RICERCA ITALIANA     

Analisi della deformabilità in vitro di cellule ematiche mediante video microscopia ottica: flusso in microcanali di eritrociti e piastrine e migrazione transepiteliale di linfociti in un sistema di cocultura

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

Lo studio della deformabilità cellulare, intesa come la capacità di adattare la morfologia alle funzioni cellulari in relazione alle condizioni dell’ambiente circostante, è un soggetto di crescente interesse scientifico, anche alla luce della possibilità di discriminare con elevata selettività cellule sane e patologiche sulla base di questa sola proprietà. Nel caso delle cellule ematiche, la deformabilità è rilevante sia per il flusso nel sistema circolatorio (in particolare nei microcapillari) che per la migrazione dei linfociti al di fuori dei vasi (stadio essenziale della risposta immunitaria). L’indagine della deformabilità di cellule ematiche (eritrociti, linfociti e piatrine) in queste due situazioni tipo (flusso circolatorio e migrazione attraverso tessuti), sia in condizioni sane che patologiche, rappresenta l’attività principale del progetto. Data la complessità del problema, l’approccio utilizzato è di tipo interdisciplinare e si avvale di competenze in ambito ingegneristico, fisico e medico e di rapporti di collaborazione già in corso tra le varie unità. Data la limitata cornice temporale, il programma di ricerca è indirizzato a obiettivi circoscritti e si basa in larga misura su strumentazioni e tecniche già disponibili presso le unità partecipanti.
Con riferimento agli eritrociti, il programma prevede lo studio della deformabilità nel flusso in microcanali realizzati mediante tecniche litografiche. Le osservazioni della morfologia in flusso verranno condotte mediante una workstation di video microscopia ottica ed analisi dell’immagine. Verrà inoltre esplorato l’effetto di campi elettrici (dielettroforesi) e magnetici (magnetoforesi) per la separazione di sottopopolazioni di cellule. Dal punto di vista clinico, questa parte del programma sarà concentrata su patologie ematiche caratterizzate da condizioni di ipercitosi con potenziali ricadute diagnostiche in tale ambito. Le metodiche sviluppate nel progetto saranno inoltre applicabili ad un gruppo più ampio di patologie (ad esempio, talassemia, anemia falciforme o altri tipi di emoglobinopatie). Infine, il sistema potrà essere utilizzato per la valutazione dell’effetto in vivo ed in vitro di alcuni farmaci sulla deformabilità eritocitaria.
Per quanto riguarda i linfociti, l’attività di ricerca sarà indirizzata allo sviluppo di una nuova metodica di analisi morfologica e biochimica della deformabilità dei linfociti durante la migrazione dalla sottomucosa alla superficie epiteliale. A questo scopo, verrà realizzata una cella di cocultura, in cui verrà studiata la morfologia linfocitaria durante la migrazione attraverso un monostrato epiteliale sotto l’effetto di agenti chemotattici. La patologia di riferimento in questa attività è la celiachia, ma le metodiche sviluppate nel progetto saranno anche applicabili ad un gruppo più ampio di patologie autoimmuni (ad esempio, malattie infiammatorie croniche intestinali, artrite reumatoide ed alcune patologie tumorali).
Infine, ulteriore obiettivo del progetto sarà lo sviluppo di metodiche ed esperimenti orientati a comprendere l'entità delle deformazioni indotte sulle piastrine nel loro scorrere, trasportate dal plasma, sulla superficie di vasi di piccolo calibro. Questa attività verrà svolta utilizzando un sistema di perfusione corredato di microscopia ottica e confocale già disponibile. Il programma prevede sia esperimenti in plasma arricchito di piatrine per verificarne la deformazione dopo adesione su substrati citoadesivi determinata da fenomeni di puro shear che esperimenti su sangue ricostituito per verificare in quale misura il tasso di ematocrito sia capace di influenzare il processo di deposizione delle piastrine. Con riferimento a quest’ultima attività, si verificherà inoltre se patologie che determinano una modifica della deformabilità eritrocitaria abbiano conseguenze sul processo di deposizione piastrinica, influenzando l'entità della segregazione radiale. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giuseppe Marrucci Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Obiettivo generale del programma di ricerca è lo studio della deformabilità di cellule ematiche mediante modelli in vitro. La deformabilità cellulare, intesa come la capacità di adattare la morfologia alle funzioni cellulari in relazione alle condizioni dell’ambiente circostante, è una proprietà implicata in diversi processi fisiopatologici, come la replicazione e la migrazione. Ad esempio, i linfociti in circolazione sono soggetti a ripetuti stress idrodinamici e meccanici, e quindi hanno una citoarchitettura sufficientemente rigida da proteggerli da eventuale danneggiamento. La migrazione dal sangue ai tessuti richiede tuttavia la rapida conversione della citoarchitettura dei linfociti da semirigida ad altamente deformabile, poiché le cellule subiscono enormi modifiche di forma per penetrare i piccoli spazi tra le cellule endoteliali. L’indagine di queste due situazioni tipo (flusso circolatorio e migrazione attraverso tessuti), sia per cellule sane che in condizioni patologiche, rappresenta l’attività principale del progetto. Il programma di lavoro è indirizzato ai seguenti obiettivi specifici: 1) Messa a punto di una cella di flusso per la determinazione della deformabilità di globuli rossi in microcanali e relative prove sperimentali su campioni prelevati da donatori affetti da poliglobulia; 2) Messa a punto delle tecniche di fotolitografia e softlitografia per la fabbricazione di microcanali in matrici polimeriche; 3) Realizzazione di una celle di co-coltura per la migrazione transepiteliale di linfociti di pazienti affetti da patologie gastrointestinali e relative prove sperimentali su campioni prelevati da donatori affetti da celiachia; 4) Studio della deformazione in shear di piastrine dopo adesione su substrati citoadesivi, sia in assenza di altre cellule ematiche che in sangue ricostruito con diversi livelli di ematocrito.
Con riferimento ai punti 1) e 2), in questa parte del progetto ci si propone di mettere a punto un apparato sperimentale in grado di riprodurre le condizioni fluidodinamiche cui sono soggetti i globuli rossi ed i globuli bianchi durante il flusso in microcanali (microfluidics) con geometrie rilevanti dal punto di vista fisiopatologico. Lo sviluppo dei microcanali sarà effettuato dall’unità II utilizzando tecniche litografiche. Questo tipo di approccio all’analisi del sangue si inserisce in un campo di ricerca di crescente interesse, per il quale è stato coniato il termine “Blood-on-a-chip”. I possibili vantaggi includono i modesti volumi richiesti per le analisi e la portabilità dei dispositivi grazie alla loro miniaturizzazione. In questo progetto, verranno realizzati dei dispositivi integrati che possano non solo analizzare, ma anche separare le componenti cellulari del sangue, sfruttandone in primo luogo il diverso comportamento dinamico nell’attraversamento di microcanali. A questo scopo, verranno studiati i meccanismi di interazione tra le varie cellule e campi elettrici (Dielettroforesi) e magnetici (Magnetoforesi) appositamente applicati.
I dispositivi sviluppati dal’unità II verranno integrati in una cella di flusso già disponibile presso l’unità I per l’effettuazione della campagna sperimentale. I campioni di sangue per queste prove verranno forniti dall’unità III. Verranno determinate le distribuzioni di dimensioni e di indici di forma di campioni provenienti da diversi donatori al variare delle dimensioni caratteristiche dei capillari e della portate del flusso nel range di rilevanza fisiologica. Particolare enfasi verrà data a patologie che comportano condizioni di ipercitosi (policitemia vera, trombocitemia essenziale e mielofibrosi idiopatica). L’unità III provvederà comunque anche a raccogliere campioni di globuli rossi da soggetti talassemici, da soggetti con anemia falciforme o con altri tipi di emoglobinopatie, da pazienti con anemie emolitiche congenite di tipo sferocitico o non sferocitico (da carenza enzimatica), da emoglobinuria parossistica notturna, da anemie emolitiche a genesi immunologica, da alterazioni della forma dei globuli in dipendenza da carenza di ferro, e da qualsiasi altra eritropatia possa essere disponibile nella corte di pazienti già seguiti presso la struttura clinica o che verranno diagnosticati durante il periodo dello studio. Il sistema potrà essere anche utilizzato per la valutazione dell’effetto in vivo ed in vitro di alcuni farmaci sulla deformabilità eritocitaria.
Con riferimento al punto 3), obiettivo principale di questa attività è lo sviluppo di una nuova metodica di analisi morfologica e biochimica della deformabilità dei linfociti durante la migrazione dalla sottomucosa alla superficie epiteliale. Tale metodica è basata su una cella di cocultura, in cui sangue prelevato da donatori controllo o da pazienti sarà posto in cultura con monolayer di cellule di tipo intestinale (Caco2 e T84). La cella prevede due alloggiamenti, uno (superiore) destinato ai linfociti in sospensione e l’altro (inferiore) in cui saranno introdotti stimoli come gliadina o di IL-15. Le due camere sono separate da un supporto poroso su cui viene coltivato il monolayer di Caco2. I linfociti saranno attratti a migrare attraverso lo strato poroso ed il monolayer di Caco2. La deformabilità dei linfociti sarà caratterizzata acquisendo in modo iterativo serie di immagini (sia in campo chiaro che in fluorescenza) lungo l’asse z attraverso la membrana ed il monolayer di cellule Caco-2. La forma tridimensionale dei linfociti verrà ricostruita mediante tecniche di analisi dell’immagine. Un indice di deformabilità verrà espresso in termini del rapporto tra gli assi principali del corpo cellulare. Lo sviluppo della cella di cocoltura verrà svolta essenzialmente dalla unità I in stretta collaborazione con l’unità IV. La patologia che verrà presa in esame in questa attività è la celiachia, in cui l’unità IV ha una consolidata esperienza. Poiché la celiachia è un modello di patogenesi di danno su base autoimmunitaria la comprensione di un meccanismo ritenuto alla base del processo potrebbe offrire anche un approccio terapeutico anche in molte patologie autoimmuni. Infatti le metodiche sviluppate nel progetto saranno inoltre applicabili ad un gruppo più ampio di patologie (ad esempio, malattie infiammatorie croniche intestinali, artrite reumatoide, alcune patologie tumorali...ecc).
Con riferimento al punto 4), l’obiettivo è di chiarire in quale misura azioni di tipo meccanico esercitate dal fluido trasportante (plasma), o più verosimilmente da altre cellule ematiche presenti nella sospensione, influiscano nella funzione emostatica delle piastrine. Più specificamente si propone di verificare il contributo di deformazione delle piastrine dopo adesione su substrati citoadesivi determinata da fenomeni di puro shear, operando con sangue ricostruito per rimuovere la parte corpuscolare diversa dalle piastrine (Platelet Rich Plasma, PRP); verificare in quale misura il tasso di ematocrito sia capace di influenzare il processo di deposizione delle piastrine, aumentandone la velocità di deposizione; verificare se patologie che determinano una modifica delle proprietà di deformabilità di RBC abbiano conseguenze sul processo di deposizione piastrinica, influenzando l'entità della segregazione radiale (che porta le piastrine in periferia nella normale circolazione) e delle sollecitazioni sulle piastrine adese;caratterizzare la deformazione (spreading) delle piastrine successiva all'incipiente adesione, ritenuta caratterizzante il processo d'attivazione, in relazione al tasso di ematocrito e ad alterazioni patologiche della deformabilità nei globuli rossi; utilizzare sospensioni sintetiche di proprietà comparabili al sangue, sia con sfere rigide che deformabili, con lo scopo di capire gli effetti meccanici (idrodinamici), isolandoli completamente dagli aspetti biologici. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La deformabilità cellulare, intesa come la capacità di adattare la morfologia alle funzioni cellulari in relazione alle condizioni dell’ambiente circostante, è una proprietà implicata in diversi processi fisiopatologici, come la replicazione e la migrazione (Albert et al., 1994). Nelle cellule eucariote, la deformabilità è legata alle proprietà meccaniche del citoscheletro, un reticolo polimerico costituito principalmente da filamenti di actina, microtubuli e filamenti intermedi. Si ritiene che questa complessa struttura sia utilizzata anche come sensore delle condizioni meccaniche dell’ambiente circostante (mechanotransduction), ad esempio lo sforzo imposto nel flusso circolatorio sulle cellule del sangue. Data la complessità strutturale a livello molecolare, uno degli approcci adottati in letteratura è di descrivere la deformabilità in termini macroscopici mediante proprietà reologiche (Lincoln et al., 2004). Utilizzando questo approccio, è stato recentemente dimostrato che la deformabilità assume valori molto diversi per globuli bianchi e rossi e può essere sfruttata come marker per distinguere in modo altamente selettivo cellule sane da tumorali (Lincoln et al., 2004). Lo studio della relazione tra deformabilità e caratteristiche fisiopatologiche, che è alla base di questo progetto, appare quindi come un’area di crescente interesse e di carattere fortemente interdisciplinare, essendo coinvolte competenze in ambito ingegneristico, fisico e medico. Nel seguito di questa sezione verranno passati in rassegna i presupposti scientifici del progetto relativamente alle cellule oggetto di studio, ovvero globuli rossi, globuli bianchi e piastrine.

Con riferimento ai globuli rossi, la deformabilità è essenziale per mantenere un flusso ottimale e per consentire gli scambi gassosi fra sangue e tessuti. Da un punto di vista patologico, la deformabilità dei globuli rossi è implicata, in particolare, in alcune malattie ed alterazioni del sangue periferico, che causano una netta modifica della viscosità. Ci riferiamo alla Policitemia Vera (Spivak, 2003; Teffery, 2001), Trombocitemia Essenziale (Teffery, 2001; Teffery &amp; Murphy, 2001), Mielofibrosi Idiopatica (Teffery, 2001), ed eritrocitosi da cause diverse (emoglobinopatia, iperincrezione di Epo, alterazioni del recettore dell’ eritropoietina) (Hoffman et al., 2000). Denominatore comune di tali stati patologici è l’aumento del numero di cellule circolanti, in diversa possibile e variabile combinazione. L’iperviscosità è alla base di gravi complicanze vascolari, con sistematico coinvolgimento soprattutto del microcircolo (Schafer, 2001; Besses et al., 1999; Kwaan &amp; Wang,, 2003). A sua volta, l’iperviscosità può essere causata o da un aumento delle concentrazione di corpuscoli circolanti o da una loro ridotta deformabilità (Hoffman et al., 2000; Kwaan &amp; Wang, 2003; Van Genderen Perry et al., 1997; Fairbanks et al., 2000). Più in generale, le indagini rivolte alla deformabilità in vitro dei globuli rossi hanno da tempo attratto l’attenzione degli studiosi di fisiologia e di patologia, nell’intento di interpretare i disturbi del microcircolo osservabili non solo in patologie ematologiche (p.es. ulcere malleolari in portatori di alterazioni della forma o della struttura della membrana dei globuli rossi), ma anche in patologie di diverso tipo (p.es. in pazienti diabetici scompensati, in cui le modificazioni della osmolarità plasmatica ed il deficit energetico derivante dalla mancata utilizzazione del glucosio generano danni sia alle membrane dei globuli rossi che alle pareti endoteliali, oppure in pazienti con insufficienza renale cronica) (Hoffman et al., 2000).

Data la complessità del problema e la difficoltà di condurre esperimenti in vivo, una delle principali direzioni di ricerca è stata la realizzazione di sistemi di flusso in vitro che simulino le condizioni fluidodinamiche incontrate dai globuli rossi nella microcircolazione. Tra i metodi finora utilizzati si possono citare la velocità di sedimentazione di un campione di sangue sottoposto a centrifugazione (Sirs, 1968), la filtrazione attraverso membrane con diversa porosità (Teitel, 1977; Dormandy et al., 1985), l’aspirazione di un eritrocita in una micropipetta (Evans, 1973; Chien, 1977), e la diffrazione di una sospensione in flusso di scorrimento in un reometro a cilindri concentrici (ectacitometro, Bessis and Mohandas, 1975). Misure collegate, anche se in modo indiretto, alla deformabilità dei globuli rossi sono quelle di viscosità del sangue, che dipende sia dalla composizione della parte plasmatica che dalle proprietà e dalla concentrazione delle cellule costituenti la parte corpuscolare (Hoffman et al., 2000). A causa di questa complessa microstruttura, il sangue ha proprietà reologiche tipiche di fluidi non-Newtoniani (Astarita e Marrucci, 1974), e la viscosità dipende anche dalle condizioni di flusso (Dupin e Sirs, 1977). Nonostante la rilevanza fisiopatologica della deformabilità dei globuli rossi, le attuali metodiche in uso per la misurazione della viscosità del sangue in toto non prevedono l’osservazione su struttura capillare assimilabile a quella del microcircolo e non permettono l’indagine della deformabilità dei corpuscoli circolanti nei vasi di piccolo calibro (Hoffman et al., 2000).

Recentemente, lo sviluppo di tecniche di microfluidics è stato sfruttato per studiare la deformazione di globuli rossi nel flusso in microcanali a sezione rettangolare realizzati su substrati di vetro o silicone (Kikuchi et al., 1992, 1994; Cokelet et al., 1993; Tracey et al., 1995; Sutton et al., 1997; Tsukada et al., 2001; Shelby et al., 2003). La tematica “microfluidcs” si riferisce alla realizzazione di dispositivi e metodi per il controllo e la manipolazione di fluidi su scala sub-millimetrica. Nel settore bio-tecnologico, essa sta aprendo la strada alla fabbricazione di dispositivi piccoli ed economici, capaci di consentire, attraverso la realizzazione di microcanali, l’analisi non distruttiva di fluidi biologici su scala “cellulare” (Stone et al., 2004). In termini applicativi, i microcanali possono essere integrati con altri dispositivi (iniettori di flusso, filtri, pompe, valvole, mixers, sensori, dispositivi elettrici e magnetici) per la realizzazione di veri e propri micro-laboratori, (lab-on-chip) capaci di realizzare interi processi di analisi. Tra i vari campi di applicazione delle tecniche di microfluidics, l’accurata analisi delle componenti cellulari del sangue rappresenta un argomento di grande interesse nonche’ un campo di ricerca in cui operano sinergicamente settori quali la fisica, l’ingegneria dei micro-dispositivi e la sensoristica avanzata (Toner and Irimia, 2005).
Uno degli aspetti più promettenti è la possibilità di riprodurre condizioni di flusso più simili a quelle in vivo e di effettuare una selezione di cellule basata sulla deformabilità agendo in modo poco invasivo. A tale proposito, basti considerare la facilità con cui i leucociti alterano le loro proprietà adattandosi ai mutamenti dell’ambiente che li ospita, così come stimoli impropri possono alterare le proprietà immunitarie delle cellule quando vengono separate con tecniche convenzionali (Hughes, 2002; Gascoyne and Vykoukal, 2002; Voldman et al., 2002).
A questo scopo, è essenziale la messa appunto di tecniche di tipo “soft-litography” per realizzare microcanali di diverse dimensioni (fino a larghezze minime di 1-2 micron) in grado da un lato di studiare patologie legate alle popolazioni del sangue e tali da risultare facilmente integrabili nella realizzazione di micro-dispositivi elettrici e magnetici per lo studio di dette patologie. Inoltre attualmente è di estremo interesso lo sviluppare tecniche di separazione delle cellule costituenti il sangue, ottenute realizzando dispositivi che con tecniche elettriche quali la Dielectrophoresis (DEP), e magnetiche quali la Magnetophoresis, siano in grado di analizzare le diverse componenti cellulari. L’applicazione di tecniche litografiche all’analisi del sangue appare pertanto un promettente campo di ricerca, per il quale è stato coniato il termine “Blood-on-a-chip” (Toner and Irimia, 2005).

Per quanto riguarda i globuli bianchi, in letteratura sono riportate misure di deformabilità con tecniche simili a quelle usate per i globuli rossi (ad esempio, aspirazione in micropipetta o centrifugazione su vetrini opportunamente rivestiti per consentire l’adesione delle cellule deformate dalle forze centrifughe (Brown et al., 2001)). Tuttavia, data la diversa funzione dei globuli bianchi l’attenzione si è concentrata sui processi di migrazione attraverso le barriere offerte dalle pareti dei vasi sanguigni, come le membrane basali delle cellule endoteliali e la matrice extracellulare, che sono essenziali per l’omeostasi e la risposta immunitaria (Springer, 1994; Butcher and Picker, 1996; Wei et al., 2003). La migrazione dal sangue ai tessuti richiede la rapida conversione della citoarchitettura dei linfociti da semirigida (adatta a proteggerli dai ripetuti stress idrodinamici e meccanici cui sono soggetti nella circolazione) ad altamente deformabile, poiché le cellule subiscono enormi modifiche di forma per penetrare i piccoli spazi tra le cellule endoteliali (Engelhardt B J Neural Transm. 2006). E' noto che in questo processo sono essenziali la contrattilità del sistema actina-miosina endocellulare, i microtubuli, e la vimentina costituente i filamenti intermedi (Nagayama M Exp Cell Res. 2004, Chardin P. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006 Carlier MF Curr Opin Cell Biol. 1991, Carpenter CL. Crit Care Med. 2000, Brown MJ J Immunol. 2001). Sebbene alcune informazioni sulla migrazione dei linfociti dai vasi ai tessuti siano note, si sa poco della modifica di citoarchitettura dei linfociti durante la migrazione dalla matrice extracellulare alla superficie epiteliale, né dell'espressione dei recettori che regolano il trafficking che favorisce il loro accumulo negli organi bersaglio, come la pelle e l'intestino. Il reclutamento dei leucociti circolanti dal sangue nei tessuti dipende da tre processi: l'adesione dei leucociti al lato luminale dei vasi sanguigni, la migrazione transendoteliale e la migrazione delle cellule nei tessuti. Questi processi sono controllati sia “outside-in” che “inside-out” da interazioni cellulari con le citochine e le molecole di adesione (Engelhardt B J Neural Transm. 2006).
Da un punto di vista patologico, in questo progetto la deformabilità leucocitaria verrà indagata con riferimento alla celiachia (MC), una patologia genetica molto frequente (Marsh Gastroenterology 1992) in cui un processo autoimmune nei confronti dell’autoantigene Transglutaminasi tissutale innesca una cascata di eventi. La celiachia è l’unica malattia autoimmune in cui e’ noto il fattore scatenante: la gliadina e i peptidi correlati. La celiachia gode inoltre di un ulteriore privilegio, quello di potersi avvalere dell’uso di modelli ex-.vivo in cui e’ stato possibile riprodurre la cinetica della risposta immune mucosale e quindi caratterizzarne in maniera dinamica gli eventi più significativi (Maiuri Gastroenterology 1996).
Nella celiachia l’attivazione T linfocitaria gioca un ruolo centrale. Diversi studi hanno chiarito alcuni aspetti del coinvolgimento delle cellule T in questi processi ma ancora non c’è una spiegazione definitiva di come le cellule infiammatorie causino danni solo nel soggetto celiaco. Sappiamo che due tipi di cellule popolano lo strato epiteliale superficiale della mucosa del piccolo intestino: gli enterociti ed i linfociti intarepiteliali (IEL). Ma solo alcuni subset di cellule T infiltrano l’epitelio di superficie e le modalità di ingresso di queste cellule, provenienti dai compartimenti mucosali subepiteliali nell’epitelio di superficie sono ignote. Per il recruitment di cellule T nell’epitelio di superficie, un ruolo chiave e’ svolto dalla IL-15, una citochina del compartimento innato del sistema immune, a controllo posttrascizionale, la cui espressione e’ specificamente indotta nel paziente celiaco da peptici della gliadina.
Non si conosce, ad oggi, la dinamica dei movimenti dei linfociti nella mucosa intestinale né quali modificazioni strutturali e funzionali subiscano nell’adattarsi alla convivenza con gli enterociti. Data la difficoltà di uno studio della mucosa in toto per questo particolare tipo di indagini, l’elaborazione di un modello in vitro in cui le componenti essenziali (enterociti e linfociti) possano interagire appare un importante obiettivo sperimentale.

Infine, per quanto riguarda le piastrine, evidenze cliniche ed osservazioni mirate in vitro indicano che, oltre a fattori biochimici, fenomeni di tipo meccanico hanno un ruolo determinante nel processo di deposizione sull’endotelio e nell’evoluzione verso la formazione di trombi. Tali fenomeni vengono comunemente e genericamente associati al processo di shearing (Kroll et al., 1996), senza entrare nel dettaglio di come si manifesti effettivamente sulla scala cellulare.
Viene generalmente ammesso che il comportamento meccanico (deformabilità) delle cellule determina la loro risposta alle sollecitazioni che sono quindi critiche per la mecanotrasduzione e per gli effetti risultanti a livello dei tessuti (Fung, 1990, Janmey, 1998). Il flusso stesso sottopone una larga parte della membrana cellulare alle sollecitazioni meccaniche che a loro volta possono indurre una risposta strutturale che coinvolge il riarrangiamento del citoscheletro all’interno della cellula (Cucina et al. 1995, Davies et al. 1994, Pavalko et al. 2001). In aggiunta sollecitazioni meccaniche in regioni localizzate delle cellule come integrine, selettine o caderine attivano una risposta strutturale mentre le sollecitazioni sono trasmesse attraverso la cellula dal citoscheletro (Maniotis et al. 1997, Wang et al. 2001).
Durante le ultime decadi è cresciuta la consapevolezza dell'importanza di guardare al sangue come un fluido complesso e si sono fatti significativi sforzi per chiarire il contributo delle diverse componenti alla patofisiologia di malattie vascolari. Ma apparentemente non sono state approfondite le implicazioni meccaniche di un flusso ‘granulare’, in particolare in termini di sollecitazioni trasferite fra cellule ematiche, oltre che da plasma a cellule.
Una forte correlazione fra la concentrazione di RBCs e la formazione di trombi è stata identificata da tempo (Turitto and Baumgartner, 1975; Turitto and Weiss, 1980), benché non sia stato definitivamente stabilito se l'effetto prevalente sia un aumento del flusso di piastrine verso l’endotelio a causa di una maggiore presenza di RBCs o se queste aumentino la reattività fra piastrine e cellule endoteliali o sia una combinazione di entrambi gli effetti. E’ comunque evidente la necessità di investigare i meccanismi di base della formazione dei trombi in condizione di flusso. A tale scopo sono stati negli anni sviluppati sistemi in vitro (Sakariassen et al., 2004) capaci di riprodurre condizioni di flusso controllate.
È ben noto che RBCs migrano verso il centro del vaso, lasciando una regione ricca di plasma e povera di RBCs vicino alle pareti (Goldsmith and Mason, 1965; Goldsmith, 1968). Attraverso questo meccanismo gli eritrociti possono espellere le piastrine dal centro della corrente verso le zone povere di globuli rossi vicino alla parete (Aarts et al. 1988). In aggiunta, la zona alla parete non è effettivamente estranea ad escursioni sino alla parete di RBC e leucociti, capaci di convogliare azioni meccaniche sull'endotelio e sulle piastrine adese (Bishop et al., 2004). Sembra perciò plausibile che i globuli rossi possano influenzare non solo l'arrivo delle piastrine alla superficie, ma anche il loro movimento superficiale e le modifiche morfologiche alla superficie. Anche nel caso delle piastrine, lo studio della deformabilità cellulare appare pertanto un’area promettente di ricerca per le possibili implicazioni fisiopatologiche. <<<