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PROGRAMMA DI RICERCA

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Programmi di ricerca simili:
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Bibliografia
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Parole Chiave
BOVINO, GENETICA, RIPRODUZIONE, MHC, MITOCONDRIO, GENE CANDIDATO, SNP

Approccio molecolare e statistico allo studio della genetica della fertilità nel bovino da latte

Università degli Studi della Tuscia
Abstract
La riproduzione è uno dei punti fondamentali da prendere in considerazione per una zootecnia di successo. Considerevoli avanzamenti sono stati ottenuti nelle tecniche riproduttive, che oggi consentono il clonaggio, il sessaggio dello sperma, la transgenesi. Tuttavia risultati nella genetica della riproduzione sono significativamente minori. Nostro scopo è di condurre uno studio abbastanza vasto sulla genetica della riproduzione nei bovini, principalmente da latte, nei quali il problema è particolarmente significativo.
Gli argomenti che si intende sviluppare riguardano 1) l'interazione maschio-femmina con l'accertamento della compatibilità dei riproduttori con i. modelli statistici che tengano conto della loro interazione;ii. esaminando il loro aplotipo nella regione del MHC; 2) aspetti della riproduzione nel maschio ed in particolare la capacità fecondante del maschio i. in base al genotipo a geni candidati e ii. in base alla sequenza dei geni del DNA mitocondriale.
Saranno utilizzate tecniche statistiche recenti (regressione logistica, metodi maximum likelihood e bayesiani con test di confidenza empirici, come bootstrap e permutazioni) e si sfrutteranno le contemporanee acquisizioni di genomica molecolare come il sequenziamento completo del genoma bovino e il progetto HapMap per la scoperta di Single Nucleotide Polymorphisms in cui alcune unità sono coinvolte. Il progetto prevede la stretta collaborazione con le principali Associazioni Allevatori di bovini da latte (ANAFI, ANARB), da carne (ANABIC) e di Centri Tori. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
Alessio Valentini Università degli Studi della TUSCIA
Obiettivo del Programma di Ricerca
La riproduzione è uno dei punti fondamentali da prendere in considerazione per una zootecnia di successo. Considerevoli avanzamenti sono stati ottenuti nelle tecniche riproduttive, che oggi consentono il clonaggio, il sessaggio dello sperma, la transgenesi. Tuttavia risultati nella genetica della riproduzione sono significativamente minori. Nostro scopo è di condurre uno studio abbastanza vasto sulla genetica della riproduzione nei bovini da latte, nei quali il problema è particolarmente significativo, usando strumenti e tecniche resi oggi disponibili da iniziative internazionali, come il sequenziamento completo del genoma bovino, il progetto HapMap e simili. La proposta si avvale della collaborazione delle principali associazioni allevatori di bovini da latte in Italia (Frisona e Bruna), il cui personale partecipa direttamente al progetto.
Gli obiettivi specifici riguardano:
Interazione maschio-femmina
- Accertamento della compatibilità dei riproduttori con modelli statistici che tengano conto della loro interazione
- Accertamento della compatibilità dei riproduttori esaminando il loro aplotipo nella regione del MHC

Riproduzione nel maschio
- capacità fecondante del maschio in base al genotipo a geni candidati trovati coinvolti nella riproduzione in specie modello
- caratteristiche del seme in base alla sequenza dei geni del DNA mitocondriale <<<
Durata
24 mesi
Base di partenza scientifica nazionale o internazionale
Interazione maschio-femmina
È largamente noto che le vacche da latte ad alta produzione di oggi sono meno fertili delle vacche di 10 o 20 anni fa. Questo è stato messo in evidenza in molte nazioni in modo indipendente, come in Irlanda (Buckley et al 2003), Stati Uniti (Lucy 2001), Nuova Zelanda (Xu &amp; Burton 2000), Olanda (Veerkamp et al 2001), Regno Unito (Esslemont &amp; Kossaibati 2000) solo per citare alcuni casi. Generalmente gli andamenti sono simili a quelli riportati in figura 1, che mostra i dati provenienti daidiversi Stati USA (De Vries 2004).

Figura 1. Andamento del tasso di fecondità in diversi Stati USA dal 1976 al 1999.

Nei bovini da latte la bassa fertilità rappresenta una delle principali cause di eliminazione dall’allevamento e riguarda il 36% dei casi, dei quali circa il 71% sono relative a non concepimento o a non instaurazione della gravidanza. Il tasso di concepimento al primo intervento fecondativo nella Frisona Italiana è passato da 32% nel 1990 a 21% nel 2000 (Biffani e coll., 2005). La fertilità è quindi una problematica di attualità perché i rapidi incrementi produttivi degli ultimi decenni hanno ridotto la permanenza in allevamento delle bovine. Il costo di produzione di una manza è oggi circa 1300/1400 Euro. Tale costo, per le bovine di razza Frisona, viene ripagato in circa 1.8-2.2 lattazioni lasciando un margine ridotto di guadagno all’allevatore a causa di una lunghezza media della carriera produttiva di circa 2.3-2.8 lattazioni in totale.
Migliorare la fertilità delle popolazioni bovine da latte sia da un punto di vista genetico che gestionale è oggi diventato un imperativo tanto che numerosi Paesi hanno inserito nei loro indici di selezione i caratteri di fertilità, sull’esempio dei Paesi Scandinavi.
Il declino nella fertilità è di grande preoccupazione anche dal punto di vista etico. . Tuttavia interventi terapeutici regolari per far fronte all'infertilità saranno generalmente inaccettabili in tutti i futuri sistemi zootecnici.
Molti interventi sono stati previsti per aumentare il successo riproduttivo dal punto di vista ambientale e molti di loro sono stati implementati nel "Piano Ipofertilità" a partire dall'inizio degli anni 80 (Nardone 1985). Tuttavia dal punto di vista della selezione per i parametri di riproduzione si sono ottenuti risultati molto scarsi a livello mondiale. Un riesame abbastanza recente dei parametri riproduttivi conferma la loro bassa ereditabilità (tipicamente &lt;0.05; Pryce et al. 1997). Ciò nonostante alcune associazioni di allevatori hanno iniziato a calcolare i valori genetici per i caratteri e riproduttivi(Biffani et al 2005) considerando questi caratteri così importanti che anche un piccolo progresso genetico può essere di beneficio per l'impresa zootecnica. Tuttavia i caratteri riproduttivi di fatto mostrano correlazioni genetiche piuttosto alte fra loro (Andersen-Ranberg et al 2005). Ciò può essere spiegato dal fatto che una base genetica esiste pur con una grande proporzione di varianza attribuita all'ambiente, ma anche dal fatto che i modelli statistici usati per stimare i parametri non sono appropriati. Infatti molti modelli sono lineari e non tengono conto delle interazioni o dei modi sbilanciati di ereditarietà (ad es. imprinting, Swales &amp; Spears 2005). Oggi sta aumentando la consapevolezza che questi modelli non lineari di ereditarietà sono particolarmente frequenti nei primi stadi di vita (Beechey et al. 2005)
Uno dei più importanti complessi di geni coinvolti nella riproduzione è il Complesso Maggiore di Istocompatibilità (MHC) dato che nella maggior parte dei mammiferi il feto allogenico deve svilupparsi entro l'utero della madre. Conseguentemente, il grado di accettazione immunologico della madre per il feto è di vitale importanza per il successo riproduttivo. Nella maggior parte dei mammiferi, la tolleranza dell'innesto del feto sembra che coinvolga sia la mancanza di espressione del MHC a livello delle cellule del trofoblasto, che coprono l'esterno della placenta, come pure nel mantenimento di uno stato di quiescenza immunosoppressivo dell'utero. I bovini sono inusuali a questo riguardo poiché le cellule del trofoblasto, in regioni specifiche dell'interfaccia tra utero e placenta, normalmente esprimono antigeni MHC di classe I durante il terzo trimestre della gestazione (Davies et al 2000). Ciò aumenta la possibilità di una reazione impianto-verso-ospite contro il feto quando le proteine espresse da questo scatenano una reazione immunologica della madre. In natura questo evento è improbabile poiché la scelta dei partner nell'accoppiamento consente la selezione di genotipi compatibili al MHC e permette di ottenere quindi una progenie vitale. Tale scelta dipende da una complessa interazione tra sostanze odorose emanate e da recettori nasali. Dopo la scoperta di Yamazaki e colleghi (1991) che sostanze odorose specifiche dell'individuo e dipendenti dalla regione MHC influenzano la selezione sessuale, molti studi nei vertebrati hanno messo in luce che geni altamente polimorfici entro la regione MHC partecipano nella scelta del partner (Penn &amp; Potts 1998). In questa regione sono presenti non solo geni di sostanze odorose ma anche geni di recettori per gli odori (Fan et al. 1995)
La inseminazione artificiale (IA), così diffusa nei bovini e particolarmente nell'allevamento da latte, può rendere inefficaci i meccanismi di scelta dei partner e contribuire alla caduta del tasso di fertilità come si registra negli ultimi decenni. Ciò può essere confermato dal fatto che la inseminazione eterospermatica nel bovino (ovvero con un numero multiplo di tori) ha un tasso di concepimento più elevato rispetto alla inseminazione effettuata con il singolo toro (Stewart et al 1975, Dziuk 1996). Noi ipotizziamo che nel bovino, come nel topo (Penn &amp; Potts 1999), accoppiamenti di riproduttori con MHC incompatibili, imposti con la IA, determinano una ridotta capacità riproduttiva.

Riproduzione nel maschio
Per il successo della riproduzione nei bovini la fertilità maschile rappresenta una componente di notevole importanza sia per i tori candidati alla riproduzione sia per i tori provati.
La valutazione genetica di questo parametro nei riproduttori, nonostante l’ereditabilità molto bassa, mostra soprattutto per i caratteri diretti, una variabilità genetica elevatissima. Nel 2005 nei soli tori rank 95 per l’indice di selezione della Frisona Italiana, si trovano soggetti con variazioni pari a + 2 D.S. dell’Indice Fertilità.

1) Geni candidati
Negli ultimi 15 anni, le conoscenze della fisiologia della riproduzione dei mammiferi si sono notevolmente approfondite grazie alle indagini di biologia e biochimica cellulare contribuendo, insieme ai progressi della genomica e della biologia molecolare, all’individuazione di più di 200 geni coinvolti nei processi implicati nella fertilità maschile. I passaggi chiave della riproduzione maschile riguardano: la spermatogenesi suddivisa in spermatocitogenesi e spermiogenesi, la maturazione degli spermatozoi, i cambiamenti nella composizione della membrana plasmatica degli spermatozoi durante l’eiaculazione, la successiva capacitazione e la reazione acrosomale all’interno delle vie genitali femminili e il compimento della fecondazione con la fusione dei gameti.
Nell’uomo e nel topo sono stati individuati diversi geni che possono interferire con il normale processo della spermatocitogenesi e che possono condurre ad azoospermia (Matzuk and Lamb 2002, Liska et al., 2003). Fra questi riveste particolare interesse il c-kit proto-oncogene (KIT) e il suo ligando (KITLG) o stem cell factor che influenza la differenziazione delle cellule germinali primordiali in spermatogoni (Rossi et al., 2003). Maschi sterili nel topo, caratterizzati da una riduzione del numero di cellule germinali primordiali, presentano alterazioni in entrambi questi geni (Kissel et al, 2000; Blume-Jensen et al., 2000). Nei bovini sono noti alcuni polimorfismi in entrambi i geni (Aasland et al., 2000; Olsen et al., 2000).
Mutazioni in geni implicati nella meiosi, passaggio chiave della spermatogenesi, possono essere causa di azoospermia o infertilità. Un esempio è costituito dalla proteina del complesso sinaptonemico (SYCP3). Nell’uomo mutazioni in questo gene, possono essere responsabili di un arresto della meiosi e successiva degenerazione degli spermatociti durante la prima divisione meiotica (Miyamoto et al., 2003, de Boer P.et al., 2004). Il coinvolgimento delle proteine del complesso sinaptonemico è stato osservato anche nella profase I della spermatogenesi bovina (Pfeifer et al., 2000).
Diversi geni e loro mutazioni interferiscono con la spermiogenesi. Nella formazione dell’acrosoma è implicato, ad esempio, il gene GOPC. Tale gene codifica per una proteina associata al Golgi e i topi knockout risultano affetti da globozoospermia (Yao et al., 2002). Un altro gene identificato in topi knockout che mostrano oligozoospermia e globozoospermia è il gene della caseina chinasi II alfa subunità 2 (CSNk2a2, Xu et al., 1999). Questo gene nei bovini è risultato in linkage con diversi marcatori microsatelliti del BTA18 (Aasland et al., 2000). Nell’uomo sono noti polimorfismi in entrambi i geni associati a globozoospermia (Christensen et al., 2006).
Alcune famiglie di proteine, quali le proteine di secrezione ricche di cisteina (CRISP) (Cuasnicu et al., 2001), le spermadesine (Haase et al., 2005) e la famiglia delle proteine con un numero variabile di fibronectine con domini di II tipo (Reiner et al., 1996, Ekhasi-Hundrieser et al., 2005) contribuiscono alla maturazione degli spermatozoi. I geni implicati nella codifica e regolazione delle proteine del plasma seminale rappresentano una eccellente classe di geni candidati per la valutazione della fertilità maschile dei tori provati. Nel suino vi sono indicazioni circa un ruolo nelle prestazioni riproduttive maschili dei polimorfismi nei geni ACTN1 e ACTN2 implicati nel meccanismo della reazione acrosomale (Wimmers et al., 2005).
Dopo l’eiaculazione, per la capacità fecondante del seme è essenziale la motilità degli spermatozoi. Si è constatato che la famiglia delle proteine transmembrana CATSPER dei canali del Ca2+ svolge un ruolo fondamentale in questo processo (Kirichok et al., 2006) influendo sul movimento flagellare degli spermatozoi e riducendo la fertilità (Carlson et al., 2003; Avidan et al., 2003; Nikpoor et al., 2004).

2 Geni Mitocondriali
Il genoma mitocondriale dei mammiferi comprende un unico cromosoma circolare privo di istoni e della lunghezza approssimativa di 16-17 kbasi di DNA (mtDNA) (Anderson et al. 2001), presente in una o più copie all’interno di ogni mitocondrio. Il DNA mitocondriale comprende 37 geni privi di sequenze introniche (Strachan et al. 1999). Essi codificano 13 proteine costituenti parte dei complessi proteici (I, III, IV e V o ATP-sintetasi) coinvolti nella catena respiratoria, 2 RNA ribosomiali mitocondriali (12S e 16S rRNAs) e 22 RNA trasportatori (tRNAs) implicati nei processi di sintesi proteica all’interno dell’organello.
Lo spermatozoo contiene, nel suo tratto intermedio, 50-75 mitocondri (Ankel-Simons et al 1996) che hanno struttura e funzione simili a quelle dei mitocondri delle cellule somatiche, poiché sono deputati alla produzione di energia per il movimento dello spermatozoo.
La sequenza del mtDNA degli spermi è identica a quella delle cellule somatiche, ma nello spermatozoo i meccanismi di riparazione del DNA sono meno attivi o del tutto assenti (Renyer 1998). Perciò, sebbene lo spermatozoo maturo sia generato a partire da spermatogoni ed abbia vita media molto più corta rispetto alle cellule somatiche, è stato dimostrato che le mutazioni si accumulano rapidamente nel mtDNA degli spermi. L’assenza di meccanismi di riparazione ed un alto tasso di mutazione possono essere all’origine dell’evoluzione dell’eredità per linea materna del DNA mitocondriale, attraverso l’esclusione del mtDNA dello spermatozoo dall’uovo fertilizzato.
Sulla base di queste conoscenze, molti ricercatori hanno studiato mutazioni, duplicazioni e delezioni nel DNA mitocondriale degli spermi umani, cercando di individuare le relazioni tra mtDNA anomalo e movimento degli spermi. Sono state raccolte sempre maggiori evidenze circa il coinvolgimento dei mitocondri nei fenomeni di sterilità o ipofertilità maschile. La sterilità maschile, associata con astenozoospermia (Folgero et al., 1993) o oligoastenozoospermia (Lestienne et al., 1997), è stata riportata in pazienti che soffrono di tipiche malattie di origine mitocondriale causate da mutazioni puntiformi o delezioni multiple. E’ stato dimostrato che gli spermi sono particolarmente inclini a sviluppare delezioni nel mtDNA (Cummins et al., 1998; O'Connell et al., 2002). Alcuni studi hanno dimostrato che negli spermi umani queste delezioni sono associate ad un calo della motilità e fertilità (Kao et al., 1995, 1998). Inoltre, è stata trovata una correlazione tra la qualità del seme e la funzionalità della catena respiratoria nei mitocondri degli spermi (Ruiz-Pesini et al., 1998, 2000a; Hoshi et al., 2002). In aggiunta, è stato dimostrato che la presenza di mutazioni puntiformi o di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs single nucleotide polymorphisms) oppure l’appartenenza a particolari aplogruppi mitocondriali può influenzare grandemente la qualità del seme (Holyoake et al., 1999, 2001; Ruiz-Pesini et al., 2000b; Sutarno et al., 2002). In particolare è stato dimostrato che differenti subaplogruppi umani appartenenti all'aplogruppo U e caratterizzati da differenti mutazioni puntiformi, mostrano differenze significative in qualità e vitalità spermatica (Montiel Sosa et al., 2006).
L’alto tasso di delezioni o sostituzioni osservato negli spermi può essere dovuto ad una compromissione del meccanismo di sostentamento del mitocondrio o derivare dall’effetto deleterio dello stress ossidativo. Di recente è stato dimostrato che la DNA polimerasi gamma (POLG), specifica per il mitocondrio ma codificata nel nucleo è coinvolta in alcuni fenomeni di infecondità maschile (Rovio et al., 2001). L’assenza dell’allele più comune del gene per la POLG è stata associata con un’ampia serie di carenze nella qualità del materiale seminale.
Il potenziale impatto della fertilità maschile sull’efficienza riproduttiva di una razza è altamente significativo, poiché pochi maschi selezionati forniscono il materiale seminale per la fecondazione di centinaia di migliaia di bovine per inseminazione artificiale (I.A.).
Attualmente nei bovini l’influenza della genetica sulla fertilità maschile è stata studiata principalmente a livello cromosomico. Sono stati elencati numerosi difetti che indeboliscono o fanno diminuire la fertilità maschile producendo gameti sbilanciati (Nino-Soto et al. 2004).
Al contrario al momento sono scarse le ricerche condotte sull’associazione tra fertilità maschile e variabilità mitocondriale nei bovini. In questa specie il DNA mitocondriale è poco studiato in generale, come testimoniato dalla presenza nelle banche dati genetiche di uno scarso numero di sequenze complete di genoma mitocondriale e di poche centinaia di sequenze parziali della regione di controllo o di altri geni, studiati solitamente a scopo filogenetico o per la tracciabilità di specie. <<<