RICERCA ITALIANA     

Nuove strategie nell’approccio alle malattie respiratorie: differenziamento epiteliale e vascolare dopo somministrazione di cellule staminali nella riparazione del danno polmonare da iperossia in modello animale.

Università degli Studi di Padova

Abstract

Introduzione. La conoscenza delle capacità di replicazione e differenziamento nell’albero respiratorio è ancora limitata, così risulta in gran parte inesplorato il potenziale terapeutico in questo apparato. Il presente progetto muove dalla necessità di valutazione in vivo dell’efficacia terapeutica delle cellule staminali, e di possibili ulteriori innovazioni terapeutiche per il danno polmonare.
Il glomo carotideo è coinvolto nella regolazione del respiro ed un suo ruolo è stato ipotizzato in alcune condizioni patologiche caratterizzate da anomala risposta ventilatoria all'ipossia, quali la sindrome della morte improvvisa del lattante
Scopo. Valutare l’efficacia terapeutica delle cellule staminali sia native, che differenziate e modificate geneticamente nella riparazione del danno polmonare sperimentale. Parallelamente si vuole valutare nel glomo carotideo di ratto gli effetti dell'esposizione all'iperossia durante le prime settimane di vita
postnatale
Materiale e metodi. Implementazione di un modello sperimentale animale (ratto) di danno polmonare (Decreto N. 173/2006-B del 4.12.2006 AUTORIZZAZIONE). Nel corso degli esperimenti cellule staminali saranno isolate dal liquido amniotico di ratte gravide (rat amniotic fluid stem cells, rAFSC) ed espanse in vitro. Le staminali saranno poi iniettate endovena o veicolate via endotracheale in animali (controlli e affetti da pneumopatia sperimentale) per verificarne l’homing” e il potenziale differenziativo e riparativo. Provenendo da ratti transgenici esprimenti in modo costituzionale la proteina marcatore Green Fluorescent Protein (GFP) le cellule rAFS saranno iniettate e identificate, mediante analisi tessutale con microscopia a fluorescenza. Il seguito del progetto prevede l’impiego di ratti immunodepressi, utilizzando cellule staminali del fluido amniotico di origine umana (hAFS) allo scopo di valutarne l’homing e l’engraftment polmonare.
Parallelamente alla fase in vivo, il progetto prevede lo studio in vitro delle capacità differenziative di cellule hAFS in progenitori delle cellule alveolari, e delle cellule endoteliali, utilizzando anche tecniche di trasferimento genico. Le cellule saranno transdotte in vitro con vettori adenovirali o chimerici adeno-retrovirali esprimenti sequenze geniche di proteine marcatrici e di differenziamento, e saranno poi iniettate nell’animale. L’espressione di queste proteine sarà valutata a livello dell’epitelio respiratorio e dell’albero vascolare degli animali con tecniche immunoistochimiche, di visione diretta con microscopia ottica a fluorescenza e di biologia molecolare. La pneumopatia sarà ottenuta mediante esposizione degli animali all’iperossia, tramite OXYCYCLER (modello A84XOV Biospherix, USA), già in funzione presso lo stabulario del Dipartimento di Anatomia e Fisiologia. L’effetto lesivo dell’ossigeno rende il quadro respiratorio simile alla pneumopatia cronica del pretermine e alla displasia broncopolmonare, la cui patogenesi si colloca nell’arresto di sviluppo dell’albero respiratorio, barotrauma, O2 tossicità, oltre che in una nutrita serie di fattori intrinseci ed estrinseci all’albero respiratorio.
Lo studio del glomo carotideo sarà prevalentemente focalizzato sulle modificazioni morfologiche e sulle modificazioni nel contenuto di neurotrasmettitori/neuromodulatori, recettori e proteine coinvolte nella trasduzione del segnale. I principali obiettivi dello studio saranno l'identificazione di modificazioni nel glomo carotideo ascrivibili all'iperossia e che potrebbero essere alla base di
alterazioni funzionali del glomo, con possibili implicazioni in condizioni cliniche quali la sindrome della morte improvvisa del lattante. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Raffaele De Caro Università degli Studi di PADOVA

Obiettivo del Programma di Ricerca

1. Valutazione dell’homing e differenziazione delle staminali somministrate nella citoarchitettura dell’albero respiratorio.
2. Valutazione degli effetti collaterali della somministrazione delle cellule (neoplasia, rigetto, assenza di homing, ecc.). In particolare sarà valutata la capacità differenziativa di specifiche linee cellulari (CD 133+, hAFS, rAFS).
3. Ruolo dell’angigenesi e dei fattori angiogenetici, durante lo sviluppo alveolare normale, lesione e riparazione.
4. Identificazione di modificazioni nel glomo carotideo ascrivibili all'iperossia e che potrebbero essere alla base di alterazioni funzionali del glomo, con possibili implicazioni in condizioni cliniche quali la sindrome della morte improvvisa del lattante. <<<

Risultati parziali attesi

Disponibilità di un modello animale che per versatilità e poliedricità di sperimentazione consente l’indagine nell’ambito delle più frequenti patologie respiratorie, di carattere sia malformativo o genetico, che lesionale, e neoplastico.
Dato l’esteso campo di applicazione ne segue un’elevato interesse da parte di operatori/ricercatori di svariate discipline sia in campo clinico che sperimentale, e sia nelle aree di competenza medica, che chirurgica. La patologia respiratoria, a cui principalmente fa riferimento il progetto, presenta attualmente una compagine terapeutica ancora in gran parte palliativa e/o sintomatica, comunque non sostitutiva. Quindi detto programma offre una base operativa per un approccio medico rigenerativo e/o risolutivo, come da trattamento attraverso trapianto, terapia cellulare e terapia genica.
Il progetto permette l’applicazione di tecnologie innovative sia genetiche che cellulari, ma anche immunologiche e farmacologiche oltre i confini dell’area laboratoristica, consentendo una applicazione in vivo mirata e guidata da ricercatori specialisti in settori di ricerca all’avanguardia.
Il carico di patologia respiratoria nello scenario mondiale ha visto crescere l’incidenza dell’asma, della displasia broncopolmonare e un miglioramento delle tecniche diagnostiche, ivi inclusa la fibrosi cistica (Chernick V &amp; Mellins RB, 2004). La genetica molecolare, l’ingegneria genetica e anche le tecniche di terapia sostitutiva con surfattante naturale o sintetico hanno permesso un notevole avanzamento terapeutico, diagnostico, ma ancora non un approccio risolutivo al problema. L’obiettivo del programma è valutare le possibilità terapeutiche delle cellule staminali native o ingegnerizzate, nella malattia respiratoria sia neonatale che pediatrica ed adulta, ovvero sia congenita che acquisita
E’ possibile che le dibattute questioni etiche inerenti la manipolazione di cellule staminali fetali risultino minimizzate ancorche’ non completamente superate dalla possibilita’ di ottenere campioni durante la normale diagnostica prenatale (Fauza D, 2004).
Dallo studio dello sviluppo dei glomi carotidei ci si attendono informazioni sullo sviluppo dell’organizzazione del glomo durante il primo periodo postnatale (paragone tra I due gruppi controllo) ed in merito a possibili alterazioni dovute all’iperossia (paragone tra casi e controlli). Inoltre le colorazioni istologiche e lo studio immunoistochimico con anticorpi anti-S100 e –NSE forniranno informazioni sulle percentuali dei vari tipi cellulari nelle diverse casistiche. E’ stato suggerito che l’iperossia può alterare la crescita del glomo carotideo inibendo la proliferazione cellulare durante lo sviluppo postnatale (Wang and Bisgard, 2005). Pertanto ci si può aspettare una minore cellularità nei glomi carotidei dei ratti esposti all’iperossia ed in particolare una minore percentuale di cellule di I tipo. Lo studio immunoistochimico con anticorpi anti-tirosina idrossilasi, -dopamina idrossilasi, -colina acetiltransferasi e NO sintasi nei due gruppi di controllo fornirà informazioni sullo sviluppo postnatale dei sistemi di sintesi dei più importanti neurotrasmettitori, ossia la dopamina, la noradrenalina, l’acetilcolina ed il NO. Le comparazioni tra casi e controlli saranno finalizzati a rilevare se l’iperossia postnatale può alterare la sintesi di questi neurotrasmettitori , dal momento che è noto che un aumento delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) ha una varietà di effetti tra I quali l’inattivazione di enzimi e l’inibizione della sintesi di proteine (Frank, 1991). Le cellule del glomo carotideo sono caratterizzate dall’espressione e dal rilascio di molti neurotrasmettitori e neuromodulatori differenti. Pertanto si è programmato di analizzare una serie di neuromodulatori adenosina, met- and leu-encefaline, neuropeptide Y, CGRP, galanina, endoteline, bombesina, adrenomedullina, neurotensina) e recettori (D2 dopaminergici, muscarinici, ?2 adrenergici, 5HT2A serotoninergici, GABAB, P2Y1 purinergici and A2A adenosinergici). Studi immunoistochimici e di ibridazione in situ hanno mostrato un’aumentata espressione di neuropeptide Y ed una ridotta espressione di tirosina idrossilasi, e dei recettori per i cannabinoidi di tipo 1 e per la dopamina di tipo 2 (Oomori et al., 1991; Sterni et al., 1995). In uno dei nostri studi è stata identificata, mediante immunoistochimica ed immunofluorescenza, un’aumentata espressione di adrenomedullina in soggetti adulti rispetto a feti di 21-25 settimane (Porzionato et al., 2006).
Pertanto ci si può aspettare di trovare che anche altri neuromodulatori/neurotrasmettitori e recettori presentano una espressione regolata in base allo sviluppo. Inoltre dovrà essere analizzato l’effetto dell’iperossia sull’espressione di tali proteine. I dati desunti dall’immunofluoirescenza doppia, che sarà utilizzata soprattutto nella seconda parte del programma di ricerca, sarà finalizzata a confermare la localizzazione cellulare della positività. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La pneumopatia neonatale (broncodisplasia,BPD) colpisce il 20-40% dei neonati pretermine. La disponibilità di un modello sperimentale viene avvalorata dal nuovo paradigma terapeutico rappresentato dall’utilizzo e dibattito sulle cellule staminali e la terapia genica. La colonizzazione di tessuti solidi e l’identificazione con marcatura consente di studiare l’homing, l’engraftment e la differenziazione alveolare (Kotton DN, et al. 2001; Krause DS, et al. 2001; Neuringer IP, 2004). L’ingegnerizzazione e la visualizzazione dell’homing polmonare, dopo trapianto di midollo (Grove J, et al. 2002; Theise, et al. 2002; Suratt, et al. 2003) ha finora consentito un certo ottimismo nelle nuove e crescenti possibilità terapeutiche. Tuttavia dati più recenti hanno dimostrato che le cellule staminali ematopoietiche purificate o midollari non sembrano contribuire alla riparazione e alla transdifferenziazione in cellule epiteliali polmonari (Chang JC, et al. 2005; Kotton DN, et al. 2005). L’isolamento di cellule staminali embrionali sembra promettente, evidenziandone, in particolari condizioni di coltura ed espansione, le capacita’ differenziative in progenitori di cellule epiteliari alveolari di tipo II (Rippon HJ et al, 2006; Van Vranken BE et al, 2005; Bishop AE et al 2006). Recentemente si è evidenziato come il liquido amniotico possa rappresentare una fonte di cellule staminali pluripotenti (Fauza D, 2004), infatti le cellule staminali del fluido amniotico (hAFS) hanno dimostrato potenzialita’ differenziativa in cellule miogeniche, neuronali, osteogeniche ed epatiche (De Coppi , et al. 2007). Attualmente i modelli sperimentali di danno polmonare jatrogeno, includono la somministrazione di bleomicina endotracheale (Goto H, et al.2004; Ortiz LA, et al. 2003) o l’esposizione ad iperossia (Jankov R, et al. 2003; Belik J, et al. 2005). In generale l’esposizione a concentrazioni differenziate di ossigeno altera il polmone in vario modo: emorragia, edema, ridotta compliance polmonare. A paragone dell’adulto il modello animale neonatale presenta ridotta sintesi di DNA, ridotta crescita del polmone, ridotta alveolarizzazione e displasia vascolare. Dopo un’esposizione di circa 6 giorni nel ratto neonato si verificano alterazioni polmonari che risultano reversibili dopo 2 settimane rispetto ai controlli (Jankov RP, 2003). L’arresto maturativo altera l’alveolarizzazione e la vascolarizzazione così, per esposizione prolungata ad O2, può esservi un’obliterazione vascolare che riduce il rapporto tra la componente vascolare e quella alveolare (Burri PH, 1974; Shaffer SG, et al. 1987; Frank L, 1987). L’eziologia della displasia broncopolmonare, pur molteplice, focalizza nel danno da iperossia il meccanismo di lesione polmonare (Bonikos DS, et al. 1976; Kinnula VL, et al. 1995). Nel ratto l’alveolarizzazione secondaria rappresenta un processo di sepimentazione di alveoli primari, con attivazione massimale tra 3 e 8 gg postnatali e completamento verso il 14° g. (Meyrick B, 1982; Thurlbeck WM, 1975). Un’esposizione al 95% del ratto neonato permette un arresto maturativo omogeneo e della sintesi di DNA (Jankov RP, et al. 2003), mentre al 65% per 14 giorni, si ottiene nel ratto neonato un quadro più polimorfo e simile al danno BPD del neonato: aree di arresto dell’alveolarizzazione (Auten RL, et al. 2001) si alternano ad aree di ispessimento interstiziale e di sintesi del DNA (Jankov RP, et al. 2001; Christou H, 2005). Una crescente attenzione viene oggi rivolta alla vascolarità polmonare, riconoscendo un’alterazione sia del fattore endoteliale di crescita vascolare (VEGFridotto nella BPD), sia una alterazione nell’invio di segnale dall’epitelio alveolare nella giustapposizione vascolare capillare (Thebaud, 2007). Come nella patologia respiratoria cronica dell’adulto (Fadini , et al. 2006), le cellule progenitrici endoteliali risulterebbero ridotte nella BPD. La componente vascolare stimolata da VEGF o supportata da EPCs merita di essere oggetto di indagine. Risulta ancora da studiare come interagiscano le cellule polmonari distali (i.e.alveolari, endoteliali e miofibroblasti); una possibile teoria è che la driving force spinga i setti verso l’interno dell’alveolo, una simile pressione sarebbe esercitata per la crescita settale, oltre all’elastina e al platelet-derived growth factor A, all’esterno dell’alveolo dai capillari alveolari, per una azione di erezione capillare, in analogia all’azione svolta dai capillari polmonari nella fase di transizione dalla vita fetale a quella neonatale. Una funzione che verrà poi esercitata durante la normale alveolarizzazione e che consente il mantenimento della struttura alveolare, nella vita. Sulla base di tale ipotesi, una difettosa e carente angiogenesi impedirebbe una normale alveolarizzazione, quindi favorendo lo sviluppo delle lesioni BPD (Thébaud B, 2007).
Il glomo carotideo è coinvolto nella regolazione del respiro ed un suo ruolo è stato ipotizzato in alcune condizioni patologiche caratterizzate da una risposta ventilatoria anomala alla ipossia, come nella Sindrome della Morte Improvvisa del Lattante (Porzionato et al., In press). E' costituito da lobuli organizzati in clusters contenenti cellule appartenenti a due popolazioni cellulari separate: cellule di I tipo, separate a loro volta in cellule chiare, scure e picnotiche, e cellule di II tipo, localizzate ai margini dei clusters cellulari. Il glomo carotideo non contribuisce alla regolazione della respirazione durante la vita fetale, nonostante la presenza di livelli ipossici di 25 torr, e la sua attività non è necessaria per l'insorgenza del ritmo respiratorio della nascita. Nel successivo periodo postnatale si sviluppa un graduale aumento della chemosensibilità all'ipossia, con l'innalzamento della soglia ipossica a 55 torr ed un aumento dell'inclinazione della curva di risposta allo stimolo ipossico. Alcuni cambiamenti cellulari e molecolari associati all'aumento postnatale della chemosensibilità ipossica sono stati identificati in una maggiore densità dei canali per il potassio, un
maggiore aumento dei livelli intracellulari di calcio in risposta all'ipossia e modificazioni nel contenuto dei neurotrasmettitori. Studi immunoistochimici e di ibridazione in situ hanno mostrato un'aumentata espressione di neuropeptide Y ed una ridotta espressione di tirosina idrossilasi, e dei recettori per i cannabinoidi di tipo 1 e per la dopamina di tipo 2. In uno dei nostri studi è stata identificata, mediante immunoistochimica ed immunofluorescenza, un'aumentata espressione di adrenomedullina in soggetti adulti rispetto a feti di 21-25 settimane (Porzionato et al., 2006). E' stato riportato in letteratura che fattori ambientali possono influenzare il normale sviluppo del sistema di controllo respiratorio. L'ossigeno perinatale gioca un
ruolo nello sviluppo del ritmo respiratorio di base e della risposta ventilatoria all'ipossia. L'iperossia attenua la risposta ventilatoria ipossica attraverso modificazioni potenzialmente irreversibili del glomo carotideo. Nel complesso sembra che un range relativamente stretto di ossigeno ambientale sia necessario per il normale sviluppo postnatale del controllo respiratorio. Nei ratti, si è evidenziato che l'esposizione ad iperossia (30-60%) durante la finestra critica di sviluppo
postnatale riduce significativamente la risposta ventilatoria acuta all'ipossia, misurata all'età di 4-6 mesi (Ling et al., 1996, 1997; Bavis et al., 2002, 2003, 2004). A differenza che nel neonato, il medesimo grado di iperossia negli adulti non comporta una alterazione della risposta ventilatoria all'ipossia (Ling et al., 1996, 1997). La finestra di sviluppo sembra chiudersi dopo la seconda settimana di vita poichè l'esposizione all'iperossia per 1 settimana altera la risposta ventilatoria all'ipossia dell'adulto solo se si verifica durante le prime 1 o 2 settimane di vita (Bavis et al., 2002; Erickson et al., 1998). Lo studio del collegamento tra l'elevata ossiemia e l'alterata funzione del glomo carotideo è solo all'inizio (Bavis et al., 2005). L'iperossia può alterare la crescita del glomo carotideo inibendo la proliferazione cellulare durante lo sviluppo postnatale (Wang and Bisgard, 2005) o può influnezare direttamente o indirettamente la sensibilità all'ossigeno (per esempio, canali ionici) o la sintesi ed il rilascio di neurotrasmettitori (Bavis et al., 2005). <<<