RICERCA ITALIANA     

Interazione con i sistemi biologici di materiali nanoparticolati di nuova sintesi: modelli sperimentali per la stima del rischio per la salute umana.

Università degli Studi di Parma

Abstract

I materiali nanostrutturati (MN) giocano un ruolo chiave nelle applicazioni nanotecnologiche e la loro produzione è destinata ad aumentare in modo esponenziale nei prossimi anni. I MN presentano proprietà fisico-chimiche completamente nuove rispetto ai materiali di partenza. I nanotubi di carbonio (CNT), i nanofili, e i “quantum dots” hanno ricevuto enorme attenzione in quanto elementi base di nuove applicazioni per le biotecnologie e le scienze della vita. Tuttavia, le dimensioni delle nanoparticelle (NP – particelle con diametro inferiore a 100 nm in almeno una dimensione) e le loro caratteristiche di superficie, rendono probabile una interferenza con i processi cellulari, creando preoccupazione per la possibilità di effetti tossici e per possibili rischio per la salute. Le NP sono in grado di entrare nell’organismo attraverso diverse vie di ingresso, principalmente inalatoria e cutanea, ma tendono a penetrare all’interno delle cellule ed a distribuirsi a distanza con maggior efficienza rispetto a particelle di maggiori dimensioni. Questo spiega come mai le NP di elementi metallici od i CNT esercitano effetti tossici e genotossici di gran lunga maggiori rispetto a particelle di dimensioni maggiori a parità di massa. Una delle ipotesi più accreditate per spiegare la tossicità delle NP è l’attivazione di processi ossidativi come conseguenza della produzione di specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto.
In questo progetto, contando anche sulla complementarietà di diversi laboratori con competenze specifiche e sulla partecipazione di ricercatori di differenti discipline (medici del lavoro, tossicologi industriali, biologi, genetisti, fisici), applicheremo tecniche di indagine convenzionali ed avanzate al fine di caratterizzare i meccanismi di tossicità delle NP di nuova sintesi, come i CNT a singola parete o a pareti multiple e le NP di ossidi metallici (principalmente Ti, Co e Pt). Al fine di produrre dati confrontabili e riproducibili, gli stessi MN verranno sintetizzati, caratterizzati e condivisi fra le diverse Unità. Tali NM dovrebbero consentire di individuare e validare una batteria di test in vitro finalizzata alla misura di effetti rappresentativi (inclusa la genotossicità) dell’esposizione ambientale od occupazionale a NP. Verranno utilizzati diversi tipi cellulari: linfociti umani, le linee U937, A549, CaLu3, HUVEC, THP-1, HACAT e le cellule staminali (CD34+) quali modelli rappresentativi delle diverse barriere biologiche o coinvolte nell’immunità. Verrà analizzata la localizzazione e distribuzione intracellulare delle NP. Per avere un quadro completo degli eventuali effetti indotti dalle NP verranno analizzati endpoint quali: la proliferazione cellulare (saggi metabolici quali MTT, XTT, Trypan blue exclusion), l’attivazione di pathways intracellulari legati alla sopravvivenza/apoptosi (tecniche di microarrays applicate a lla via MAPK) e la modulazione di processi ossido/riduttivi (omeostasi del Ca2+ e pH, produzione di ROS). Per far luce sull’attivazione di processi ossidativi verranno eseguiti il test della cometa per la valutazione del danno ossidativo al DNA e l'analisi della permeabilità mitocondriale. La capacità delle NP di attraversare la barriera polmonare verrà analizzata utilizzando un modello di cellule epiteliali posto fra due camere di coltura; le NP da saggiare verranno aggiunte nel compartimento superiore, mentre il loro passaggio attraverso l’epitelio verrà documentato dalla loro presenza/attività nel compartimento inferiore. Un modello in vivo nel ratto consentirà di documentare gli effetti in seguito a passaggio sistemico delle NP inalate sul sistema nervoso autonomo, sulla coagulazione/infiammazione e sull’integrità endoteliale. I risultati degli studi sperimentali, unitamente ad una preliminare misura dell’esposizione occupazionale, contribuiranno ad una miglior caratterizzazione del rischio per la salute dell’uomo e forniranno nuovi metodi per la valutazione della tossicità delle NP. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Enrico Bergamaschi Università degli Studi di PARMA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Partecipano al programma ricercatori di differenti discipline (medici del lavoro, tossicologi occupazionali ed industriali, patologi generali, genetisti, ingegneri fisici) che perseguiranno insieme, in un’ottica interdisciplinare, questi obiettivi generali:
a) chiarire i meccanismi che giustificano la tossicità di nanoparticelle di diverso tipo, quali nanotubi di carbonio e particelle di ossidi metallici, in modo da fondare una solida conoscenza tossicologica su chiare relazioni struttura-effetto derivate dallo studio di effetti biologicamente rilevanti;
b) sviluppare metodi affidabili, validati sperimentalmente, per valutare in vitro la tossicità da nanoparticelle, così da individuare una batteria di test utilizzabili per la stima del rischio per la salute umana in seguito ad esposizione a nanomateriali di nuova sintesi.

Questi due obiettivi generali, strettamente collegati, saranno perseguiti dalle Unità afferenti al progetto attraverso il conseguimento di alcuni risultati intermedi, specifici per Unità singole od associate:
i) la sintesi e la funzionalizzazione chimica di nuove nanoparticelle, per avere a disposizione nuovi elementi strutturali (UO2 e 5), oltre a quelli già impiegati in diverse attività;
ii) l’identificazione dei determinanti strutturali che influenzano la permeabilità transepiteliale delle nanoparticelle attraverso l’epitelio respiratorio (UO1, 2, e 5);
iii) la caratterizzazione degli effetti di tipi diversi di nanoparticelle su alcuni tipi cellulari di rilevanza biologica: cellule epiteliali delle vie respiratorie (UO1 e 5), cellule infiammatorie di origine monocito-macrofagica (UO1 e 4), cellule staminali da sangue di cordone in corso di differenziazione in linfociti T o NK (UO3), cellule endoteliali umane (UO1), cheratinociti umani (UO5), linfociti da sangue periferico (UO5);
iv) l’analisi dei meccanismi alla base dei cambiamenti di sopravvivenza/apoptosi, di proliferazione cellulare, di espressione di geni coinvolti nella risposta infiammatoria e nei meccanismi di stress ossidativo (UO 4);
v) la valutazione dei danni ossidativi al DNA, mediante test di genetica cellulare (Comet e micronucleo) e della capacità antiossidante delle cellule nei confronti di diversi radicali (UO 4 e 5);
vi) la individuazione di parametri di tossicità, ottenuti con modelli in vitro, coerenti con dati tossicologici ottenuti su modelli in vivo (UO1) o ex vivo (UO3 e 5);
vii) l’identificazione dei bersagli subcellulari e molecolari della tossicità da nanoparticelle, anche mediante tecniche di microscopia avanzata (AFM, TEM, SEM. CLSM) (UO1, 4 e 5);
viii) la definizione quantitativa dei livelli di esposizione effettiva a nanomateriali in ambienti di interesse occupazionale (UO2). <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I materiali nanostrutturati (NM) giocano un ruolo chiave nelle applicazioni nanotecnologiche ed il tasso con cui saranno introdotti nel ciclo produttivo è atteso crescere esponenzialmente nei prossimi anni. Lavorando a scala nanodimensionale, è possibile infatti produrre nuovi materiali che hanno proprietà fisico-chimiche completamente rispetto ai materiali di partenza. Queste proprietà innovative sono certamente attribuibili all’elevato rapporto superficie-volume delle nanoparticelle (NP, particelle inferiori a 100 nm in almeno una dimensione) ma anche alle caratteristiche di superficie (reattività, presenza di gruppi funzionali, rivestimenti organici od inorganici), solubilità, forma e stato di aggregazione. Sebbene le potenzialità applicative dei NM siano impressionanti, le loro proprietà innovative suscitano preoccupazioni circa la possibilità che abbiano effetti tossici sui sistemi biologici, data anche la possibilità che la loro grande biodisponibilità favorisca interazioni con diverse cellule e tessuti [1,2].
La maggior parte delle evidenze ottenute sull’apparato respiratorio indicano che le NP esercitano una tossicità superiore a quella evidenziata da particelle di maggiori dimensioni della stessa sostanza a parità di massa [3]. Diversi studi sulla tossicità polmonare delle particelle ultrafini aerodisperse (PUF, il particolato di diametro aerodinamico &lt;100 nm nelle tre dimensioni) [3] prodotte da processi di combustione, indicano che, una volta inalate, queste inducono infiammazione polmonare, stress ossidativo ed effetti sistemici [4-6]. In realtà, le PUF possono superare la barriera respiratoria ed entrare in circolo, esercitando effetti tossici sull’endotelio, come anche su altri tessuti [3, 5-8].
Diverse ricerche documentano conseguenze patologiche di esposizione a PUF anche a carico del sistema cardiovascolare, quali aritmie ed alterazioni della coagulazione. Generalmente queste alterazioni sono state spiegate con la persistente infiammazione polmonare, ma non è escluso neanche un effetto diretto di NP migrate dall’apparato respiratorio in altri tessuti sull’emostasi e sull’integrità cardiovascolare [5]. Dati recenti indicano un coinvolgimento del sistema nervoso autonomo (SNA) in seguito ad inalazione di PUF [9, 10]. L’attivazione di riflessi neurali può alterare il tono vascolare e, in determinate circostanze, contribuire alla instabilità della placca ed allo sviluppo di aritmie cardiache [11].
Gli studi citati si riferiscono alle PUF di origine ambientale, eterogenee per composizione e dimensioni, a non alle NP prodotte a scopo industriale che presentano caratteristiche ben definite sia come composizione che come proprietà di superficie. Nonostante le analogie dimensionali, le NP presenti nell’ambiente e quelle di nuova sintesi possono differire in modo significativo in termini di attività biologica e di proprietà tossicologiche [3]. Infatti, nonostante si possano indicare sotto il termine collettivo di nanoparticelle, ogni tipo di nanomateriale dovrebbe essere considerato individualmente nel momento in cui ne vengono studiate le proprietà tossicologiche.
L’interpretazione dei dati tossicologici su NM di origine industriale è complicata da vari fattori: l’eterogeneità (diversi NM possono avere effetti differenti), le differenti modalità di sintesi, e la presenza di microcontaminanti (la maggior parte delle NP utilizzate nelle indagini tossicologiche non è pura). Ad esempio, le impurezze maggiormente presenti nei campioni di nanotubi in carbonio (NTC) sono di due tipi, carbonacee e metalliche. Queste ultime derivano dai catalizzatori utilizzati durante la produzione e possono essere altamente citotossiche e possono essere caratterizzate da gruppi funzionali che ne alterare l’interazione con le cellule. Attualmente è possibile, tramite l’uso combinato di surfattanti, ultrasonicazione e ultracentrifugazione, isolare le impurezze, caratterizzate da forte fluorescenza, e caratterizzare tramite spettroscopia (assorbimento e fluorescenza), microscopia (microscopio elettronico a trasmissione, TEM e microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione, HRTEM) sia i NTC idrofobici che quelli ossidati [12].
Per questo motivo è necessario usare materiali accuratamente standardizzati e prestare estrema attenzione al tipo di NM utilizzato, soprattutto quando si confrontano studi diversi. Se è vero che i test tossicologici tradizionali si sono mostrati di notevole utilità anche per valutare la tossicità di NP, alcuni metodi potrebbero richiedere modifiche. Potrebbero poi essere necessari approcci metodologici innovative, soprattutto per consentire misure di routine di effetti biologici rappresentativi dopo esposizione a NP di tipo ambientale od occupazionale. In questa prospettiva, attenzione particolare dovrà essere dedicate non solo a discriminare gli effetti di NM diversi, ma anche a valutare con attenzione se il NM sia presentato in fase gassosa, liquida o solida, se l’esposizione avvenga a singole NP od a loro agglomerati, se la superficie del NM sia allo stato nativo o, al contrario, modificata (valga, per esempio, il caso dei NTC funzionalizzati).
I nanotubi di carbonio sono una struttura artificiale non presente in natura. A causa delle loro uniche proprietà chimiche, fisiche, ottiche e magnetiche, i NTC sono ampiamente utilizzati nell’industria ed, in particolare, nei campi delle nanotecnologie, come la nanomedicina e la farmacologia, anche per la loro elevata permeabilità attraverso le membrane plasmatiche. Dato che i NTC sono strutture molecolari innovative e che non c’è esperienza storica sui loro effetti sull’uomo, la necessità di una valutazione accurata di come vengano ad influenzare la salute e l’ambiente è largamente avvertita. Si sa che i NTC sono in grado di reagire con importanti bersagli molecolari, come il DNA [14] e diversi residui aminoacidici presenti in proteine [15, 16]. Proprio queste proprietà hanno suggerito un utilizzo biotecnologico dei NTC, per esempio per veicolare composti in localizzazioni specifiche o per immobilizzare cellule in modo da consentire ulteriori manipolazioni [17] o, ancora, come bio-sensori dopo complessazione con sostanze sensibili al parametro da determinare [18]. Un’ulteriore promettente sviluppo biotecnologico è costituito dalla possibilità di “funzionalizzare” i NTC, preparando nanomateriali complessi o ibridi, nei quali i nanotubi sono legati, covalentemente o non covalentemente, con diverse sostanze bioattive [19]. La possibilità che i NTC, allo stato nativo o dopo funzionalizzazione, reagiscano specificamente con molecole bersaglio e possano quindi interagire con determinate cellule o strutture biologiche, fa intravedere molte possibili applicazioni biotecnologiche o farmaceutiche. Inoltre, è possibile che i NTC di piccole dimensioni abbiano una permeabilità trans-membrana particolarmente elevata, grazie alla loro idrofobicità. La probabile diffusione che i NTC avranno nei prossimi anni rende opportune una attenta analisi dei parametri cellulari dopo l’ingresso, passivo o provocato, di queste NP nelle cellule. I pochi studi dedicati ai NTC negli ultimi anni si sono per lo più focalizzati sugli effetti tossici evidenziati dalle cellule epiteliali, in quanto sono proprio cellule di questo tipo a costituire la porta di ingresso delle NP. I risultati hanno indicato una lieve tossicità su cellule renali, cheratinociti e linfociti umani [20-22], che mostrerebbero un aumentato tasso di apoptosi, specie in presenza di gruppi carbossilici superficiali [22]. NTC a parete singola, instillati nelle vie aeree ad una concentrazione di 1-5 mg/kg, hanno portato allo sviluppo di granulomi polmonari, suggerendo un’interazione tra NP e cellule infiammatorie monocito-macrofagiche [23, 24]. I NTC possono tuttavia avere effetti meno diretti, ad esempio suscitando risposte da stress a significato protettivo (quali la attivazione di NF-kB [25]) o l’induzione di una risposta heat shock, o alterazioni metabolico-genetiche che, senza compromettere direttamente la vitalità cellulare, alterino la funzione delle cellule, il loro equilibrio redox o la progressione del ciclo cellulare [26].
Un altro tipo di NP particolarmente interessante è rappresentato dai NM contenenti metalli. Attualmente, gli ossidi metallici, in particolari quelli di titanio (TiO2), alluminio (Al2O3), e ferro (Fe3O4, Fe2O3), occupano il primo posto in ordine di importanza economica tra le NP inorganiche. Mentre gli ossidi di ferro hanno una storia di utilizzo industriale lunga mezzo secolo, gli altri ossidi sono stati immessi sul mercato molto più recentemente. Le principali applicazioni sono nei campi dell’elettronica, della farmacia, della cosmetica e della catalisi. Gli ossidi di titanio e di zinco sono sempre più comuni per l’assorbimento di radiazioni UV nelle creme solari. Tuttavia, è bene ricordare che assorbite le radiazioni emettono radicali liberi che possono danneggiare il DNA; inoltre, esse possono penetrare a molta maggiore profondità che le microparticelle ed interferire con il sistema immunitario [27]. Sebbene la tossicologia dei metalli possa ormai considerarsi una scienza matura, e esposizioni ambientali od occupazionali siano state associate con diverse malattie, i meccanismi molecolari alla base della cancerogenesi da metalli non ancora del tutto chiariti. La formazione di radicali liberi, sia ROS che RNS, catalizzata da metalli, potrebbe certamente causare diverse modificazioni del DNA, aumentare la perossidazione lipidica ed indurre alterazioni all’omeostasi del calcio ed all’equilibrio redox [28]. Evidenze sperimentali sempre più numerose indicano che i ROS generati grazie ai metalli possano giocare un ruolo importante nella eziologia delle malattie neurodegenerative e del cancro. Molti studi si sono focalizzati sui rapporti tra tossicità indotta da metalli e cancerogenesi, enfatizzando il ruolo dei metalli nella generazione di ROS e RNS nei sistemi biologici e l’importanza biologica di questo effetto [29-31]. Gli effetti di NP contenenti metalli od ossidi metallici sono stati studiati nelle cellule BRL 3A analizzando vitalità e morfologia cellulare , la riduzione dei livelli di glutatione e la formazione di ROS dopo 24 ore di trattamento [32]. I risultati indicano chiaramente una riduzione significativa dell’efficienza mitocondriale dopo il trattamento con AgNP (5-50 mg/ml), mentre Al, Fe3O4, MoO3 and TiO2 (10-50 µg/ml) non avevano effetto. Il trattamento con AgNP ad alte dosi modificava anche le dimensioni cellulari e la forma delle cellule, che diventava molto irregolare. Inoltre le Ag NP causavano una significativa deplezione di glutatione e stimolavano la formazione di ROS, confermando che lo stress ossidativi rappresenta un importante meccanismo della tossicità esercitata da questo tipo di NP.
Dalle informazioni presentate è evidente che diversi tipi cellulari o tessuti possono costituire bersagli degli effetti tossici di NM di diversa composizione. Per questa ragione, oltre allo stress ossidativi ed alla induzione di una risposta infiammatoria, è importante considerare che l’esposizione a NM può causare anche altri tipi di danno, come la denaturazione di proteine, danno di membrana od al DNA [14-16, 28-32] ed una aumentata reattività immunitaria [33].
In particolare, gli effetti sul sistema immunitario potrebbero rivestire una notevole importanza: essi possono ora essere valutati con un metodo innovativo basato su cellule staminali umane che differenziano in cellule del sistema immunitario [34, 35]. Questo modello rappresenta un mezzo affidabile ed innovativo per studiare non solo la cancerogenesi ma anche la immunotossicità. Il modello offre inoltre l’opportunità di valutare in vitro la tossicità da NP durante il processo di differenziamento cellulare, una condizione che richiama quella osservata “in vivo”. Da questo punto, le cellule staminali, grazie alla loro multipotenza e plasticità, offrono la opportunità di studiare effetti tossici di NP differenti su diversi possibili esiti differenziativi. Infatti, le cellule immunitarie che derivano dal processo differenziativi utilizzato da questo modello vanno dai linfociti T CD8+, importanti nella difesa contro le infezioni virali, ai linfociti NK, importanti nell’immunità antitumorale.
Non è stato indagato specificamente il meccanismo col quale avverrebbe il passaggio delle NP di derivazione industriale, caratterizzate da differenti proprietà fisico-chimiche, attraverso l’epitelio respiratorio, la prima fondamentale barriera che i materiali di dimensioni nanometriche incontrano e devono attraversare per esercitare eventuali effetti tossici su altre cellule e sistemi. Benché si ritenga che le NP possano efficacemente attraversare le membrane biologiche in quanto dotate di elevata permeabilità, tale proprietà non dovrebbe essere assunta di per se come indice di tossicità in assenza di evidenze sperimentali [1, 2]. La capacità di attraversare le membrane e superare le giunzioni intercellulari può contribuire ad aumentare la concentrazione di sostanze chimicamente reattive, non inerti e dotate di biopersistenza all’interno dell’organismo. Il rapido accesso ai compartimenti intracellulari e l’assenza di un evidente sequestro all’interno di vacuoli fagocitari [36] può, inoltre, aumentare le potenzialità tossiche delle nanostrutture.
Nella stima dei possibili effetti sulla salute delle NP inalate, la valutazione dei fenomeni che regolano il passaggio attraverso l’epitelio respiratorio verso il circolo sistemico rappresenta una problematica di rilievo. Ciononostante, la letteratura è ancora limitata e le conclusioni contrastanti [6, 36, 37]. Alcuni studi [37-39] hanno documentato un passaggio extrapolmonare di particelle ultrafini in seguito a somministrazione intra-tracheale o inalazione. Tuttavia, la quantità di particelle che passano nel sangue o giungono a livello degli organi extra-polmonari varia notevolmente da uno studio all’altro. Studi morfologici hanno messo in evidenza come NP di polistirene inalate vengano trasportate nello spazio capillare polmonare, presumibilmente mediante trans-citosi [40]. L’opinione prevalente è che esista una relazione diretta tra l’area superficiale complessiva, la capacità di generare ROS e gli effetti infiammatori delle NP nel polmone. Gli studi preliminari disponibili portano a considerare lo stress ossidativo ROS-dipendente il fattore più importante della tossicità di NP dopo esposizione per inalazione. Sarebbe poi importante conoscere come e in che misura la flogosi polmonare sia in grado di modulare il trasferimento delle NP a livello extrapolmonare ed i loro effetti sistemici. La flogosi polmonare e sistemica indotta dalle NP, l’aterosclerosi precoce e l’alterazione della funzione autonomica cardiaca potrebbero far parte di un unico meccanismo fisio-patogenetico che lega l’inquinamento ambientale con la mortalità per cause cardiovascolari. È stato messo in evidenza come le particelle depositate negli alveoli inducano la produzione di citochine da parte dei macrofagi alveolari e delle cellule epiteliali che porta al reclutamento delle cellule infiammatorie. Nemmar et al [41, 42] hanno messo in evidenza il ruolo delle cariche superficiali delle NP somministrate. Le NP di polistirene (60 nm) caricate positivamente presentavano una maggior tendenza a produrre effetti pro-trombotici rispetto a NP neutre, determinando l’attivazione piastrinica. È ipotizzabile che l’effetto determinato da particelle di minori dimensioni sia dovuto in modo specifico al loro passaggio in circolo in seguito ad inalazione. Anche per chiarire questo aspetto, sarebbe necessario studiare sia il trasporto delle NP attraverso gli epiteli che i fattori che regolano il loro trasferimento, quali la dose, le dimensioni, la composizione chimica e la chimica di superficie, come anche la sequenza temporale. <<<