RICERCA ITALIANA     

Sintesi e caratterizzazione di ibridi organo-inorganici preparati con la tecnica sol-gel per la realizzazione di scaffolds per l'ingegneria dei tessuti craniofacciali.

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

La pratica clinica odontoiatrica e maxillofacciale odierna è in gran parte basata su terapie convenzionali che utilizzano materiali estranei al corpo del paziente.
In contrasto con i materiali convenzionali, l’ingegneria tissutale è un campo interdisciplinare che applica i principi dell’ingegneria e delle scienze della vita allo sviluppo di sostituti biologici che ripristinino, mantengano, o migliorino la funzione di un tessuto o un intero organo. In ambito craniofacciale, l’approccio di ingegneria tissutale si basa sul principio che le cellule staminali mesenchimali sono potenzialmente in grado di generare tutte le strutture craniofacciali. Di solito, scaffolds biomimetici sono necessari per garantire la crescita cellulare e la genesi dei tessuti. Lo scaffold, oltre a incoraggiare processi biologici quali la produzione di matrice extra-cellulare e la vascolarizzazione, ha anche un'importante funzione strutturale governata da una biomeccanica programmata. La progettazione di uno scaffold per la rigenerazione guidata di un tessuto richiede inevitabilmente un approccio multidisciplinare. Le unità operative coinvolte nel progetto di ricerca collaborano da diverso tempo nella progettazione di nuovi materiali per applicazioni biomediche, nella caratterizzazione meccanica e di biocompatibilità, nella simulazione al calcolatore e nell’utilizzo di tecniche avanzate di imaging non distruttive.
Lo scopo del nostro progetto è produrre e caratterizzare nuovi materiali ibridi organo-inorganici da utilizzare per la realizzazione di scaffold per l’ingegneria dell’osso e della dentina.
La possibilità di realizzare substrati, dispositivi o scaffold mediante compositi a matrice polimerica rinforzati con componente inorganica bioattiva è di cruciale importanza per l'ingegneria dei tessuti duri. I materiali ibridi organo-iorganici, sintetizzati dall’unità DIAM-SUN con la tecnica sol-gel, avranno due tipi di matrici inorganiche, Zirconio e Titanio, mentre la parte organica per entrambi i sistemi sarà rappresentata da un poliestere biodegradabile quale il poli-epsilon-caprolattone (PCL). Il PCL è, infatti, un polimero biocompatibile e biodegradabile ampiamente utilizzato nel settore biomedico. Il TiO2 e la ZrO2 sono invece materiali che permettono di rinforzare la matrice polimerica conferendo al composito proprietà meccaniche compatibili con quelle dei tessuti duri. Per realizzare solidi tridimensionali a partire dalle polveri ibride si è sviluppato un processo di compressione a caldo che permette la coalescenza delle polveri.
Il progetto di ricerca sarà articolato in tre fasi. Nella prima i materiali saranno sintetizzati dall’unità DIAM-SUN che ne studierà con tecniche reologiche la cinetica di gelazione, al fine di individuare il tempo e la tecnica per iniziare l'essiccazione degli stessi. Le polveri saranno processate dall’unità IMCB-CNR attraverso una tecnica di compressione a caldo che ne permette la coalescenza.
Nella seconda fase, i campioni ottenuti saranno analizzati dalle unità operative per valutare le proprietà chimiche, morfologiche, meccaniche e biologiche.
I risultati ottenuti da tutte le unità operative durante la fase 2 permetteranno di determinare le migliori condizioni e la selezione di due formulazioni di materiali, uno basato su PCL/TiO2 e l’altro basato su PCL/ZrO2, usato dall’unità IMCB-CNR per realizzare strutture tridimensionali porose (scaffolds) con la tecnica salt-leaching. Questi scaffold a forma di disco poroso saranno successivamente distribuiti fra le unità operative per le caratterizzazioni meccaniche, chimico-fisiche e biologiche.
Gli scaffolds saranno inoculati con cellule staminali di midollo osseo (BMSSCs) e di polpa dentaria (DPSCs), allo scopo di determinare la loro capacità di permettere l’adesione, la proliferazione e la differenziane cellulare.
Inoltre, lo studio non–invasivo tramite micro-tomografia a raggi X e la simulazione matematica con il metodo degli elementi finiti saranno effettuati sia sui campioni standard allo scopo di caratterizzare le proprietà e la struttura dei materiali (fase 2) sia sugli scaffolds 3D allo scopo di determinare la distribuzione delle porosità e il comportamento biomeccanico. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Sandro Rengo Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo del Progetto di Ricerca è studiare, progettare e realizzare materiali per scaffolds e carriers da utilizzare nell’ingegneria dei tessuti duri. Tale progetto permetterà di realizzare substrati, dispositivi o scalffods, mediante compositi o ibridi a matrice polimerica rinforzati con componenti inorganica bioattiva.
L’obiettivo finale è la caratterizzazione completa degli scaffolds prodotti fino alla fase di ricerca “in vivo”.

In particolare i seguenti obiettivi saranno il riferimento per la verifica dei risultati raggiunti:
-Scelta della tecnica di sintesi da utilizzare in modo da ottenere materiali vetrosi e ibridi organo-inorganici da utilizzare nel campo dell’ingegneria tissutale.
-Studio della cinetica di gelazione e tecniche di essiccazione degli stessi.
-Caratterizzazione chimica e dei materiali ottenuti.
-Determinazione delle migliori condizioni di processo di compattazione a caldo di polveri bioibride per la rigenerazione dei tessuti duri con particolare riferimento a polveri a base di biossido di titanio oppure biossido di zirconio.
- Individuazione di due formulazioni, una a base di biossido di titanio e l’altra a base di biossido di zirconio, che meglio soddisfino i requisiti biomeccanici che deve possedere i materiali dedicati alla realizzazione di uno scaffold per tessuti duri quale l’osso.
-Determinazione delle migliori formulazioni e processo relativi all’aggiunta di una fase di sale alle polveri selezionate per ottenere materiali macro-porosi tramite tecnica di salt leaching.
- Valutazione della biocompatibilità di tutte le formulazioni dei materiali sintetizzati dall’unità DIAM-SUN e processati dall’unità IMCB-CNR.
- Caratterizzazione dell’utilizzo degli scaffolds per l’ingegneria tissutale mediata da cellule staminali mesenchimali adulte.
-Ottimizzazione degli scaffolds per quanto riguarda le proprietà strutturali, in particolare la porosità. L'ottimizzazione va intesa nel senso che è necessario trovare un valore di porosità di compromesso fra proprietà di trasporto ottimali e proprietà meccaniche adeguate.
-Il progetto inoltre servirà da base per lo sviluppo di un modello di crescita in grado di descrivere la produzione di nuova matrice extracellulare mineralizzata all'interno dello scaffold in funzione del tempo, dei carichi esterni applicati e dell'efficienza del trasporto dei nutrienti. <<<

Risultati parziali attesi

Materiali ibridi organo-inorganici ottenuti nella fase 1 e caratterizzati nella fase 2.
I materiali ibridi organo-iorganici ottenuti con la tecnica sol-gel, possono essere usati per vari scopi. Infatti, oltre che per realizzare scaffolds, scopo principale del presente progetto, i materiali sintetizzati potranno anche essere utilizzati in tecniche di rigenerazione combinate con rilascio controllato di farmaci, in quanto è possibile incorporare in essi molecole quali fattori di crescita o farmaci antibiotici e antinfiammatori. La tecnica sol-gel ci permettere di modificare infatti le caratteristiche macroscopiche dei materiali agendo durante la sintesi ossia microscopicamente.
I materiali preparati con tale tecnica offrono anche il vantaggio di essere, oltre che ottenuti sottoforma di polveri di varie granulometria anche deposti utilizzando spin o dip coater come substrato su altri materiali. La deposizione di strati sottili ha il vantaggio di ottenere materiali con svariate forme e dimensioni parametro molto importante per le varie esigenze mediche.

Scaffolds per ingegneria tissutale realizzati nella fase 3.
In seguito alla selezione di due formulazioni di materiali ibridi organo-inorganici, una a base di biossido di titanio e l’altra a base di biossido di zirconio, otterremo, tramite la tecnica del salt-leaching, scaffold porosi da utilizzarsi nell’ingegneria dei tessuti duri.
Allo scopo di raggiungere l’obiettivo finale della realizzazione di scaffolds con le migliori proprietà meccaniche e che supportino al meglio le funzioni cellulari, la ricerca porterà a:
-Sviluppare modelli teorico-sperimentali di comportamento biomeccanico di materiali ottenuti mediante tecnica sol-gel e compattati a caldo. Questi risultati hanno una triplice interesse: fornire maggiori conoscenze sulle proprietà dei biomateriali in esame, fornire linee guida sulle condizioni di processo ottimali e permettere la selezione di due formulazioni più idonee per la rigenerazione dell’osso.
-Sviluppare modelli teorico-sperimentali di comportamento biomeccanico degli scaffolds. Questi risultati oltre o fornire informazioni circa le proprietà e le migliori condizioni di processo, sono anche estremamente importanti per definire l’architettura macroporosa degli scaffold in modo da consentire l’interazione cellula-materiale nel costrutto in maniera tridimensionale.

Rilevanza clinica e sociale
La perdita di tessuti craniofacciali, causata da anomalie congenite, traumi e patologie, è considerata uno dei maggiori problemi di salute a causa dell’alto impatto non solo sull’aspetto, ma anche sulla qualità della vita, in particolare sull’abilità masticatoria, una funzione che è frequentemente data per scontato prima che sia perduta. Circa 1,600,000 innesti ossei vengono effettuati ogni anno per rigenerare la quota ossea perduta a causa di traumi e patologie; di questi il 6% (96,000) avvengono nel distretto craniofacciale. Queste metodiche sono basate sull’innesto di osso autologo, innesti allogenici devitalizzati e l’uso di biomateriali osteoconduttivi naturali e sintetici. L’innesto osseo autologo è limitato dalla quantità di osso che può essere ottenuto e dalla morbilità di un sito donatore, mentre l’osso allogenico spesso viene rapidamente riassorbito.
È chiaro che nuove tecniche sono necessarie per riabilitare in maniera maggiormente predicibile la funzione e la forma, in particolar modo nel distretto cranio facciale, e nuove possibilità sono offerte dall’ingegneria dei tessuti, che si può avvalere di scaffolds o carrier che supportino le funzioni cellulari. Questa ricerca fornirà un consistente avanzamento nella realizzazione e caratterizzazione degli scaffolds in materiali ibridi organo-inorganici, con potenziali ricadute cliniche nel campo di tutta l’odontoiatria rigenerativa e della medicina rigenerativa dell’osso. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

“Ingegneria tissutale” è una dizione generica per una serie di metodi grazie ai quali, il tessuto perduto come risultato di un trauma o patologia, potrebbe essere ripristinato. È possibile utilizzare solo cellule (come nel caso del trapianto del midollo osseo), ma per la ricostruzione dentale e craniofacciale sono più frequentemente utilizzate cellule in combinazione con appropriati scaffolds e carriers (1).
Negli ultimi anni, la ricerca sulle cellule staminali mesenchimali postnatali adulte è diventata un campo eccitante e produttivo. Ricavare cellule dal paziente stesso riduce al minimo i costi per l’ottenimento, ed evita le implicazioni di ambito legale ed etico. Sia il tessuto connettivo di supporto del midollo osseo, sia la polpa dentaria contengono popolazioni di cellule staminali stromali, chiamate rispettivamente BMSSCs e DPSCs. Queste linee cellulari hanno un alto potenziale proliferativo capace di rigenerare i rispettivi microambienti con notevole fedeltà, incluse le strutture mineralizzate circostanti di osso e dentina (2,3).
Solitamente, sono necessari scaffolds biomimetici temporanei per facilitare la crescita cellulare e la genesi dei tessuti.
Lo scaffold oltre a incoraggiare processi biologici quali la produzione di matrice extra-cellulare e vascolarizzazione ha anche un'importante funzione strutturale governata da una biomeccanica programmata. Uno scaffold progettato per la rigenerazione di un tessuto duro, infatti, deve inizialmente sostenere i cimenti meccanici che si trasmettono attraverso i tessuti con cui confina. Questa funzione biomeccanica deve essere gradualmente trasferita nel tempo al tessuto in via di rigenerazione (4,5).
La natura del biomateriale (da utilizzare) è stata oggetto di studi numerosi. Sono stati proposti differenti materiali come metalli, ceramiche, vetro, polimeri sintetizzati chimicamente, polimeri naturali e combinazioni di questi materiali a formare compositi (6,7,8).
Gli ibridi organo.inorganici si prospettano come un'alternativa per ottenere materiali con caratteristiche innovative. La sintesi di tali materiali ha lo scopo di eliminare gli svantaggi connessi all'utilizzo dei singoli componenti quali i polimeri e i ceramici. Nel caso dei polimeri, accanto ai vantaggi rappresentati dalla bassa densità, alta tenacità e quindi facili da lavorare, abbiamo anche svantaggi associati alla bassa resistenza meccanica e alla degradazione Gli ibridi organo-inorganici, sono materiali bifasici, le cui proprietà non sono, la somma dei singoli costituenti, ma si registra un largo effetto sinergico, vengono definiti tali, materiali in cui la distanza tra i domini è inferiore a 400 nm.
In particolare, i materiali a matrice polimerica (9) come il policaprolattone (PCL) rinforzati con biossido di titanio (TiO2) oppure zirconia (ZrO2) sono particolarmente promettenti per la realizzazione di scaffolds per tessuti duri. Il PCL è infatti un polimero biocompatibile e biodegradabile ampiamente utilizzato nel settore biomedico (9). Il TiO2 (10) e la ZrO2 (11) sono invece materiali biocompatibili che permettono di rinforzare la matrice polimerica conferendo al composito proprietà meccaniche compatibili con quelle dei tessuti duri (12). In particolare il biossido di titanio ha anche una riconosciuta capacità di incoraggiare la produzione e la deposizione di matrice ossea. Per questo motivo materiali ibridi a base di PCL/TiO2 e PCL/ZrO2 sono ottimi candidati per la realizzazione di dispositivi e/o scaffolds per la rigenerazione dei tessuti mineralizzati (9,10).
I materiali organici, generalmente, sono termicamente instabili, quindi per la sintesi degli ibridi organo-inorganici, sono necessarie basse temperature; il metodo che ci permette di soddisfare questa necessità è il metodo sol-gel. Materiali ibridi a base di PCL/TiO2 e PCL/ZrO2 possono, infatti, essere facilmente realizzati mediante la tecnica del sol-gel (10,13).
Con sol-gel si indica una sospensione colloidale in grado di solidificare formando un gel. Tale tecnica è caratterizzata da una serie di reazioni di idrolisi e di polimerizzazione. Il prodotto poroso ottenuto viene purificato chimicamente e scaldato ad alte temperature, formando ossidi di elevata purezza. Essiccando il gel a basse temperature è possibile ottenere matrici solide porose chiamate xerogel.
La macinazione del vetro ottenuto permette di ottenere polveri molto fini che rappresentano gli ingredienti per il processo di formatura. La compressione a caldo rappresenta un processo di riferimento per ottenere la compattazione delle polveri ibride. Le opportune condizioni di processo (pressione e temperatura) permettono di ottenere la coalescenza delle polveri ibride mentre lo stampo ne determina la forma (10).
Questi materiali una volta applicati hanno la capacità di determinare una microporosità grazie alla degradazione del PCL (9). Tuttavia è noto che la microporosità non è sufficiente a garantire un processo di rigenerazione guidata tramite scaffold. Per questo motivo in un secondo stadio del progetto (secondo anno) ai materiali selezionati durante il primo anno sarà aggiunta una fase di sale per permettere la creazione di una macroporosità (dimensioni medie superiori a 100 micrometri). Tale tecnica è nota come salt leaching (14,15). Le proprietà meccaniche di dispositivi e scaffold per tessuti duri sono di particolare importanza perché i tessuti mineralizzati hanno proprietà strutturali; sostenere un cimento meccanico (peso corporeo o carichi che si sviluppano durante la masticazione) e trasmettere questi cimenti ai tessuti circostanti sono le primarie funzioni biomeccaniche dei tessuti mineralizzati e dei materiali sintetici progettati per sostituire tali tessuti (10,12,14,15) Le proprietà meccaniche di tessuti e materiali sintetici possono essere misurate attraverso prove della meccanica classica (prove di compressione, flessione, etc.) oppure prove di micro-meccanica. Il vantaggio delle prove micro-meccaniche è quello di richiedere provini di piccole dimensioni per misurare proprietà locali.
Per ottenere informazioni 3D sulla struttura interna del materiale a livello microscopicoè possibile utilizzare la microtomografia a raggi X 3D non-invasiva, che contribuisce ad una migliore comprensione dei requisiti biologi e, quindi, ad una migliore realizzazione del disegno ingegneristico per le necessità dell’ingegneria tissutale. L’accuratezza della micro CT per i materiali degli scaffolds è stata testata in numerosi studi (16). È chiaro che la microCT sta diventando un metodo standard nel determinare le proprietà fisiche e strutturali degli scaffolds ed è un prezioso strumento per supportare le nuove tecnologie di fabbricazione.
I risultati meccanici sperimentali, i risultati relativi all'architettura ottenuta mediante microtomografia ed i risultati di rigidezza possono essere utilizzati per la modellazione meccanica dello scaffold mediante simulazioni numeriche. Tali attività, infatti, consentono di simulare preventivamente (anche prima della realizzazione) le condizioni di esercizio del componente in opera. Queste, infatti, possono essere riprodotte con molta difficoltà mediante prove sperimentali, per cui l'analisi numerica è probabilmente l'unica possibilità per ottimizzare il disegno del componente senza la realizzazione di costosi prototipi (17). Fra i metodi numerici utilizzabili per le simulazioni meccaniche il Metodo agli Elementi Finiti (FEM) riveste un ruolo di primaria importanza, soprattutto in virtù della sua generalità e della sua applicabilità anche a geometrie complesse, tipiche dell'ambiente biologico, grazie proprio alla scomposizione della geometria effettiva in elementi "semplici" (18). Il metodo agli elementi finiti, infatti, viene comunemente utilizzato per modellare il comportamento meccanico dei tessuti naturali e dei loro possibili sostituti (17,19). Un aspetto di grande interesse scientifico, inoltre, è la modellazione della crescita ossea all'interno dello scaffold. A partire dai lavori di Cowin (20), si è sviluppata una fiorente attività di ricerca, soprattutto verso la comprensione dei meccanismi di influenza dello stato tensionale (mechanotransduction) (21), e la relativa modellazione (22,23). Tali modelli, in linea di principio, possono essere applicati, opportunamente corretti, anche nel caso degli scaffold, oggetto della presente proposta (24).


Riferimenti bibliografici
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