RICERCA ITALIANA     

Studio dei meccanismi di citotossicità e genotossicità di nanoparticelle di silice e silicati fibrosi nanometrici con dimensioni, struttura e composizione strettamente controllate.

Università degli Studi di Torino

Abstract

Benchè si preveda che l’esposizione a nanoparticelle (NP) e nanofibre (NF), accidentale (durante la produzione industriale) o intenzionale (per lo sviluppo di nuovi strumenti nanotecnologici), aumenti costantemente, poco si conosce circa i possibili effetti dei nanomateriali finemente suddivisi sulla salute. Poichè le dimensioni nanometriche possono conferire a un materiale proprietà fisiche, chimiche e biologiche molto differenti, occorre predisporre con urgenza strumenti e metodologie per una valutazione del potenziale rischio derivante dall’esposizione a NP e NF: essa richiede una sperimentazione con particolati in cui siano strettamente controllati dimensioni, composizione chimica, superficie specifica e stato di aggregazione e siano caratterizzate le proprietà chimico-fisiche note per evocare una risposta patogena.
L’esposizione alla silice cristallina (in particolare quarzo) può causare fibrosi e tumori polmonari e malattie autoimmuni, ma è quasi del tutto ignoto quale sia la patogenicità relativa delle NP rispetto alle microparticelle e se tra i due tipi di materiali esistano differenze di modalità di ingresso, interazione con i tessuti, reattività superficiale e meccanismi di citotossicità. Non ci sono evidenze sufficienti che la silice amorfa (non cristallina) causi danni alla salute se non una flogosi polmonare reversibile in animali trattati per via inalatoria. Non è tuttavia escluso che a livello nanometrico anche le forme amorfe possano risultare patogene. La cristallinità inoltre è solo uno dei parametri coinvolti nel diverso comportamento tra silice cristallina e amorfa: la reattività di superficie, la morfologia ed il livello di contaminanti sono molto differenti. Gli esperimenti in vitro e in vivo devono paragonare gli effetti di NP di silice amorfa e cristallina e non, come talvolta avviene, microparticelle cristalline con NP amorfe. I campioni di quarzo possono variare molto in forma, dimensioni e proprietà di superficie delle particelle a seconda della sua origine e del contatto con altri materiali durante la sua formazione, modificandone drasticamente le caratteristiche di pericolosità. Purtroppo in molti lavori la variabilità delle caratteristiche superficiali della silice cristallina, che è causa della diversa patogenicità di polveri di silice di diversa origine, viene spesso ignorata per mancanza di un completo approccio multidisciplinare. Analogamente, mentre la patogenicità delle microfibre dei silicati fibrosi, come l’asbesto, è ben nota, non ci sono evidenze circa la relativa tossicità di NF generate dalla loro degradazione o fagocitosi.
Questo progetto di ricerca si propone di chiarire il ruolo della relazione struttura/tossicità dei materiali nanostrutturati a base di silice, indagando il ruolo della reattività di superficie e gli effetti biologici di NP sintetiche di silice cristallina e amorfa e di NF sintetiche di crisotilo asbesto, aventi proprietà e caratteristiche di superficie strettamente controllate e modificabili in maniera indipendente. Questo obiettivo verrà perseguito confrontando particelle nano- e micrometriche con caratteristiche chimiche simili e studiandone la correlazione tra caratteristiche fisico-chimiche (dimensioni, cristallinità, idrofilia/idrofobia e contenuto in metalli di materiali sintetici a base di silice) e la loro a) reattività di superficie, generazione di radicali liberi, rilascio di ioni metallici, b) capacità di indurre stress ossidativo, reazione infiammatoria, citotossicità, genotossicità e transizione epitelio-mesenchimale in colture cellulari e in vivo, e trasformazione cellulare in vitro, c) capacità di attraversare la barriera epitelio-endoteliale sia in modelli in vitro che in vivo. Verrà inoltre indagata la possibilità di diffusione sistemica delle particelle dal polmone ad alcuni organi a distanza, quali il fegato, di ratti esposti, quantificando i possibili danni agli epatociti. Questo progetto sarà condotto in stretta cooperazione tra gruppi di ricerca aventi competenze differenti e complementari per quanto riguarda la sintesi (UO Politecnico, UO Bologna), la caratterizzazione di proprietà fisico-chimiche dei particolati (UO Politecnico, UO Bologna), la loro reattività di superficie (UO Scansetti), nonché lo studio dei loro effetti biologici: danno ossidativo (UO Scansetti, UO Pisa), innesco di reazioni infiammatorie, citotossicità, alterazione della permeabilità di monostrati epiteliali (UO Parma), transizione epitelio-mesenchimale (UO Scansetti), genotossicità e trasformazione cellulare (UO Pisa), tossicità in vivo su invertebrati (Eisenia andrei, UO Bologna) e vertebrati (ratto, UO Scansetti). <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Dario Ghigo Università degli Studi di TORINO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Al fine di chiarire il ruolo della relazione struttura/tossicità di nanoparticelle (NP) e nanofibre (NF) a base di silicio, è importante investigare la reattività di superficie e gli effetti biologici di materiali nanometrici aventi dimensioni, struttura e composizione strettamente controllate e che possano essere modificate in maniera indipendente tra loro, e paragonare le loro proprietà a quelle di materiali omologhi di dimensioni micrometriche. Questa necessità è particolarmente importante quando si studiano particolati a base di silicio, che sono caratterizzati da un grande polimorfismo per quanto riguarda la composizione chimica e la reattività di superficie. La maggior parte degli studi condotti sui loro effetti tossici è stata finora eseguita su materiali complessi non caratterizzati chimicamente e spesso differenti tra loro per diverse proprietà, rendendo così difficile correlare gli effetti biologici delle polveri e fibre con specifiche caratteristiche dei materiali investigati. Un altro aspetto, spesso trascurato, da considerare nella comparazione degli effetti di nano- e micro-particolati è la notevole differenza dell’area di superficie dei due tipi di materiali a parità di massa: poiché la loro interazione con le biomolecole è un fenomeno di superficie, è necessario correlare gli effetti tossici dei particolati con la loro area complessiva. Inoltre occorre monitorare l’eventuale aggregazione dei nanoparticolati durante lo studio. Le NP tendono ad agglomerare (forze di Van der Waals) e successivamente ad aggregare (legami chimici tra particelle): più piccole sono le particelle, maggiori sono le forze interparticellari. Questo fenomeno è molto importante poichè NP aggregate si comportano in maniera differente da quelle isolate. Quando l’agglomerazione evolve in aggregazione, le NP possono perdere le loro peculiari caratteristiche. Questo aspetto è spesso trascurato negli esperimenti con NP. Cariche di superficie, idrofobicità e adsorbimento di biomolecole dal mezzo circostante sono i maggiori responsabili di questi fenomeni. Pertanto è importante controllare se e in che misura le NP aggregano sia in vitro che in vivo. Infine, ogni effetto in vitro e in vivo delle NP dovrebbe essere correlato alla loro localizzazione intracellulare.
Alcuni importanti quesiti riguardanti materiali a base di Si sono tuttora senza risposta:
1) le dimensioni nanometriche modificano il comportamento chimico e la tossicità della silice cristallina e dei silicati fibrosi?
2) le differenze tra silice amorfa e cristallina persistono quando hanno entrambe dimensioni nanometriche? In caso affermativo, quali altri fattori (reattività di superficie, metalli contaminanti, idrofobia, etc.), oltre alla cristallinità, sono coinvolti nel potenziale patogeno delle NP di silice e sono responsabili delle differenze di tossicità tra silice amorfa e cristallina?
3) le NF di asbesto, la cui presenza nell’ambiente è presumibilmente più alta di quella delle microfibre, si comportano in maniera differente dalle fibre otticamente visibili quando entrano in contatto con cellule di mammifero?
Questo progetto di ricerca si propone di:
a) sintetizzare NP di silice e NF di silicato (crisotilo) e microparticelle omologhe, aventi caratteristiche standardizzate e controllate (dimensioni, struttura, composizione chimica, contenuto in metalli, morfologia, cristallinità, idrofobia, area e carica di superficie, stato di aggregazione);
b) correlare queste proprietà con la reattività chimica e la cito- e genotossicità dei particolati in modelli sperimentali cell-free, in vitro e in vivo; gli effetti biologici verranno anche investigati sugli stessi materiali in cui ognuna delle sopra menzionate proprietà verrà modificata singolarmente, al fine di chiarire il meccanismo di azione delle polveri a base di Si e ottenere una sufficiente valutazione del rischio dell’esposizione umana a nanomateriali a base di Si, che al momento non esiste;
c) individuare la localizzazione intracellulare di NP e NF, e correlarla alle loro differenti caratteristiche chimicofisiche ed agli effetti biologici;
d) definire, se possibile, test ottimali di analisi di laboratorio finalizzati a consentire uno screening della potenziale tossicità di questi ed altri nanomateriali.
Conseguire questi obiettivi è possibile solo grazie alla collaborazione stretta e interdisciplinare tra gruppi di ricerca che includano chimici, biochimici, genetisti e patologi, in grado da un lato di sintetizzare set di particolati con differenti caratteristiche chimico-fisiche controllate, ottenuti dallo stesso tipo di materiale, e dall’altro lato in grado di effettuare un ampio spettro di test di cito- e genotossicità, sia in vivo che in vitro. Le 5 unità operative (UO) che afferiscono a questo progetto (UO Scansetti dell’Università di Torino, UO Politecnico di Torino, UO Università di Bologna, UO Università di Parma, UO Università di Pisa) ritengono di possedere le competenze differenti e complementari necessarie alla buona riuscita del progetto. Le UO sopra menzionate hanno già avuto in passato una attiva collaborazione, e la maggior parte dei materiali e metodi menzionati nel progetto è stata ampiamente testata dalle UO. Ogni UO renderà disponibili alle altre i seguenti materiali e tipi cellulari.
MATERIALI
Particelle di silice aventi diametro da 50 nm a 1 µm, con struttura cristallina e amorfa (densa, porosa, mesoporosa), saranno preparate dall’UO Politecnico. Fibre di crisotilo sintetico verranno preparate dall’UO Bologna: esse hanno una morfologia tubulare (cavità interna 7 nm, parete esterna 7 nm) e possono formare strutture concentriche con uno spessore di parete multiplo di 7 nm, fino a raggiungere 50 nm di spessore, e lunghezza 100 nm-5 µm. Saranno anche testati nanocristalli di lizardite, aventi medesima composizione del crisotilo ma differente morfologia. Tutti i materiali sopra citati saranno modificati dalle rispettive UO, mediante doping con metalli, in particolare Fe, Cu e Al, che rappresentano i metalli più spesso trovati come contaminanti delle silici naturali.
MODELLI SPERIMENTALI.
Nel presente studio verranno usati i seguenti tipi cellulari: cellule epiteliali polmonari umane A549 e CaLu-3, macrofagi alveolari murini MH-S, macrofagi murini RAW264.7, monociti/macrofagi umani THP-1, fibroblasti di polmone umano HFL-1, fibroblasti murini Balb/3T3, cellule endoteliali da vena ombelicale umana (HUVEC), cellule endoteliali da aorta umana (HAEC). Dopo una prima fase di test preliminari condotti su tutti i tipi cellulari menzionati, i test successivi verranno effettuati su quelli che offriranno i risultati più riproducibili nei laboratori delle diverse UO.
Per i test di tossicità in vivo verranno utilizzati il lombrico Eisenia andrei e il ratto, come modelli di bersagli appartenenti rispettivamente agli invertebrati e vertebrati. E.andrei è raccomandato dall'OCSE (Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico) come bioindicatore per valutare la qualità del suolo e l’impatto di sostanze tossiche al suo interno. <<<

Risultati parziali attesi

Alcuni importanti quesiti riguardanti materiali a base di Si sono tuttora senza risposta:
1) le dimensioni nanometriche modificano il comportamento chimico e la tossicità della silice cristallina e dei silicati fibrosi?
2) le differenze tra silice amorfa e cristallina persistono quando hanno entrambe dimensioni nanometriche? in caso affermativo, quali altri fattori (reattività di superficie, metalli contaminanti, idrofobia, etc.), oltre alla cristallinità, sono coinvolti nel potenziale patogeno delle NP di silice e sono responsabili delle differenze di tossicità tra silice amorfa e cristallina?
3) le NF di asbesto, la cui presenza nell’ambiente è presumibilmente più alta di quella delle microfibre, si comportano in maniera differente dalle fibre otticamente visibili quando entrano in contatto con cellule di mammifero?

Ci si aspetta che lo svolgimento della ricerca proposta fornisca risposte ai sopra menzionati quesiti e, più in particolare, porti al conseguimento dei seguenti risultati:

1) Accertamento della citotossicità e genotossicità di NP/NF a base di Si. Sarà valutata la reattività di superficie di NP/NF, e in vari tipi cellulari saranno determinati lo stress ossidativo da esse indotto, modificazioni di vitalità, attività proliferativa e morte cellulare, il potenziale proinfiammatorio, la capacità di indurre trasformazione cellulare, danni al DNA e cromosomici, e transizione epitelio-mesenchimale. Gli effetti saranno confrontati con quelli riscontrati dopo esposizione a materiali micrometrici di composizione analoga. I risultati attesi chiariranno se i NM di silice hanno gli stessi effetti degli analoghi di dimensioni maggiori.
L’integrazione delle informazioni raccolte con quelle provenienti dalle UO Polito e Bologna fornirà gli elementi per la definizione di relazioni quantitative fra struttura ed attività (QSAR) per i NM di silice. Poiché uno dei punti di forza del progetto è costituito dalla disponibilità di materiali particolati ben caratterizzati da un punto di vista chimico-fisico, i risultati rappresenteranno un significativo avanzamento delle conoscenze nel campo della nanotossicologia.

2) Definizione delle conseguenze funzionali dell’esposizione di cellule monocito-macrofagiche a NM di silice. Queste cellule rappresentano i bersagli principali della tossicità da particelle micrometriche di silice. La definizione delle conseguenze della loro esposizione a NM di silice riveste quindi una notevole importanza. I principali avanzamenti attesi da questi esperimenti sono a) accertare se l’interazione causi un’attivazione macrofagica, con rilascio di citochine pro-infiammatorie (TNF-a, IL-1b, IL-6); b) accertare se l’interazione coinvolga, come nel caso delle particelle micrometriche, i recettori dell’immunità innata ed, in particolare, i recettori scavenger SR-A e MARCO; c) valutare se l’interazione attivi la produzione di NO, inducendo NOS2 ed il trasportatore NOS-correlato CAT2B. Particolare rilievo assumerà, in questo contesto, la possibilità di confrontare modelli murini ed umani (ad es., macrofagi alveolari umani); d) accertare, nelle stesse cellule e nelle medesime condizioni, l’induzione di arginasi I, un enzima caratteristico delle modalità di attivazione alternativa dei macrofagi, di cui è nota la possibile induzione da parte di particelle micrometriche di silice cristallina; e) accertare se l’esposizione a NM di silice attivi la produzione di TGF-b, una citochina implicata nella progressione del danno verso la fibrosi.
I risultati attesi potranno chiarire se l’esposizione a NM di silice induca una classica attivazione macrofagica di tipo infiammatorio e se alterazioni delle funzioni macrofagiche possano essere alla base degli effetti dei NM di silice in vivo.

3) Definizione delle conseguenze funzionali dell’esposizione di cellule epiteliali di epitelio respiratorio a NM a base di Si. Oltre alla produzione di citochine e all’espressione di geni coinvolti nella risposta infiammatoria, verrà valutata l'espressione della proteina delle cellule di Clara (CC16), una proteina antiinfiammatoria prodotta dall'epitelio respiratorio che costituisce un importante marker di danno epiteliale polmonare in vivo. Finora non risulta che tale parametro sia stato valutato in studi di tossicologia in vitro. L’impiego di questo biomarcatore contribuirà a fornire informazioni di rilievo sui meccanismi implicati nella tossicità riscontrata in vivo. Inoltre, nel caso che variazioni di CC16 siano riscontrate effettivamente, sarà possibile correlare questo significativo indicatore, sinora utilizzato solo in studi in vivo, con alterazioni prodotte in vitro.

4) Definizione delle conseguenze funzionali dell’esposizione di cellule endoteliali a NM di silice. Esperienze preliminari condotte dalla UO Parma indicano che le cellule endoteliali in coltura sono estremamente sensibili ad una esposizione diretta a NP carboniose (multiwalled carbon nanotubes) evidenziando una significativa citotossicità. I risultati attesi potranno chiarire se i fenomeni di attivazione e disfunzione endoteliale riscontrati in vivo dopo esposizione a NP non silicee rappresentino risposte stereotipate o relativamente specifiche in rapporto alla classe di NM testati e quali siano i possibili meccanismi coinvolti.

5) Valutazione delle conseguenze dell’esposizione a NM di silice sulle proprietà di barriera dell’epitelio respiratorio in vitro. L’approccio proposto consentirà di rispondere ad un quesito di particolare rilievo. Se, cioè, l’esposizione a NM di silice è in grado di modificare la permeabilità paracellulare dell’epitelio respiratorio. La barriera epiteliale rappresenta un importante fattore limitante per l’azione di tossici e patogeni e modificazioni di tale funzione sono riscontrate in corso di patologie di tipo infiammatorio. Se i NM di silice (od alcuni tipi particolari di NM) modificassero sensibilmente le funzioni di barriera, verrebbe a determinarsi un importante co-fattore di patologia in vivo. Le informazioni raccolte in questa sezione dello studio potranno, quindi, non solo rivestire una notevole importanza culturale ma anche portare all’individuazione di situazioni in cui è possibile attendersi effetti sinergici tra esposizione a NM e particolari stati fisiopatologici.

6) Accertamento e valutazione quantitativa del passaggio trans-epiteliale dei NM di silice. Come nel caso di altri NM, è possibile che NM a base di silice abbiano una permeabilità elevata attraverso la barriera emato-respiratoria. Dato che l’assorbimento polmonare costituisce un fattore limitante per l’accesso dei NM agli altri compartimenti dell’organismo, una elevata permeabilità è un importante presupposto per gli effetti extrapolmonari dei NM. Misurare direttamente la permeabilità trans-epiteliale dei NM di silice in sistemi controllati in vitro è il primo passo per capire i meccanismi coinvolti (probabilmente non canonici, cioè non riconducibili all’attività di trasportatori o di funzioni regolate di membrana) e per identificare le caratteristiche strutturali dei NM che influenzano la velocità di traslocazione.

7) Fornire un set esaustivo di silici modello (quarzo nanocristallino, nanoparticelle di silice amorfa densa e porosa) da prendere in considerazione per lo studio sistematico della tossicità della silice, soprattutto quella amorfa, di cui ancora poco è noto. Quest’ultimo argomento è di notevole interesse scientifico ed applicativo, soprattutto in vista di applicazioni di silici amorfe in campo bio-medico, in particolare silici a mesoporosità controllata come sistemi host-guest per il rilascio controllato di farmaci e come rivestimenti bioattivi di impianti.

8) Proporre il crisotilo sintetico stechiometrico come standard di riferimento (controllo negativo) negli studi riguardanti la tossicità degli asbesti e dei nanoparticolati fibrosi, e anche come bianco di riferimento nella valutazione dell’effetto tossico di opportuni ioni droganti che possono venire sostituiti al Si e/o al Mg nella struttura cristallina del crisotilo.

9) Dati sperimentali recenti ottenuti dall’UO Scansetti in cellule MH-S mostrano che NF di crisotilo sintetico drogate con Fe inducono rotture del DNA e lipoperossidazione e provocano il rilascio di LDH, come il crisotilo naturale ed al contrario del crisotilo sintetico Fe-privo. Abbiamo anche evidenze che la tossicità del Fe associato alle fibre è molto maggiore di quella di un’analoga quantità di Fe contenuto nel FeNTA, un complesso di Fe permeante le cellule, anche quando il FeNTA è somministrato alle cellule insieme al crisotilo Fe-privo. Questo suggerisce che il crisotilo contenente Fe non è tossico agendo semplicemente come carrier del Fe nella cellula, ma che l’attività redox del Fe è potenziata quando è organizzata alla superficie delle fibre in specifici siti cristallografici aventi stati di coordinazione in grado di attivare la generazione di radicali liberi. Solo un’indagine interdisciplinare come quella consentita da questo consorzio di UO potrà consentire di determinare più chiaramente la tipologia dei siti reattivi di superficie delle NF associati all’alterazione del metabolismo redox intracellulare. Sarà inoltre possibile valutare se altri metalli, come il Cu e l’Al, esercitano effetti simili a quelli del Fe.

10) Dati ottenuti in passato dall’UO Scansetti hanno evidenziato che parte dello stress ossidativo indotto da fibre di asbesto (crocidolite, amosite, crisotilo) è conseguenza non della generazione diretta di ROS, ma della inibizione del PPP e del suo enzima chiave G6PD, portando quindi all’inattivazione di una delle principali difese antiossidanti della cellula: pertanto, oltre che favorire la produzione di ROS, le fibre di asbesto potrebbero esercitare uno stress ossidativo riducendo la capacità delle cellule di neutralizzare i ROS quotidianamente prodotti nel corso del normale metabolismo cellulare (pari circa all’1-2% dell’O2 consumato). Dati preliminari ottenuti dall’UO Scansetti suggeriscono che anche il quarzo ha lo stesso effetto e che anche cellule non macrofagiche (quali le cellule epiteliali ed i fibroblasti) possono produrre ROS in presenza di particolati a base di silice, senza richiedere l’attivazione di un “burst” ossidativo. Sarà importante valutare se le NP di silice condividono questa caratteristica con omologhe microparticelle.

11) Finora sono relativamente limitati gli studi sullo sviluppo di sistemi di screening per la valutazione del rischio di particelle o fibre di dimensioni nanometriche. Si sta pertanto lavorando per identificare un set di saggi di tossicità da applicare ai nanomateriali .Dal confronto dei dati di citotossicità e genotossicità ottenuti, sarà possibile l’identificazione degli endpoint più significativi e delle linee cellulari più rappresentative, che potranno essere proposti come standard per lo screening di nanomateriali particolati e fibrosi, sia in vitro, sia in vivo.

12) La caratterizzazione di questi modelli cellulari potrà fornire un contributo alla valutazione del rischio e della gestione dei dati nei confronti di esposizioni lavorative a nanomateriali a base di silice.

13) Definizione della natura delle interazioni proteina-nanofibra attraverso misure integrate di analisi termica e pirolitica. Lo studio della stabilità termica dell’albumina isolata e in presenza di fibre di crisotilo a diverse concentrazione e composizione attraverso misure TGA e DSC fornirà informazioni quantitative importanti sull’entità delle forze di interazione proteina-nanocristalli. L’identificazione e la distribuzione dei prodotti di degradazione termica tramite pirolisi analitica permetterà di fare considerazioni sulle unità aminoacidiche coinvolte nel legame con la NF.

14) Acquisizione di nuove conoscenze sugli effetti tossici in vivo ed in vitro associati alle NF in invertebrati utilizzati nel biomonitoraggio dell’inquinamento (E.andrei). La risposta di diversi bioindicatori alla presenza di NF con composizione e dimensioni note può fornire indicazioni utili sul meccansimo di interazione a livello fisiologico. In particolare, il confronto tra la tossicità delle fibre pure e drogate con metalli potrà dare informazioni sul ruolo svolto dalla composizione elementare. Ad esempio, un aumento di lipofuscine può essere associato allo stress ossidativo, mentre un aumento di metallotioneine alla contaminazione da metalli di transizione. L’individuazione di eventuali indicatori biologici sensibili alla presenza di NF potrà gettare le basi per studi futuri sul biomonitoraggio dei nanomateriali in generale, di importanza fondamentale nella previsione di un impatto ambientale associato al loro crescente utilizzo. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L’esposizione ambientale alle nanoparticelle (NP) è aumentata enormemente negli ultimi anni, a causa di varie attività antropiche, incluso lo sviluppo della nanotecnologia, che manipolando materiali di dimensioni quasi atomiche (1-100 nm) crea nuove strutture e dispositivi [1-3]. I nanomateriali possono essere inalati, ingeriti, assorbiti attraverso la pelle, in maniera accidentale durante la produzione industriale, o in seguito al loro uso intenzionale come mezzi di indagine di processi biomolecolari e come strumenti di diagnosi e terapia in medicina [4]. A fronte delle promettenti prospettive della nanotecnologia, poco si è fatto finora per valutarne i possibili effetti indesiderati [1,5]. Infatti, quando le dimensioni di un materiale sono nanometriche, le sue proprietà fisiche, chimiche e biologiche possono diventare molto differenti da quelle originali [4,6]: le NP possono esibire una differente reattività e tossicità e raggiungere i tessuti attraverso vie differenti [1]. Per esempio, NP di carbonio possono raggiungere il cervello attraverso il nervo olfattivo e NP di varia composizione sono in grado di entrare nei mitocondri e alterare il metabolismo redox [1]. Determinare i rischi dell’uso di NP è prioritario, a causa delle crescenti applicazioni industriali dei nanomateriali e dell’alta probabilità dell’uomo di esservi esposto, direttamente o attraverso l’ambiente [1]. Poichè sta crescendo l’allarme sui rischi potenziali delle NP per la salute umana [7], l’urgenza di fornire un’adeguata valutazione del rischio è giustificata non solo per prevenire l’insorgenza di nuove malattie, ma anche per prevenire timori ingiustificati che potrebbero ostacolare l’impiego di nanomateriali utili [1].
La silice (SiO2) può essere cristallina o amorfa, naturale (quarzo, tridimite, cristobalite) o sintetica. La superficie della SiO2 è un oggetto "indefinito", eterogeneo e influenzato dalla sua storia termica e meccanica: vi sono zone idrofile (SiOH vicinali) e idrofobe (SiOH isolati e ponti silossanici), oltre a gruppi reattivi (radicali SiO), generati per macinazione e/o impurezze metalliche [15].
Il quarzo è altamente citotossico, potendo causare fibrosi polmonare e malattie autoimmuni, ed è classificato dalla IARC come cancerogeno umano di classe 1 [8]. L’esposizione alla SiO2 cristallina avviene in un’ampia gamma di attività industriali (scavi in miniera, lavorazione di metalli, minerali e carbone, etc.), ma è ignoto quale sia la relativa patogenicità delle NP di SiO2 verso quelle micrometriche. Le NP di SiO2 cristallina possono esercitare effetti citotossici differenti da quelli di microparticelle di uguale composizione [4] e potrebbero passare attraverso la parete alveolare raggiungendo altri tessuti. E’ stato suggerito che certe NP inalate possano sfuggire alla sorveglianza dei macrofagi alveolari e passare attraverso l’epitelio nell’interstizio polmonare [1,9], ma è ignoto se le NP di SiO2 si comportino allo stesso modo. Una singola iniezione sottocutanea di SiO2 cristallina in topi e criceti “nudi” può indurre cirrosi e carcinomi epatici [10], ma non è stato valutato l’eventuale passaggio di NP nel sangue e il loro ruolo nel danno tessutale. I pochi studi disponibili mostrano che le NP di SiO2 possono causare la clusterizzazione di topoisomerasi I nel nucleo, indurre una reazione infiammatoria nell’endotelio e provocare fibrogenesi in ratti Wistar, ma siamo ancora lontani da una completa conoscenza dei loro effetti tossici nei mammiferi e dei relativi meccanismi [11]. Non ci sono evidenze sufficienti circa i rischi causati alla salute dalla SiO2 amorfa (non cristallina): l’inalazione di SiO2 amorfa sintetica in animali provoca un’infiammazione reversibile, ma non fibrosi progressiva, dei polmoni [12,13]. Ma la cristallinità non è la sola differenza tra SiO2cristallina e amorfa: la composizione chimica e la reattività di superficie sono molto differenti; inoltre la grande maggioranza di esperimenti condotti in vitro e in vivo paragona la tossicità di NP di SiO2 amorfa con quella di microparticelle di SiO2 cristallina. Il rischio dell’esposizione al quarzo non è un’entità costante ma può variare molto a seconda della sua origine e del contatto con altri materiali durante la sua complessa formazione. I campioni di quarzo possono variare molto in forma, dimensioni e proprietà di superficie delle particelle (idrofilia, radicali e metalli di superficie, etc.) [14,15]. Purtroppo in molti lavori sperimentali lo spiccato polimorfismo della SiO2 cristallina viene ignorato, e le cause della diversa patogenicità di polveri di SiO2 di diversa origine sono ancora ignote [8].
Le nanofibre (NF) hanno almeno due dimensioni &lt; 100 nm [4]. Il Si può formare silicati fibrosi come l’asbesto: mentre la patogenicità di fibre micrometriche di asbesto è ben nota, non ci sono evidenze circa la relativa tossicità di NF generate dalla degradazione o dalla fagocitosi dell’asbesto.
Sia la SiO2 microcristallina che le fibre di crisotilo micrometriche sono note indurre uno stress ossidativo nelle cellule, e il loro contenuto in Fe è ritenuto uno dei principali responsabili di questo evento [20]. Non esistono informazioni circa la capacità di NP e NF a base di Si di provocare alterazioni del metabolismo redox. Fibre di crisotilo, prive di Fe e altri metalli contaminanti, sono state recentemente sintetizzate dall’UO Bologna, con struttura, morfologia e composizione stechiometrica ben definite [16,17]. L’UO Scansetti ha osservato che le fibre di crisotilo sintetico, al contrario di quello naturale della Rhodesia (UICC A), non sono citotossiche e non inducono stress ossidativo in cellule epiteliali polmonari umane [18], ma se sono drogate con quantità controllate di Fe (0,5-2% w/w) esse manifestano gli stessi effetti tossici osservati con il crisotilo UICC A [19]: da questi esperimenti emerge il dato interessante che il crisotilo non è tossico semplicemente perchè veicola il Fe dentro le cellule, ma che l’attività redox del Fe è potenziata quando esso è organizzato sulla superficie delle fibre in siti cristallografici specifici aventi stati di coordinazione in grado di attivare la generazione di radicali liberi [19]. Come si modifichi la reattività del Fe e di altri metalli alla superficie di NF di crisotilo non è ancora noto, così come non ci sono ancora informazioni circa la reattività redox di NP di SiO2, prive o contaminate da metalli.
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