RICERCA ITALIANA     

Somatostatina e peptidi correlati: distribuzione, effetti biologici e caratterizzazione di modelli transgenici

Università degli Studi di Torino

Abstract

Questo progetto deriva dalla collaborazione di quattro diverse unità di ricerca con esperienza specifica nel campo della morfologia cellulare e strutturale, della fisiologia, dell'anatomia patologica e istopatologia della farmacologia e endocrinologia. Con tale approccio multidisciplinare ci poniamo quale obiettivo principale quello di chiarire alcuni meccanismi cellulari e molecolari alla base degli effetti biologici della somatostatina e di due peptidi ad essa correlati (cortisatina - grelina) utilizzando modelli sperimentali diversi in vitro e in vivo e tessuti umani.
I peptidi oggetto di questo studio sono un gruppo di peptidi biologicamente attivi con effetti pleiotropici a livello periferico (sistema neuroendocrino) e centrale, molti dei quali di potenziale interesse applicativo.
Verranno analizzati:
- la distribuzione comparativa nel sistema neuroendocrino su topi KO, materiale umano fetale e adulto, tumori di origine nervosa e neuroendocrini e effetti regolatori sulla proliferazione e l'apoptosi in cellule nervose, endocrine o ematologiche (e corrispondenti neoplasie).
- il profilo endocrino-metabolico e valutazione delle risposte fisio-patologiche e farmacologiche in condizioni flogistiche e di iperalgesia somatica e viscerale su topi KO
- la modulazione a breve termine dell’attività sinaptica eccitatoria (glutamatergica) nelle lamine superficiali delle corna dorsali del midollo spinale con particolare riferimento alla neurotrasmissione dolorifica in condizioni di dolore acuto e cronico.
- la modulazione a medio/lungo termine dell'attività sinaptica inibitoria GABAergica) nelle lamine superficiali delle corna dorsali del midollo spinale con particolare riferimento ai meccanismi di mantenimento del tono inibitorio nella sostanza gelatinosa.
Per sviluppare il nostro progetto useremo tecniche istologiche, immunocitochimiche a livello ottico ed elettronico, elettrofisiologiche, farmacologiche e di biologia molecolare, mettendo in comune le competenze specifiche dei singoli gruppi coinvolti. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Adalberto Merighi Università degli Studi di TORINO

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo principale di questo progetto è chiare i meccanismi cellulari e molecolari alla base di alcuni effetti biologici della somatostatina e di due peptidi ad essa correlati (cortisatina - grelina) con un approccio multidisciplinare applicato a diversi modelli sperimentali in vitro e in vivo. Ciascuna delle quattro unità coinvolte lavorerà in collegamento con le altre mettendo in atto una serie di scambi tecnologici e conoscenze specifiche e si occuperà in maniera principale di indagare su uno o più aspetti della biologia di questo gruppo di peptidi biologicamente attivi come di seguito indicato:

- Distribuzione comparativa nel sistema neuroendocrino su topi KO, materiale umano fetale e adulto, tumori di origine nervosa e neuroendocrini e effetti regolatori sulla proliferazione e l'apoptosi in cellule nervose, endocrine o ematologiche (e corrispondenti neoplasie).
- Analisi del profilo endocrino-metabolico e valutazione delle risposte fisio-patologiche e farmacologiche in condizioni flogistiche e di iperalgesia somatica e viscerale su topi KO
- Modulazione a breve termine dell’attività sinaptica eccitatoria (glutamatergica) nelle lamine superficiali delle corna dorsali del midollo spinale con particolare riferimento alla neurotrasmissione dolorifica in condizioni di dolore acuto e cronico.
- Modulazione a medio/lungo termine dell'attività sinaptica inibitoria
(GABAergica) nelle lamine superficiali delle corna dorsali del midollo spinale con particolare riferimento ai meccanismi di mantenimento del tono inibitorio nella sostanza gelatinosa.

Per sviluppare il nostro progetto useremo tecniche istologiche, immunocitochimiche a livello ottico ed elettronico, elettrofisiologiche, farmacologiche e di biologia molecolare, per quanto possibile in combinazione fra loro, sfruttando in questo modo le interazioni previste fra le singole unità che partecipano al progetto.
I modelli animali e in vitro utilizzati da ciascun gruppo sono già stati ampiamente caratterizzati in studi precedenti e appaiono particolarmente adatti agli scopi che ci prefiggiamo. In particolare i modelli in vitro e lo studio di animali KO potranno rivelarsi utili per chiarire alcuni effetti biologici della somatostatina e dei peptidi ad essa correlati in condizioni sperimentali controllate e semplificate utili allo studio di differenti tipi di disordini/patologie che interessano gli organi endocrini e il SNC. Infine riteniamo opportuno sottolineare che lo studio di modelli animali diversi fra loro potrebbe rivelarsi molto utile da un punto di vista comparativo e contribuire all’ottenimento di un quadro completo della distribuzione della somatostatina, della cortistatina, della grelina e dei loro recettori in tessuti diversi e fornire importanti dati funzionali utili alla comprensione della biologia di questi peptidi neuroendocrini.


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Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La somatostatina: un peptide pleiotropico
I peptidi biologicamente attivi, le citochine e i fattori trofici rappresentano i principali gruppi di messaggeri chimici. I peptidi biologicamente sono una famiglia di ormoni e neuromediatori di natura peptidica. Le citochine sono mediatori della comunicazione intercellulare nel sistema immunitario mentre i fattori trofici sono segnali intercellulari che controllano la replicazione e la differenziazione cellulare principalmente durante lo sviluppo embrionale. La distinzione fra queste tre classi di molecole è attualmente di tipo storico o didattico, piuttosto che funzionale. In effetti non esiste una chiara distinzione tra queste tre famiglie di molecole e, fatto ancora più importante, lo stesso peptide può appartenere funzionalmente a ognuna di esse, essendo rilasciato da un numero estremamente elevato di tipi cellulari diversi e, pertanto, svolgendo effetti pleiotropici [1].
Benché esistano lievi differenze nel modo i cui i diversi ligandi attivano i rispettivi recettori, il tipo finale di risposta viene elaborato secondo vie metaboliche comuni, che portano all’attivazione di tipi differenti di proteine chinasi. Nel caso dei peptidi biologicamente attivi i recettori sono accoppiati a proteine G (G-protein-coupled receptors = GPCRs). In ogni caso la fosforilazione innescata dalle proteine chinasi esita in modificazioni funzionali di una serie di proteine effettrici (canali ionici, enzimi, fattori di trascrizione) con conseguenti risposte cellulari adeguate.
La famiglia della somatostatina (fattore inibente il rilascio dell’ormone somatotropo = SRIF) comprende alcuni peptidi che originano da differenti modificazioni post-traduzionali del precursore della prepro-SRIF. Al momento sono state identificate due isoforme biologicamente attive: quella a quattordici aminoacidi (SRIF-14) e la forma estesa a diciotto aminoacidi a livello aminoterminale (SRIF-28) che comprende la SRIF-14. Sia SRIF-14 che SRIF-28 sono presenti in tessuti non nervosi e nel sistema nervoso periferico e centrale (SNC), ma l’isoforma predominante è SRIF-14. La proporzione relativa di espressione delle due isoforme varia nei diversi tessuti, tuttavia SRIF-14 e SRIF-28 presentano effetti biologici sovrapponibili.
Questi comprendono l’inibizione dell’attività secernente di un gran numero di ghiandole endocrine e esocrine. SRIF inibisce la secrezione di diversi ormoni ipofisari (ormone della crescita = GH, prolattina, tireotropina), gastrointestinali (colecistochinina, peptide inibitore della secrezione gastrica, gastrina, motilina, neurotensina, secretina) e pancreatici (glucagone, insulina, polipeptide pancreatico). SRIF inibisce la secrezione di amilasi da parte delle ghiandole salivari, di acido cloridrico e pepsinogeno da parte della muscosa gastrica, di enzimi pancreatici e di bicarbonato da parte degli acini pancreatici, della bile da parte del fegato. SRIF regola anche l’assorbimento e la motilità gastro-intestinale.
Nel SNC, SRIF agisce come tale da neurotrasmettitore in una serie ben distinta e anatomicamente caratterizzata di vie nervose, ma anche come neuromodulatore, dal momento che è in grado di regolare il rilascio di altri neurotrasmettitori quali la serotonina, l’acetilcolina e il glutamato, e infine come neuroormone, in quanto inibisce il rilascio del fattore rilasciante il GH (GHRH). Inoltre SRIF è un potente immunomodulatore e agisce sulle cellule del sistema immunitario regolando la secrezione di IgG da parte dei linfociti B attivati e la produzione di citochine da parte dei linfociti T e dei macrofagi. Anche la risposta a diversi antigeni/mitogeni di molte cellule del sistema immunitario è regolata da SRIF [2].

Peptidi correlati alla SRIF
Un altro peptide che pur non appartenendo in senso stretto alla famiglia della SRIF ne condivide una sequenza di 11 aminoacidi è la cortistatina (CST). La forma biologicamente attiva di CST è una tetradecapeptide (CST-14) nei roditori e un eptadecapetide (CST-17) nell’uomo. CST-17 corrisponde alla CST-14 dei roditori con un estensione di tre aminoacidi a livello N-terminale. Al contrario di SRIF, CST sembra essere principalmente distribuita nel SNC e, più precisamente, è localizzata negli interneuroni inibitori della corteccia cerebrale e dell’ippocampo. Gli effetti biologici della CST comprendono la regolazione della fase di transizione sonno-veglia, il consolidamento della memoria e breve e lungo temine, e il controllo dell’attività locomotoria . Tra i tessuti periferici studiati nell’uomo, CST è espressa nel rene e nel testicolo [3], ma anche nel pancreas [4] e in cellule di carcinoma epatico [5]. Nel sistem immunitario, CST è stata ritrovata nei linfociti T e B [6], nei monociti e nelle cellule da essi derivate quali i macrofagi e le cellule dendritiche [7].
La grelina è un altro peptide di recente scoperta correlato a SRIF. Essa è stata originariamente purificata dallo stomaco di ratto [8]. Il termine grelina è basato sulla parola “ghre,” una radice che nelle lingue Proto-Indo-Europee significa “crescita” e sta ad indicare la capacità di stimolare il rilascio di GH. La grelina è un peptide di 28 aminoacidi nel quale la serina in posizione 3 (Ser3) è n-octanilata. Tale modificazione è essenziale all’attività biologica. La grelina di ratto e quella umana differiscono fra loro per soltanto due aminoacidi [9]. Nello stomaco di ratto è stato purificato un secondo tipo di grelina detta grelina des-Gln14 [8]. Ad eccezione della delezione della Gln14, grelina des-Gln14 è identica alla grelina, anche per quanto riguarda la n-octanilazione, e presenta la stessa attività della grelina. In tutti i vertebrati la grelina viene principalmente prodotta nello stomaco [10], dove le cellule a grelina sono più abbondanti nel fondo piuttosto che nella regione pilorica [11-13]. Studi di ibridazione in sito e immunocitochimici indicano che le cellule a grelina sono un tipo di cellule endocrine distinto dalle altre cellule endocrine della mucosa gastrica. Sono state evidenziate cellule immunoreattive per la grelina anche nel duodeno, digiuno, ileo e colon [11,14,15], in numero progressivamente inferiore. Come per lo stomaco, le principali forme di grelina e livello intestinale solo la n-octanoil grelina e la deacil grelina [11]. Anche il pancreas è una fonte di grelina endogena. Studi combinati di HPLC e RIA hanno mostrato l’esistenza di grelina e grelina deacetilata nel pancreas di ratto [16]. Tuttavia è tuttora oggetto di dibattito quale sia il tipo cellulare del pancreas che produce il peptide [16-19].
La grelina è stata localizzata anche nel nucleo arcuato dell’ipotalamo, un importante gruppo di neuroni che controlla l’appetito [9,20]. Inoltre uno studi recente ha descritto la presenza di grelina in neuroni dell’ipotalamo adiacenti al terzo ventricolo e posti tra i nuclei dorsale, ventrale, paraventricolare e arcuate dell’ipotalamo [21]. Questi neuroni a grelina inviano i loro assoni a neuroni contenenti il neuropeptide Y (NPY) e la proteina correlata al gene agouti (AgRP) e sono in grado di promuovere il rilascio di queste due sostanze orexigeniche. Pertanto queste osservazioni indicano un coinvolgimento centrale della grelina nel controllo dell’assunzione di alimento.
Recentemente attraverso uno studio combinato di tipo elettrofisiologico e immunocitochimico è stato dimostrato che: 1. La grelina somministrata sia per via sistemica che per via centrale esercita una potente attività fisiologica di stimolazione del rilascio di GH e che tale attività è in tempo-dipendente; 2. La grelina è un antagonista funzionale di SRIF, ma la sua attività di rilascio di GH a livello ipofisario non dipende dall’inibizione del rilascio di SRIF endogena; 3. SRIF antagonizza l’azione di grelina a livello ipofisario; e 4. La risposta del GH alla stimolazione da parte di grelina in vivo necessita della presenza di un sistema GHRH endogeno funzionante [22].

Recettori della SRIF e dei peptidi ad essa correlati
Studi biomolecolari volti a caratterizzare i recettori di SRIF nei roditori e nell’uomo hanno dimostrato che cinque diversi recettori sono alla base degli effetti biologici del peptide. Essi sono codificati da cinque diversi geni che sono altamente conservati fra specie diverse e all’interno delle singole specie. I prodotti di espressione di questi geni sono monomeri composti da 391 (sst1), 369 (sst2), 418 (sst3), 388 (sst4) e 383 (sst5) aminoacidi. Tutti e cinque i recettori SRIF sono stati identificati nel SNC e in diverse ghiandole endocrine e esocrine. L’espressione degli mRNA per i cinque recettori è sovrapponibile, ma la combinazione fra i livelli di espressione dei singoli recettori (profilo recettoriale) è specifico per i diversi tessuti e per diversi tipi cellulari. Più precisamente nei roditori sono stati localizzati tutti e cinque gli mRNA per i diversi recettori SRIF nella corteccia cerebrale, striato, ippocampo, amigdala, bulbo olfattivo e area preottica [23,24]. Tra questi, sst1 e sst2 sono i più abbondanti. I trascritti per tutti e cinque i recettori sono stati evidenziati nell’ipofisi di ratto ma non in quella umana, dove il messaggero per sst4 non è espresso. Il pancreas, lo stomaco, il duodeno, il digiuno e l’ileo contengono trascritti per tutti e cinque i recettori sia nell’uomo che nel ratto. Altri organi e tessuti esprimono i diversi recettori in modo più specifico. Ad esempio il surrene e il testicolo di ratto contengono solo mRNA per sst1–sst3, mentre esistono livelli elevati di espresione di sst3 nel fegato e nella milza e di sst4 nel polmone, nel cuore e nella placenta. Messaggeri per sst2A and sst3 sono stati descritti in diversi tipi di cellule del sistema immunitario, tra cui i macrofagi attivati e i linfociti T e B [2,25,26]
Sia SRIF-14 che SRIF-28 riconoscono tutti e cinque i recettori con affinità simile.
Tuttavia è possibile suddividere i recettori in due sottofamiglie sulla base della loro affinità per gli agonisti utilizzati comunemente [27]. Tutti i recettori SRIF sono GPCRs, tuttavia l’attivazione delle proteine G è accoppiata a diverse vie intracellulari.
E’ tuttora oggetto di studio l’esistenza o meno di un coinvolgimento selettivo dei cinque recettori SRIF in specifiche risposte mediate dal peptide. Tuttavia alcune funzioni specifiche possono essere attribuite selettivamente a ciascuno dei cinque recettori finora identificati. La gran parte delle informazioni di questo tipo è stata ottenuta tramite studi su topi knock-out (KO) nei quali sono state prodotte delezioni specifiche dei singoli geni codificanti per i diversi tipi recettoriali. Gli studi sui topi KO per il gene sst2 hanno dimostrato che questo recettore interviene in modo specifico in alcuni effetti centrali del peptide quali il controllo di precisione dei movimenti motori [28], la modulazione dell’apprendimento spaziale [29], l’attività di esplorazione e la reattività emozionale [30]. Gli effetti periferici mediati in maniera specifica da sst2 riguarderebbero l’inibizione della secrezione gastrica [31,32]. L’analisi del fenotipo del KO ha dimostrato che questo recettore media l’inibizione della secrezione di insulina e regola l’omeostasi del glucoso [33] in relazione all’età [34].
Alcuni effetti fisiologici dei recettori di SRIF che inizialmente erano stati ipotizzati sulla base di studi puramente istologici sono poi stati confermati dagli esperimenti eseguiti su animali KO. Un esempio tipico è rappresentato dal coinvolgimento del recettore sst5 nella regolazione dei livelli di insulina. Il fenomeno della co-regolazione dei diversi recettori durante lo sviluppo ha tuttavia reso particolarmente difficile l’analisi dei fenotipi degli animali KO e ha rafforzato l’idea che una stessa funzione di SRIF potesse essere mediata da più recettori. Ad esempio il coinvolgimento del recettore sst1 nella regolazione della secrezione di GH che è stato dimostrato in topi con delezione del gene sst1 [35] dovrà oggi essere riconsiderato sulla base della co-regolazione nell’espressione di sst1 e sst2 [36], soprattutto perché sst2 è coinvolto nella regolazione della secrezione di GH sia nell’ipofisi dei roditori [37] che umana [38].
La capacità di SRIF di regolare in senso negativo la proliferazione cellulare attraverso meccanismi di tipo diretto e indiretto è stata ampiamente dimostrata. Le azioni di tipo indiretto comprendono l’inibizione della secrezione di ormoni stimolanti la crescita e di fattori trofici in grado di agire su molteplici tipi cellulari differenti. Per esempio, SRIF è in grado di inibire l’espressione del fattore di crescita insulino-simile di tipo I (IGF-I) a livello tissutale e di ridurne la concentrazione ematica. Su tali basi il peptide è stato utilizzato per potenziare gli effetti antitumorali del tamoxifen nel trattamento del carcinoma della mammella [39]. Tuttavia occorre notare che studi clinici recenti (fase III) hanno dimostrato l’inefficacia di SRIF sotto tale profilo [40]. Nondimeno la capacità di SRIF di inibire l’angiogenesi è di potenziale interesse clinico nel controllo indiretto della crescita delle cellule tumorali [41,42]. In vitro è stata dimostrata la capacità di SRIF di regolare il numero di cellule sia attraverso l’inibizione della replicazione che attraverso l’attivazione del programma apoptotico, attraverso esperimenti di transfezione con i recettori sst1, sst2 o sst5 [43,44].
La cortistatina è in grado di legare ad alta affinità tutti e cinque i sottotipi recettoriali di SRIF e potrebbe avere un ruolo come ligando endogeno del sst2 nel sistema immunitario [45,46]. Tuttavia finora non è stato possibile dimostrare che la cortistatina sia effettivamente in grado di legare in vivo i recettori SRIF. Recentemente è stato suggerito che il recettore orfano MrgX2 possa essere un recettore per la cortistatina [47]. Una ricerca sulla banca dati BLAST effettuata utilizzando la sequenza del MrgX2 umano a rivelato tuttavia soltanto il 26% di omologia con il recettore sst5.
Ad oggi sono stati isolati i cDNA per due distinti recettori per la grelina (GHS-R) [48]. Il primo, GHS-R di tipo 1a, codifica un GPCR con proprietà di legame compatibili con una sua funzione di recettore. Il tipo 1b è una forma troncata a livello C-terminale e quindi è farmacologicamente inattivo. GHS-R di tipo 1a è ben conservato fra i vertebrati [49-51].
Il suo mRNA è espresso principalmente nei nuclei arcuato (ARC) e ventromediale (VMN) e nell’ippocampo [48,52,53]. E’ stato anche evidenziato in numerosi nuclei ipotalamici, nel giro dentato e nelle regioni CA2 e CA3 dell’ippocampo, nella sostanza nera, nell’area tegmentale ventrale e nei nuclei dorsali e mediani del rafe. La presenza di grelina e del suo recettore nell’ippocampo [52,54], un’area dell’encefalo, associata all’apprendimento e alla memoria, suggerisce che la grelina partecipi a tali funzioni cerebrali superiori.
L’mRNA per GHS-R di tipo 1a è stato dimostrato anche a livello ipofisario. Studi con RT-PCR ne hanno ulteriormente mostrato l’espressione in diversi organi e tessuti periferici, tra cui il cuore, il polmone, il fegato, il rene, il pancreas, lo stomaco, l’intestino, il tessuto adiposo e le cellule del sistema immunitario [52,55-57], suggerendo che la grelina svolga molteplici funzioni in tali localizzazioni [58].
Le vie intracellulari di trasduzione del segnale che seguono l’attivazione di GHS-R tipo 1a sono state studiate in una linea di epatoma responsiva alla grelina [59]. Il peptide sovraregola una serie di attività che sono anche potenziate dall’insulina, tra cui la fosforilazione del substrato di tipo 1 del recettore dell’insulina (IRS-1), l’associazione della proteina legata ai fattori trofici di tipo 2, una molecola adattatrice, con IRS-1 e l’attività della proteina chinasi attivata dai mitogeni (MAP kinase). <<<