate all’epatopatia cronica e non riflettono direttamente le alterazioni a carico della matrice extracellulare (MEC) tipiche del processo fibrogenetico: “marcatori indiretti”, mentre altri sono direttamente correlati con le suddette alterazioni: “marcatori diretti”. Nonostante gli sforzi in questo senso siano stati numerosi, i risultati degli studi utilizzanti tali marcatori integrati in vari tipi di algoritmo suggeriscono che i marcatori sierici sono in grado di distinguere chiaramente solo forme iniziali di trasformazione fibrotica da forme avanzate e sono quindi non in grado di potere monitorare la gradualità della progressione verso la cirrosi [3].
Le tecniche di imaging hanno raggiunto un elevato grado di sofisticazione ed accuratezza e vengono utilizzate comunemente nella valutazione di pazienti affetti da vari tipi di epatopatia. Tuttavia, l’efficienza di queste tecniche è attualmente limitata alla individuazione dell’avvenuta trasformazione cirrotica e delle relative complicanze (in particolare l’epatocarcinoma). Studi utilizzanti l’ecografia, la TC e la RM sono stati basati sull’identificazione di modificazioni strutturali come la riduzione delle dimensioni del lobo destro ed il concomitante aumento di quelle del lobi sinistro e caudato. Questi approcci sono caratterizzati da alta specificità ma anche da una sensibilità molto limitata dato che alterazioni strutturali significative sono osservabili solo nelle forme avanzate della malattia (vedi ampia review in 3). L’uso dell’ecografia, nel presente stadio di sviluppo tecnologico, ha similmente un ruolo complementare nella diagnosi di fibrosi avanzata/cirrosi e può fornire un aiuto importante in presenza di dati clinici e istologici non chiari [6,7]. E’ possibile che la recente introduzione di mezzi di contrasto ecografici possa condurre a positivi miglioramenti nella sensibilità di questa tecnica.
Pertanto dalle suddette considerazioni emerge che:
1. la valutazione istopatologica del tessuto epatico ottenibile mediante biopsia epatica percutanea, sebbene rappresenti tuttora la metodologia di riferimento, è caratterizzata da diversi problemi interpretativi e fornisce una visione statica della progressione della malattia relativa a circa 1/50.000 del fegato. Quest’ultimo punto è particolarmente rilevante quando si considera che le più comuni epatopatie croniche, come ad esempio le forme conseguenti ad infezione cronica da HCV, sono caratterizzate da una notevole disomogeneità nella distribuzione del processo necroinfiammatorio, fibrogenetico ed angiogenetico.
2. La validità clinica dei marcatori sierici indiretti è altamente questionabile dato che essi riflettono alterazioni biochimiche che si rendono evidenti solo nelle fasi avanzate della malattia. L’efficacia diagnostica dei marcatori sierici diretti è ancora in fase di validazione. E’ comunque probabile che anche questi, anche se utilizzati mediante sofisticati algoritmi, non siano in grado di fornire una valutazione globale della fase di evoluzione della malattia.
3. Le attuali limitazioni relative al potenziale diagnostico delle metodologie di imaging sono largamente dipendenti dal basso potere discriminativo della tecnologia attualmente disponibile. E’ comunque chiaro che le attuali tecniche di imaging (ecografia, TC, RM) sarebbero in grado di fornire migliori indicazioni se adeguatamente focalizzate sulle caratteristiche strutturali e biologiche della lesione parenchimale diffusa piuttosto che sulle lesioni focali, per le quali vengono attualmente impiegate. Come sarà esposto dettagliatamente nei paragrafi seguenti l’associazione delle tecniche di imaging con marcatori biologici e con la conoscenza delle alterazioni morfo-strutturali che si verificano nel tessuto epatico cronicamente danneggiato rapprenta una base per lo sviluppo di più accurati mezzi diagnostici non invasivi da impiegare nella valutazione della progressione delle epatopatie croniche verso la cirrosi.

BASI RAZIONALI PER UN MIGLIORAMENTO DELL’EFFICIENZA DIAGNOSTICA DELLE TECNICHE DI IMAGING STRUTTURALE NELLA EPATOPATIE CRONICHE
1) un’adeguata misura delle modificazioni della per fusione;
2) un’adeguata quantificazione della fibrosi nel paziente pre-cirrotico.
I suddetti obiettivi sono infatti strettamente legati alle importanti modificazioni strutturali del parenchima epatico durante la progressione del processo fibrogenetico. La presenza di modificazioni della perfusione è la conseguenza diretta del processo necroinfiammatorio e fibrogenetico nella zona periportale dove le strutture sinusoidali hanno origine. A questo livello esiste una presisa relazione anatomica tra l’arteria epatica, il sistema portale, e i sinusoidi. In particolare, i rami dell’arteria epatica e della vena porta sono in comunicazione tra loro e con il sistema sinusoidale attraverso il plesso peribiliare. Questi tre sistemi di comunicazione artero-venosa vengono aperti mediante l’azione di fattori vasoattivi (es. adenosina, vasopressina) rilasciati in conseguenza di infiammazione cronica, stress ossidativo e successivamente da fenomeni ipossici. Paradossalmente, mentre l’afflusso sanguigno ai sinusoidi diviene progressivamente sempre più arterioso (arterializzazione), il livello di ossigenazione a livello epatocitario diviene sempre minore in conseguenza della progressiva capillarizzazione dei sinusoidi. Queste modificazioni si traducono alla TC come immagini di aumentato contrasto in fase arteriosa nelle regioni periferiche associato a una diminuzioni nelle zone peri-ilari [8,9].

LA RICERCA DI MARCATORI MOLECOLARI IMPIEGABILI PER UN ACCURATA E COMPLETA VALUTAZIONE DELLA PROGRESSIONE DELLE EPATOPATIE CRONICHE
Studi eseguiti in vitro ed in modelli animali e quindi confermati su campioni di tessuto ottenuto da pazienti con epatopatia cronica hanno evidenziato una stretta associazione tra il processo cronico di riparazione tissutale coinvolgente diversi tipi cellulari e fattori solubili, la progressiva deposizione di MEC di tipo fibrillare, una progressiva ipossia cellulare risultante dalla capillarizzazione dei sinusoidi con conseguente attivazione del processo angiogenetico. La conseguente formazione di nuovi vasi associata alla progressiva cicatrizzazione del tessuto conduce a importanti modificazioni angioarchitetturali che costituiscono il “punto di non ritorno” verso una normale struttura anche nel caso si possa intraprendere una terapia eziologica efficace. Il ruolo dell’ipossia epatocellulare è stato recentemente studiato in un modello animale di fibrosi epatica post-necrotica [10]. I risultati di questo studio indicano che l’ipossia, l’angiogenesi e la fibrogenesi sono fenomeni strettamente e reciprocamente consequenziali nel processo di riparazione cronica del tessuto.
Questo contesto fisiopatologico permette di identificare un numero di eventi biologici potenzialmente tracciabili mediante l’uso di tecniche di imaging utilizzanti marcatori molecolari ed in particolare: il grado di ipossia del tessuto epatico conseguente alla progressiva capillarizzazione dei sinusoidi [11] e l’espressione di recettori di fattori di crescita tipicamente coinvolti nel processo fibrogenetico e angiogenetico. In questo senso, studi classici in questa area di ricerca hanno dimostrato una correlazione altamente significativa tra l’espressione dei recettori per il platelet-derived growth factor (PDGF) ed il grado di evoluzione fibrotica in un’ampia popolazione di pazienti con diverso grado di evoluzione di epatopatia cronica HCV-correlata [12].

TECNICHE DI IMAGING STRUTTURALE E MOLECOLARE CON POSSIBILI PROSPETTIVE NELLA VALUTAZIONE DELLE PROGRESSIONE FIBROGENICA DELLE EPATOPATIE CRONICHE

IMAGING STRUTTURALE. Come precedentemente menzionato, la progressive “arterializzazione” del parenchima epatico può essere visualizzata mediante metodologie di imaging strutturale quali la TC e la RM.
TOMOGRAFIA COMPUTERIZZATA (CT). La progressive ‘arterializzazione’ del parenchima epatico alla base delle CLD può essere visualizzata con le tecniche di imaging come la TAC e l’RMN. Con la TAC con mezzo di contrasto, nel fegato con fibrosi avanzata, l’arterializzazione è più evidente nelle aree periferiche dell’organo dove il deficit di perfusione portale è più marcato. In queste aree è possibile rilevare il cosiddetto ‘fenomeno centro-periferico’ (8,9).
D-MRI. Con l’RM di diffusione (DwI), è possible sensibilizzare il segnale nel singolo voxel al movimento incoerente dei protoni di idrogeno e delle molecole di acqua. Di conseguenza l’imaging ottenuto con la RM di diffusione potrebbe essere considerato rappresentativo del contenuto e della mobilità dell’acqua tissutale che a sua volta è in relazione con la crescita della componente epatica invasa dalla fibrosi.
IMAGING con RESOVIST. Resovist (RSV) (SHU-555A, Schering, Berlino, Germania) è un mezzo di contrasto T2 a “doppio uso”composto di particelle di ossido di ferro superparamegnetiche. Dopo somministrazione endovenosa viene completamente fagocitato e ‘messo in deposito’dalle cellule del sistema reticolo-endoteliale (RES) del fegato e della milza [13]. Nell’imaging di Risonanza Magnetica le particelle di ossido di ferro sono usate come enfatizzatori negativi del segnale, poiché possiedono un elevato rapporto R2/R1 il che comporta che il raccorciamento dell’effetto T2 è maggiore di quello T1 [14]. Nel fegato cirrotico RSV ha un basso effetto sul T2 rispetto a quello che ha nel fegato sano, poiché nella cirrosi l’attività del RES è diminuita, probabilmente per una alterazione funzionale delle cellule di Kupffer.

IMAGING MOLECOLARE. L’imaging molecolare costituisce un campo emergente in cui la moderna metodologia della biologia cellulare e molecolare viene associata allo stato dell’arte della tecnologia per l’imaging non invasivo. Gli obiettivi in questo campo sono quelli di sviluppare tecnologie per monitorare eventi biomolecolari in organismi viventi. L’imaging molecolare consiste in pratica nell’utilizzo di marcatori biologici caratterizzati da un comportamento cinetico nell’organismo vivente in ragione della loro struttura molecolare. I marcatori sono in pratica degli analoghi delle componenti biochimiche dell’organismo con una cinetica nota. La marcatura dei probes è tale da consentire una misura della loro concentrazione locale mediante chemiluminescenza, risonanza magnetica e tomografia di emissione (PET e SPECT). In tal senso, l’imaging molecolare ha la capacità di monitorare diversi meccanismi biologici quali ad esempio il metabolismo del glucosio e degli acidi grassi, la densità recettoriale, la sintesi proteica, la sintesi di acidi nucleici. I principali campi di applicazioni sono attualmente alcune malattie degenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e il campo oncologico in genere [15,16]. In quest’ultimo campo di applicazione l’utilizzo della FDG-PET ha condotto ad una drammatica modificazione della gestione del paziente oncologico in oltre il 37% dei casi [17]. E’ anche opportuno sottolineare che nelle attuali modalità di impiego l’imaging molecolare ha la capacità di rilevare modificazioni molecolari prima che si manifestino modificazioni strutturali/anatomiche del tessuto in esame. Fra i marcatori disponibili per uso umano vi è il fluoromisonidazolo (18-FMISO), una molecola che si accumula nelle cellule in proporzione al grado di ipossia tissutale ed essendo questa marcata con 18-Fluoro radioattivo è possibile la rilevazione quantitativa della sua distribuzione con la PET. Per quanto detto sull’importanza dell’ipossia nella progressione della epatopatia, è ragionevole supporre che questa metodica di imaging molecolare possa svolgervi un importante ruolo diagnostico. <<<