RICERCA ITALIANA     

Modellazione multiscala e sviluppo di reattori per la produzione di nanoparticelle polimeriche

Università degli Studi di Palermo

Abstract

Il potenziale applicativo delle nanoparticelle è vasto e comprende diversi settori, tra cui la produzione di adesivi, pigmenti, catalizzatori, etc. Di particolare interesse risultano inoltre le potenzialità applicative in campo farmaceutico.
Questo progetto di ricerca si propone di contribuire all’avanzamento del settore attraverso i punti di seguito elencati.

1) Sviluppo di processi e apparecchiature idonee alla produzione controllata di nanoparticelle polimeriche in seno ad apposite fasi liquide. In particolare cinque diversi tipi di reattore di precipitazione (un reattore agitato convenzionale, un miscelatore statico, un reattore a getti collidenti, un reattore a vortice e un reattore a cella di Couette) verranno sperimentalmente indagati presso tre delle unità operative, al fine di confrontarne criticamente le prestazioni.

2) Sviluppo di metodologie modellistiche avanzate per la simulazione dei reattori di precipitazione. Le metodologie modellistiche messe a punto verranno validate per confronto con i dati sperimentali prodotti nell’ambito delle attività di cui al punto 1. Una volta validate, le metodologie di simulazione sviluppate verranno impiegate per supportare il miglioramento dei processi e delle apparecchiature di cui allo stesso punto.

3) Avvio dello sviluppo del processo produttivo di un farmaco nanoparticellare innovativo. La procedura base verrà messa a punto da una unità operativa con esperienza specifica, e verrà poi impiegata dalle altre unità operative per esaminare la applicabilità pratica sia dei reattori indagati al punto 1 che delle metodologie modellistiche di cui al punto 2, ai fini della produzione di un prodotto di interesse industriale. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Alberto Brucato Università degli Studi di PALERMO

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo generale del presente progetto di ricerca è la messa a punto di metodologie modellistiche avanzate e di apparecchiature specifiche per la produzione industriale di nanoparticelle con caratteristiche mirate.
La modellazione dei processi di produzione delle nanoparticelle è estremamente complessa, poiché, come verrà meglio chiarito più avanti, implica lo sviluppo di un numero considerevole di sottomodelli per la descrizione dei tanti processi elementari che, alle varie scale spaziali e temporali coinvolte, compongono il processo globale.

A complicare ulteriormente un quadro già abbastanza complesso, interviene anche la considerevole varietà dei processi con cui le nanoparticelle possono essere prodotte, ognuno dei quali richiede lo sviluppo di specifici sottomodelli. E’ per questo motivo che si è scelto di finalizzare le attività modellistiche e lo sviluppo delle apparecchiature ad una specifica applicazione pratica, segnatamente alla produzione di nanoparticelle polimeriche di interesse farmaceutico. Tale scelta è stata suggerita tanto dalla perdurante carenza di informazioni e di comprensione dei fenomeni specificamente coinvolti, quanto dalle grandi potenzialità applicative di tali particelle.

Rispetto alle normali preparazioni farmaceutiche, le nanodispersioni di principi attivi organici mostrano infatti un notevole aumento nella velocità di dissoluzione, una migliore risposta biologica e la possibilità di una azione fisiologica estremamente selettiva . Le nanoparticelle utilizzate nelle applicazioni terapeutiche sono spesso costituite da una struttura polimerica che contiene il principio attivo. A seconda della loro struttura vengono distinte in due classi: nanosfere o particelle "pseudo-latex", formate da una struttura a matrice polimerica in cui il composto attivo si trova disperso (legato per adsorbimento o assorbimento), e nanocapsule, in cui il polimero forma un guscio cavo che racchiude il principio attivo, spesso disciolto in un solvente oleoso. I vantaggi di questi vettori nell'uso terapeutico sono numerosi e comprendono: la capacità di fornire sostanze che sono poco solubili in acqua, la modifica della affinità biologica del principio attivo, la possibilità di rilascio controllato del farmaco, il miglioramento della efficacia terapeutica tramite l'aumento della quantità di farmaco che raggiunge i siti di azione specifici nell'organismo e la diminuzione della sua concentrazione nei siti aspecifici. Infine va menzionata la possibilità di protezione di queste nanoparticelle dalla degradazione nell'organismo mediante l'inserimento di particolari gruppi molecolari nella struttura polimerica .
La messa a punto di una formulazione idonea alla produzione di specifiche nanoparticelle di potenziale interesse farmaceutico è chiaramente un compito che esula dalle competenze possedute dalle quattro unità di ricerca ingegneristiche coinvolte nel progetto. Tale compito verrà quindi svolto da una unità di ricerca (Torino-Università) operante presso la Facoltà di Farmacia e dotata di esperienza specifica, che è stata specificamente coinvolta allo scopo.

La tecnica di produzione di nanoparticelle che riceverà la maggiore attenzione in questo progetto di ricerca è il "solvent displacement method", che consiste nel mescolare un solvente organico idrofilo, in cui polimero e principio attivo siano stati precedentemente disciolti, con una soluzione acquosa. La differenza di solubilità dei soluti organici fra il solvente puro presente inizialmente e la soluzione finale acqua-solvente ne induce la precipitazione. Il metodo fu sviluppato originariamente dal gruppo di Fessi all'Università Claude Bernard di Lione ed è noto ormai da oltre quindici anni. Durante questo periodo il processo è stato adattato a diversi principi attivi organici e a differenti tipi di polimero, ma il suo sviluppo e la messa a punto restano ancora sostanzialmente empirici. Manca tuttora la capacità di previsione quantitativa del processo, come pure la comprensione richiesta per svilupparlo e controllarlo in modo da adattare le proprietà del prodotto a applicazioni specifiche. La situazione è dovuta in parte al fatto che i fenomeni che hanno un ruolo determinante sul risultato finale del processo avvengono su scale spaziali e temporali estremamente differenti: scala molecolare (interazioni fra le molecole dei soluti, come pure fra soluto e solvente), nanoscala (formazione dei cluster e dei nuclei, fenomeni di aggregazione), microscala (problemi di micromixing), scala tipica dell'apparecchiatura di sintesi (fenomeni di macromixing). Di conseguenza lo studio della precipitazione di queste nanoparticelle organiche richiede una approccio multidimensionale (e quindi anche multidisciplinare). Tale approccio è necessario se si intendono sviluppare metodi razionali e affidabili di produzione, nonché per effettuare lo scale-up dalla scala di laboratorio a quella industriale.

L'uso di diverse configurazioni reattoristiche sarà d'aiuto in questo compito permettendo l'indagine di aspetti particolari del processo. L'obiettivo è di sviluppare un approccio generale per lo sviluppo e la messa a punto del processo e di un idoneo reattore, in modo da riuscire a dirigere l'operazione verso obiettivi specifici per il prodotto (distribuzione granulometrica, rapporto fra principio attivo e polimero, tipo di rivestimento,.) scegliendo opportunamente le condizioni operative e il tipo di reattore.

E’ del tutto evidente che la maggior parte degli obiettivi parziali di questo progetto, come lo sviluppo di idonei modelli per ognuno dei fenomeni coinvolti nel processo di precipitazione (simulazione di campi di moto, macro e micromiscelazione, tecniche di bilancio di popolazione etc) si configurano come validi obiettivi a se stanti, essendo suscettibili di utili ricadute applicative in molti altri processi, anche non coinvolgenti reazioni di precipitazione. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Come indicato in precedenza, gli obiettivi di questa ricerca comprendono lo sviluppo di apparecchiature e metodologie modellistiche che consentano il "process design" di nanoparticelle polimeriche e il collaudo delle metodologie sviluppate su un banco di prova realistico, costituito dallo sviluppo del processo produttivo di un farmaco nanoparticolato innovativo.

Per ottenere la massima efficacia terapeutica, un farmaco dovrebbe raggiungere rapidamente ed in quantità adeguata il proprio organo bersaglio, restarvi per un periodo di tempo sufficiente per esplicare la propria azione terapeutica, ed essere invece escluso da altri distretti nei quali potrebbe presentare azioni tossiche. In questo modo, oltre a diminuire gli effetti collaterali, sarebbe possibile anche ridurre la dose somministrata. Tuttavia molto spesso la distribuzione di un farmaco nell'organismo non è quella desiderata e la frazione di farmaco che arriva al sito target è insufficiente, mentre esso tende ad accumularsi in altri tessuti con conseguenti effetti tossici. Questo è particolarmente evidente nelle terapie antitumorali. Per tentare di aumentare la concentrazione di principio attivo nel sito target una delle strategie più promettenti è l'associazione del principio attivo ad un carrier nanoparticellare, solitamente polimerico, in grado di incorporare il farmaco, di trasportarlo e di rilasciarlo in modo controllato. Il carrier deve essere biocompatibile e biodegradabile per poter essere eliminato in breve tempo dall'organismo al fine di evitare un accumulo di eventuali prodotti tossici. Queste nanoparticelle sono classificate secondo la natura del polimero che le costituisce e secondo il metodo di preparazione (Couvreur, 1995) .

Il particolare prodotto verso cui si intende orientare gli sforzi nell’ambito del progetto è costituito da polimeri a base di cianoacrilati (polialchil cianoacrilati, PACA). Questi materiali sono usati da tempo per la preparazione di potenziali carrier per il rilascio controllato di farmaci a causa dell'alta reattività dei monomeri che li costituiscono, della biodegradabilità e della bassa tossicità (Couvreur, 1979). Le particelle di PACA sono state utilizzate per il trasporto di numerosi farmaci antitumorali, fra i quali uno dei più interessanti è la doxorubicina, sostanza attiva verso un largo spettro di tumori ma caratterizzata da una marcata cardiotossicità. La sua incapsulazione in nanoparticelle di PACA (Verdun, 1990) ha permesso di ridurre la localizzazione nel miocardio ed è risultata in grado di agire efficacemente anche in linee cellulari particolarmente resistenti .
Un sistema efficace per veicolare il farmaco in modo è il “targeting attivo” (Brannon-Peppas, 2004), che consiste nel rivestire le particelle mediante agenti riconosciuti da recettori specifici, cioè presenti solo su tumori o da questi sovraespressi. Un agente direzionante molto promettente è l'acido folico, di cui è stato spesso osservato un livello di espressione elevato in diversi tessuti tumorali (Garin-Chesa, 1993). Questo recettore inoltre, negli organi in cui esso è presente normalmente, è inaccessibile ai sistemi somministrati per via endovenosa. Vari autori hanno quindi utilizzato il recettore dell'acido folico come target tumorale di diversi principi attivi ed agenti diagnostici (Stella, 2000; Sudimack, 2000; Wang, 1998) .

Le nanoparticelle saranno preparate utilizzando il metodo della "nanoprecipitazione" o "solvent displacement", in cui il polimero ed il principio attivo organico vengono disciolti in un solvente idrofilo (acetone, THF, alcoli a catena corta), che è successivamente mescolato con acqua. La minore solubilità di polimero e principio attivo in acqua ne induce la precipitazione come nanosfere. La preparazione delle nanocapsule è simile: infatti è sufficiente aggiungere al solvente organico un olio insolubile in acqua e in cui il principio attivo sia molto solubile; la miscelazione con acqua porta a una nanoemulsione dove vengono a formarsi delle particelle rivestite di polimero e il cui cuore è dato dalla soluzione principio attivo-olio .
Il principale vantaggio di questo processo è legato all'uso di solventi perfettamente miscibili con acqua e con livelli di tossicità molto bassi, a differenza di altre tecniche che adottano solventi lipofili o anfifilici, i quali potrebbero dare effetti tossici qualora non si riuscisse a rimuoverli completamente al termine del processo. Inoltre la nanoprecipitazione appare più promettente anche della produzione mediante fluidi supercritici sia per la semplicità di impianto, sia per la maggiore attitudine a formare particelle nel campo nanometrico di interesse (Horn, 2001) .

Il metodo di nanoprecipitazione fu sviluppato originariamente dal gruppo di Fessi all'Università Claude Bernard di Lione (Fessi, 1989; Thioune, 1997) ed è noto ormai da più di 15 anni, ma la scarsa comprensione dei fenomeni che intervengono rende tuttora empirico e problematico lo sviluppo delle applicazioni pratiche. Il processo è caratterizzato dalla interazione di vari fenomeni: precipitazione del supporto polimerico attraverso condensazione delle macromolecole disciolte, accompagnata da precipitazione e incorporazione del principio attivo di natura organica.
Gran parte delle informazioni reperibili in letteratura riguardano la produzione di nanoparticelle inorganiche, mentre poco è noto sulla precipitazione di organici. In particolare sono tuttora incompresi i processi chimico-fisici elementari di formazione delle particelle e la creazione dei legami fra il principio attivo e il polimero (Horn, 2001; Texter, 2001). Inoltre la miscelazione dei reagenti è un elemento determinante di questo processo e deve essere agevolata. Una miscelazione intensa, tuttavia, può essere raggiunta solo in condizioni di flusso turbolento, che è noto appunto per la sua natura caotica e largamente imprevedibile. Per di più il processo coinvolge fenomeni che avvengono su scale estremamente differenti, dalla nanoscala delle particelle alla macroscala del reattore, e che richiedono approcci teorici diversi .

Per quel che attiene al campo di moto e alla distribuzione di concentrazione a livello macroscopico, la fluidodinamica computazionale (CFD) basata sulle equazioni mediate di Reynolds (Reynolds Averaged Navier Stokes, RANS) ha cominciato a fornire una solida base metodologica per modellare la miscelazione turbolenta, sebbene i risultati siano ancora affetti da incertezze, principalmente dovute alle carenze dei modelli di turbolenza adottati (Ciofalo, 1996). Passi avanti potranno essere conseguiti con la Large Eddy Simulation (Alcamo, 2005), che risulta però computazionalmente molto pesante. Un carico computazionale ancora superiore è richiesto dalla simulazione numerica diretta della turbolenza (DNS). Tuttavia, per il reattore più piccolo fra quelli esaminati in questo progetto e per condizioni di flusso moderatamente turbolente, l'approccio è risultato fattibile. La DNS non utilizza alcun modello di chiusura per la turbolenza e costituisce pertanto una vera sperimentazione condotta per via numerica, fornendo dati di affidabilità equivalente alle prove empiriche, ma con una risoluzione ed un livello di informazione enormemente superiore (Moin, 1998). La DNS classica, basata su metodi spettrali, è applicabile solo a geometrie molto semplici; approcci più recenti utilizzano algoritmi alle differenze finite (Verzicco, 1996) che possono essere applicati a geometrie complesse (Cerbelli, 2001; Marchiali, 2003; Sbrizzai, 2004). Inoltre l'accoppiamento con metodi lagrangiani di "particle tracking" consente il calcolo accurato della storia delle particelle tramite integrazione delle loro equazioni del moto (Maxey, 1983). E' ovviamente necessario, nel nostro caso di particelle submicroniche, considerare anche gli effetti del moto browniano (Sbrizzai, 2005) .

La necessità di caratterizzare il micromixing deriva dal fatto che le reazioni di precipitazione sono molto veloci e spesso avvengono prima che i reagenti siano mescolati uniformemente su scala molecolare (Baldyga, 1999): in questo caso il meccanismo di reazione-diffusione ha luogo alla cosiddetta scala di Batchelor, che, per i sistemi a cui siamo interessati, può essere inferiore al micron. Per sistemi liquidi questa scala è circa 30 volte minore di quella di Kolmogorov, che viene invece risolta dalla DNS. Ciò esclude ogni possibilità di approccio diretto al micromixing, che, di conseguenza deve essere descritto da modelli. Tali modelli di sottogriglia sono stati perciò sviluppati per l'implementazione nei codici CFD di schemi di reazioni veloci monofasi (Baldyga, 2004) e di reazioni di precipitazione (Marchisio, 2001) .
I modelli più accurati descrivono il comportamento della turbolenza attraverso la sua funzione densità di probabilità (pdf). Il metodo "full pdf" risolve direttamente l'equazione di trasporto della pdf utilizzando tecniche stocastiche molto accurate, ma che richiedono spesso eccessive risorse in termini di tempo di calcolo. Il carico computazionale può essere ridotto imponendo a priori una appropriata forma funzionale per la pdf ("pdf assunte"). Questi metodi comprendono la "beta-pdf" (Baldyga, 2001) e la "finite-mode pdf" (Fox, 1998). Quest'ultima tecnica è stata convalidata estensivamente e con successo per confronto con i risultati delle "full pdf" e con dati sperimentali relativi a sistemi reattivi in varie condizioni operative (Marchisio 2001b e 2003) .

Altro elemento importante è la descrizione della evoluzione del precipitato solido tramite l'equazione di bilancio di popolazione (PBE), cioè una equazione di continuità per la distribuzione di proprietà della popolazione di particelle. Essa viene solitamente espressa in termini delle principali proprietà delle particelle, come volume o dimensione (le cosiddette coordinate interne). Nel nostro caso la popolazione è formata da nanoparticelle di principio attivo impregnato in una struttura polimerica e dovrà essere caratterizzata attraverso almeno due coordinate interne, che indichino appunto le quantità di polimero e di principio attivo presenti .
La soluzione della PBE richiede normalmente la discretizzazione della funzione densità di popolazione in un certo numero di classi, ognuna delle quali dà luogo ad una equazione di trasporto di uno scalare passivo. Problemi tipici con una singola coordinata interna possono richiedere da 50 a 100 classi per essere risolti accuratamente (Vanni, 2000), il che rende il problema intrattabile da un codice CFD. La situazione è ovviamente peggiore quando si hanno due o più coordinate interne. Come alternativa la PBE può però essere risolta per mezzo del metodo dei momenti: la versione originale del metodo (Hulburt, 1964) risentiva del cosiddetto problema di chiusura, che è stato risolto solo recentemente utilizzando un metodo particolare di quadratura (Marchisio, 2003; Mc Graw, 1997)
McGraw, 1997). L'uso di questo metodo riduce il numero di equazioni dalle 50-100 richieste dal metodo delle classi a 8-10, mantenendo la stessa accuratezza sulla valutazione delle proprietà integrali della popolazione e permettendo così l'implementazione nei codici CFD. Ultimamente il metodo è stato esteso a problemi con due coordinate interne (Marchisio, 2005) .

Riguardo ai processi elementari di evoluzione delle particelle, mentre l'approccio teorico per l'aggregazione browniana è ben stabilito, le espressioni per le velocità di nucleazione e crescita si basano spesso su formulazioni empiriche piuttosto incerte, in quanto non è tuttora possibile dedurre queste informazioni dalle caratteristiche molecolari o termodinamiche. Ciò dipende dalla complessità dei fenomeni elementari che avvengono a livello di nanoscala, nonché dalle difficoltà di sviluppo di tecniche sperimentali adeguate, a causa dalla piccolezza delle scale coinvolte. Probabilmente avanzamenti significativi nel settore saranno possibili quando le tecniche di modellazione molecolare saranno adeguatamente sviluppate. Nel frattempo il ricorso a relazioni empiriche non può essere evitato .
Come mostrato da Johnson (2003), per la riuscita della sintesi di nanoparticelle a base polimerica, occorre che i tempi caratteristici degli step elementari combacino fra loro. Di questi step il mixing è il meno controllabile. Pertanto, sebbene spesso le preparazioni di laboratorio avvengano sotto semplice agitazione magnetica, la industrializzazione del processo deve necessariamente passare attraverso un migliore controllo della miscelazione, che può essere ottenuto solo con una configurazione reattoristica appropriate .
Tuttavia nessun confronto sistematico fra diverse possibili soluzioni reattoristiche è stato finora effettuato per questo processo e, di conseguenza, questo sarà uno dei compiti di questo progetto di ricerca. Il punto di partenza per l'analisi sta nella teoria classica della nucleazione, che indica la necessità di una sovrasaturazione molto elevata (e quindi di un mixing intenso) per produrre particelle submicroniche, in modo da favorire la nucleazione rispetto alla crescita (Dirksen, 1991) .

Il reattore agitato è stato la prima configurazione adottata in letteratura, utilizzata già dal gruppo di Fessi. Esso è la scelta più comune per le operazioni di mixing ed anche la più investigata. Sfortunatamente genera una turbolenza fortemente disomogenea, intensa vicino all'agitatore e debole altrove, con tempi di mixing diseguali. Ciò si riflette in una troppo ampia distribuzione di proprietà delle particelle prodotte. Per questo motivo Fessi stesso suggerì l'uso di un miscelatore a T (Briancon et al, 1999).
Una evoluzione di questo sistema è il reattore a getti collidenti confinati, proposto originariamente da Mahajan (1996), che consente tempi di mixing estremamente bassi, addirittura inferiori a quelli caratteristici per nucleazione e crescita. Poiché le proprietà del prodotto dipendono in genere dai processi più lenti, con questo reattore esse diventano indipendenti dal mixing e si ottiene un precipitato con caratteristiche più uniformi (Johnson, 2003).
Il reattore a vortice costituisce una configurazione alternativa che, evitando la necessità di operare con getti di eguale portata, tipica del reattore a getti collidenti, rende l'operazione più flessibile, pur mantenendo una velocità di miscelazione molto elevata.
Una possibile alternativa è il miscelatore statico, in quanto è anch'esso caratterizzato da tempi di miscelazione molto bassi rispetto ai reattori convenzionali (Streiff, 1999). Sfortunatamente la valutazione delle condizioni operative di questo sistema è tuttora basata su metodi semiempirici. Come notato da Das (2005), il campo di moto nei miscelatori statici è complesso e può essere predetto quantitativamente solo con difficoltà, inoltre gli sforzi per utilizzare codici CFD sono, fino ad oggi, limitati a poche applicazioni (Fradette, 1998; Rauline, 1998) .
Anche apparecchiature ad alta velocità di deformazione sono state sperimentate con successo per la conduzione di reazioni veloci e di precipitazioni (Rousseax, 1999 e 2001). Un reattore basato su questo principio verrà usato nel progetto, però con configurazione a cella di Couette invece che a disco rotante, per fornire una maggiore uniformità di flusso e di conseguenza un prodotto più omogeneo.
Tutte le tipologie di reattore sopra citate saranno oggetto di specifiche indagini, ai fini del confronto critico delle prestazioni e della robustezza nei confronti dello scale-up, nell’ambito delle nano-precipitazioni di interesse per il progetto. <<<