RICERCA ITALIANA     

Cellule Staminali Cardiache Umane e loro potenziale rigenerativo

Università degli Studi "Magna Graecia" di Catanzaro

Abstract

L’obiettivo di questa proposta di studio è quello di raggiungere una migliore comprensione della biologia e del potenziale rigenerativo sia in vivo sia in vitro delle cellule staminali cardiache umane (hCSC), al fine di designare protocolli migliori riguardanti la rigenerazione del miocardio contrattile dopo infarto mediante il trapianto autologo di CSC e/o attraverso l’attivazione in situ di queste cellule. Tale scopo è basato sulla recente identificazione di una popolazione di piccole cellule con fenotipo, comportamento e potenziale rigenerativo proprio di CSC. Queste cellule sono distribuite all’interno degli atri e dei ventricoli del miocardio di mammiferi adulti e anziani. Le CSCs sono clonogeniche, capaci di auto-propagarsi e multipotenti. La loro esistenza ha consentito di spiegare la presenza di una sottopopolazione di miociti immaturi in ciclo nel miocardio adulto, dando una nuova visione sull’omeostasi cardiaca in cui la morte e la rigenerazione miocitaria rappresentano due facce della stessa medaglia.
Questi risultati hanno non solo cambiano il dogma per il quale il cuore è un organo terminalmente differenziato, ma hanno consentito di collocarlo tra altri organi dotati di potenziale rigenerativo nonostante il miocardio funzionante sia prevalentemente costituito da cellule terminalmente differenziate. Inoltre, la scoperta delle CSC ha aperto nuovi orizzonti per il trattamento delle patologie cardiache secondarie alla perdita di massa miocardica contrattile. Infatti, è possibile sfruttare il potenziale rigenerativo endogeno di tali cellule al fine di sostituire la perdita di tessuto muscolare mediante la rigenerazione di miocardio funzionale autologo. Sebbene la rigenerazione miocardica mediante il trapianto di CSC, e mediante l’attivazione in situ con fattori di crescita, sia stata effettivamente dimostrata in modelli animali di piccola e grande taglia, è necessario acquisire una migliore comprensione della biologia e del potenziale rigenerativo delle CSC umane prima di poter applicare queste conoscenze in maniera sicura in trials clinici sull’uomo.
È necessario definire la migliore sorgente di queste cellule cercando di capire se il fenotipo cellulare possa essere influenzato dal sito dal quale vengono prelevate. In aggiunta, è necessario comprendere i processi regolatori che stanno alla base della capacità di self-renewal di tali cellule e della loro differenziazione verso le linee cellulari alle quali sono in grado di dare origine.
Le CSC provenienti dal miocardio adulto sono multipotenti, e danno origine in vivo e in vitro a miociti e cellule vascolari. Ciò evidenzia una importante differenza fra lo sviluppo embrionale e fetale del cuore da un lato e la rigenerazione del miocardio adulto dall’altro. Nei mammiferi, lo sviluppo e la morfogenesi delle camere cardiache sono sotto il controllo di processi genetici camera-specifici. Dunque, è opportuno comprendere se queste differenze si riflettono sul programma genetico regolatorio e sul tipo di progenie cellulare che deriva dalle hCSCs e se, inoltre, a scopo rigenerativo, tali cellule siano tra loro intercambiabili.
Le cellule staminali adulte, come le cellule staminali embrionali, dovrebbero essere capaci di auto-propagarsi all’infinito. La maggior parte di queste cellule esprimono le telomerasi, enzimi in grado di rigenerare la lunghezza dei telomeri dopo ogni replicazione cellulare e perciò in grado di prevenire la “senescenza replicativa”. Tuttavia, le cellule staminali ematopoietiche (HSC) hanno una durata di vita limitata e sviluppano un fenotipo senescente.
Sorprendentemente, in vivo, anche le CSC sono suscettibili a questo processo di invecchiamento, caratterizzato dall’espressione di p16INKa4, dall’ accorciamento dei telomeri, dall’uscita dal ciclo cellulare e dall’aumento dell’apoptosi. L’invecchiamento delle CSC è accelerato da una moltitudine di fattori stressanti tra i quali il sovraccarico di lavoro, l’ischemia acuta e cronica in aggiunta all’età.
In maniera importante, per il gruppo dei pazienti più probabilmente candidati alla terapia rigenerativa con hCSCs autologhe, =50% delle loro CSCs possono essere senescenti e incapaci di partecipare al processo rigenerativo.
Per questa ragione è imperativo determinare se il potenziale rigenerativo di una particolare popolazione di hCSCs sia determinato esclusivamente dal numero di CSC non senescenti o se la qualità di quelle funzionali sia comunque subottimale a causa del deterioramento secondario all’azione di agenti stressanti. Abbiamo la necessità di capire come il processo di invecchiamento delle CSCs sia effettivamente regolato, al fine di ritardarlo e/o revertirlo.
Infine, per meglio determinare la probabilità che gli schemi terapeutici descritti in questo studio siano in grado di produrre nuovo miocardio, dobbiamo capire quali meccanismi inducono le hCSC a scegliere tra la self-renewal e la possibilità di differenziarsi in una delle linee cellulari miocardiche. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Daniele Torella Università degli Studi "Magna Graecia" di CATANZARO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Per raggiungere i nostri scopi, perseguiremo 4 specifici obiettivi. I primi due obiettivi riguardano gli aspetti descrittivi della crescita, della self-renewal e dei parametri della differenziazione miocardica delle cellule staminali cardiache umane (hCSCs) in base alla camera cardiaca d’origine ed all’età del paziente. Andremo, quindi, ad indagare i meccanismi regolatori della self-renewal e differenziazione delle hCSCs. Infine, analizzeremo il programma genetico responsabile dell’instaurarsi di un fenotipo senescente delle hCSCs, valutando la sua reversibilità e la possibilità di ripristinare il potenziale di crescita e differenziazione di queste cellule “adulte”.

Obiettivo specifico 1 – Caratterizzare e comparare la crescita, la differenziazione e la multipotenzialità delle CSCs umane isolate da ciascuna delle quattro camere cardiache e determinare se esse sono interscambiabili o se hanno differenti caratteristiche dipendenti dalla camera di origine.
Più specificamente, caratterizzeremo le hCSCs isolate da ciascuna camera del miocardio umano adulto valutando la positività per specifici geni rappresentativi del programma evolutivo di ciascuna delle camere, per esempio Tbx5, Isl1, HAND1, HAND2. In seguito valuteremo il potenziale di crescita e di differenziazione delle hCSCs isolate dalle diverse camere cardiache utilizzando saggi di clonogenicità, formazione di cardiosfere, proliferazione cellulare e multipotenza. A questo punto verrà valutata la multipotenza delle hCSCs di ciascuna camera cardiaca mediante un modello in vivo di infarto-rigenerazione in cuori di ratti nu/nu. In questo Obiettivo Specifico determineremo, inoltre, se il pattern di espressione genica dei cardiomiociti generati dalle hCSCs nel cuore umano normale e patologico ripercorre l’ontogenesi o se è comune a tutte le hCSCs indipendentemente dalla camera di origine.

Obiettivo specifico 2 – Determinare se l’età del donatore compromette il potenziale di crescita e differenziazione delle hCSCs.
In questo specifico obiettivo determineremo in che misura le proprietà delle hCSCs sono influenzate dall’età del donatore. Inizieremo col valutare la frazione di hCSCs senescenti in campioni di miocardio prelevati da soggetti giovani, adulti e anziani sia maschi che femmine e in campioni prelevati da pazienti con cardiopatia ischemica. Queste informazioni saranno ottenute valutando la positività delle hCSCs per p16INK4a, p14 e fosfoSer15-p53, utilizzando indagini immunoistochimiche. Quindi, valuteremo l’esistenza di una progressiva perdita del potenziale di differenziazione e self-renewal delle hCSCs ciclanti in risposta all’invecchiamento e/o a stimoli patologici. In altre parole, le hCSCs ciclanti subiscono una progressiva compromissione della loro capacità di differenziazione e di self-renewal prima di acquisire un fenotipo adulto e uscire dal pool di cellule ciclanti? Questa informazione sarà ottenuta mediante saggi in vitro e modelli di rigenerazione miocardica in vivo. Inoltre, per valutare se il fenotipo senescente delle hCSCs adulte è direttamente correlato alla storia replicativa delle hCSCs o se questo è un processo stocastico, valuteremo l’efficienza di clonogenesi delle differenti popolazioni di hCSCs a differenti tempi di crescita in vitro. I markers di senescenza (espressione di p16/p19), l’espressione della telomerasi e la lunghezza dei telomeri saranno correlati con il comportamento delle cellule. I protocolli clinici di rigenerazione miocardica con hCSCs autologhe sia attraverso il trapianto che la loro attivazione in situ mediata da citochine, è verosimile che coinvolgano cuori le cui hCSCs contengano un’elevata percentuale di cellule adulte. Pertanto, poiché il potenziale di questi approcci terapeutici dipenderà probabilmente dalla qualità e dalla risposta funzionale delle cellule da trapiantare e/o stimolare, le informazioni ottenute dall’Obiettivo Specifico 2, saranno biologicamente e clinicamente significative.

Obiettivo specifico 3. - Determinare se la differenziazione delle hCSCs verso una delle linee cellulare cardiache (miociti, cellule muscolari e cellule endoteliali) è intrisencamente determinata o può essere modulata da fattori esterni.
Il nostro obiettivo sarà quello di individuare i fattori ed i pathway che regolano il destino delle hCSC. Recenti studi su diversi tipi di cellule staminali, sia embrionali che adulte, dimostrano che il destino delle CSCs è ialmeno in parte regolato dal gruppo di Wnt e dalla famiglia dei Polycomb Gene (PcG). Cercheremo di determinare il ruolo svolto da Wnts e da Bmi1 nel regolare l’equilibrio tra self-renewal e differenziazione delle hCSCs. Per prima cosa, analizzeremo il pattern d’espressione di Wnt e Bmi1 durante differenziazione in vivo e in vitro delle hCSC. In seguito valuteremo gli effetti svolti dalle diverse proteine del gruppo Wnt nel determinare la crescita e la differenziazione delle hCSC in vitro.
Grazie a questi dati potremmo determinare il livello di espressione e di fosforilazione dei target indotti dalla via canonica e non canonica per valutare la relazione causa-effetto tra l’espressione delle proteine del gruppo Wnt e gli effetti osservati sul comportamento delle hCSC.
Per valutare in maniera diretta il ruolo di Bmi e Wnt sulla proliferazione e differenziazione delle hCSCs, amplificheremo l’espressione di Bmi mediante l’uso di retrovirus veicolanti costrutti che esprimono EGFP o identificando target a valle del pathway canonico e non canonico di Wnt con un costrutto che codifica per una forma costitutivamente attiva (per esempio il costrutto β-catenina-IRES-GFP). La crescita e la differenziazione delle hCSCs, così modificate, sarà analizzata in vitro con il saggio precedentemente descritto. In seguito per accertare ulteriormente il ruolo che questi gruppi di geni hanno nella self-renewal e nella differenziazione delle hCSCs, utilizzeremo shRNA per sopprimere l’espressione di Bmi-1 ed Wnt mediante interference RNA.
La crescita e la differenziazione di tali cellule saranno analizzate in maniera simile a quanto effettuato per le cellule che over-esprimevano tali proteine. In aggiunta a queste analisi in vitro, testeremo in vivo gli effetti dell’alterata espressione di Bmi-1 e Wnt sul potenziale rigenerativo delle hCSCs.

Obiettivo Specifico 4. – Individuare i fattori responsabili del fenotipo senescente delle hCSCs e determinare se sia possibile revertire la loro permanente fuoriuscita dal ciclo cellulare e indurne il ritorno nel pool funzionale.
Il nostro scopo sarà quello di valutare se il fenotipo senescente delle hCSCs è reversibile o irreversibile. Tale ricerca è di fondamentale importanza per la rigenerazione miocardica. Se l’Obiettivo Specifico 2 dimostrarà l’esistenza di hCScs senescenti con ridotte capacità di crescita e differenziazione, sarà indispensabile individuare i fattori responsabili della senescenza delle hCSCs e determinare se tali cellule possano essere “ringiovanite”ed indotte a rientrare nel ciclo cellulare e ritornare, quindi, a far parte del pool funzionale. Per prima cosa valuteremo il fenotipo biochimico delle hCSCs senescenti. In seguito verrà isolata una popolazione costituita solo da hCSCs senescenti (p16pos), grazie ad una selezione delle cellule in ciclo con citosina arabinoside (AraC). Il fenotipo di queste cellule senescenti sarà caratterizzato tramite l’espressione della telomerasi, Bmi-1 neg, p14, p16, p21, 8OHdG, quale marker di danno del DNA, p53 e fosfo-p53 e la lunghezza dei telomeri. Lo stato quiescente di queste cellule sarà valutato mediante BrdU labelling. Per studiare la regolazione del fenotipo senescente di hCSCs, cercheremo di revertire il blocco del ciclo cellulare forzando l’espressione di Bmi-1 nelle cellule senescenti utilizzando un vettore lentivirale. Verrà monitorato il rientro di queste cellule nel ciclo cellulare e la donw-regolazione di p14 e p16. la crescita e la differenziazione di queste cellule “recuperate” sarà analizzata in vitro e in vivo. <<<

Risultati parziali attesi

Risultati attesi
Un obiettivo per la ricerca cardiovascolare nell’ultima decade è stato quello trovare un metodo per rimpiazzare i cardiomiciti persi nel processo di invecchiamento e/o a seguito di uno o più IM, così da prevenire, o revertire, il rimodellamento patologico del miocardio, che è responsabile dello scompenso cardiaco tardivo. Nel corso di questo progetto otterremo importanti dati sulla possibile presenza di popolazioni di CSC che inducono uno sviluppo di tipo camera-specifico. Accerteremo se esiste un fenotipo “anziano” per le CSCs che conduce a una compromessa capacità di auto-propagazione e di differenziazione così come ad una riduzione della qualità e dell’estensione della rigenerazione del miocardio. Inoltre determineremo quali fattori regolano il destino delle CSC e le proprietà di rigenerazione e se questi sono determinati intrinsecamente o possono essere modulati da fattori esterni.
La terapia con cellule staminali per il trattamento di molte patologie degenerative correlate all’eta
ha aperto una eccitante e promettente visione per il futuro della medicina e delle terapie farmacologiche. Infatti, la terapie con cellule staminale è oggi vista come il nuovo stato dell’arte della moderna medicina e della ricerca in campo biomedico. Nonostante ciò, recenti trials clinici sulla terapia con cellule staminali hanno avuto risultati contrastanti, probabilmente a causa dell’entusiasmo dei clinici nel trattare molti pazienti affetti da patologie cardiache ignorando la ricerca di base. Perciò, mentre vi sono stati rapidi progressi nel campo della ricerca delle cellule staminali, molti quesiti fondamentali sono ancora da risolvere prima che il potenziale clinico delle cellule staminali possa essere pianamente definito. L’accertamento delle proprietà delle hCSCs isolate da differenti camere cardiache, da pazienti anziani ed affetti da patologia cardiaca, e l’identificazione di fattori che regolano il destino delle hCSCs è di grane importanza per comprendere la biologia delle cellule cardiache e per disegnare migliori protocolli ed interventi per facilitare la rigenerazione ed il recupero funzionale della massa contrattile dopo danno miocardico. Inevitabilmente dal momento che le CSCs sono state scoperte solo quattro anni fa, molte questioni riguardanti la loro biologia di base rimangono irrisolte. E’ quindi imperativo che questi risultati vengano rapidamente indirizzati verso la pratica clinica. L’attuale proposta ha lo scopo di acquisire queste informazioni al fine di poter rispondere a quesiti cruciali nell’applicazione clinica per migliorare la sopravvivenza e la biomedicina.
The specific predicted results from this program project will be that the human myocardium has a ‘generic’ CSC and its self-renewing, differentiation and regenerative potential is not restricted by its chamber of origin. In other words, a CSC obtained from the right atria (even if they display chamber-specific genetic characteristics) can differentiate into a cardiomyocyte of the left ventricle of equal extent and quality than that of a CSC obtained from the left ventricle. This is particularly important information to acquire as in order to develop a rational protocol for human myocardial regeneration which primarily involves regeneration of the LV wall, biopsy samples from which to derive autologous CSCs for therapeutic transplantation are more accessible from the right cardiac chambers. However, even if the present proposal does find the existence of chamber-specific hCSCs, by acquiring results about the intrinsic and extrinsic factors that regulate hCSC fate and regenerative potential in specific aim 3, hCSCs can be manipulated into self-renewal and specific differentiation programmes (cardiomyocyte, blood vessel, capillary), in order to meet what is needed for optimal clinical outcome and to precisely treat certain disease states to the particular needs of a given patient. This approach will also apply if an ‘aged’ hCSC phenotype is found and the quality and extent of CSC self-renewal and regeneration is affected. The present program project predicts that the human myocardium possesses an ‘aged’ hCSC phenotype and this will affect CSC self-renewal ability, differentiation and regenerative potential. Thus, hCSCs are not immortal. They undergo cellular aging in response to a variety of physiological and pathological demands and the physiological state of the donor heart will affect the properties of the hCSCs. As most donors and recipients for hCSC therapy, are of older age and exhibit a disease state these results are both fundamentally important and timely. Through acquiring this better understanding of the biology and regenerative potential of the endogenous hCSCs, better protocols and interventions for the regeneration of functional contractile mass following myocardial injury, either by autologous CSC transplantation and/or through the activation of these regenerative cells in situ, can be designed and developed. The determination of whether the “aged” phenotype of the CSCs is reversible or irreversible has importance for the future of myocardial regeneration. If the aged phenotype is irreversible, it follows that the myocardial regenerative capacity will progressively diminish as the fraction of aged cells increases with age or in response to pathological stress. In this scenario all the myocardial regeneration potential would reside in the fraction of cycling-competent CSCs present in the tissue at any given time. On the other hand, if the aged phenotype were reversible, it is likely that under proper stimulation the myocardial regenerative potential would remain fairly constant because these “aged” cells could be called back to participate in the regenerative process jointly with the cycling-competent cells. It is predicted that the ‘aged’ hCSCs can be “re-juvenated” and their properties reversed through manipulating certain intrinsic and extrinsic factors (ascertained in specific aim 3 and 4). Therefore, ‘aged’ hCSCs can be re-introduced back into the functional hCSC pool.

As outlined above the findings of the program project will have important and fundamental clinical application. By understanding the mechanistic pathways, key signalling pathways and molecules that regulate hCSC fate (old vs young; right atria derived CSC vs left ventricle derived CSCs) these can then be manipulated in order to optimise and improve hCSC life span, regenerative potential and stem cell therapy strategies. In this way, knowledge obtained at the cellular and molecular level can be applied to facilitate understanding and implementation in a clinical setting, and at a community level in relation to issues of public health and preventative medicine. Devising new strategies and interventions (e.g. regenerative medicine; stem cell therapy) which are underpinned by a sound scientific basis will provide the best, safest, most user-friendly and cost-effective approaches to prevent and treat heart disease and heart failure. Stem cell-based therapy and other tissue regeneration strategies have the potential to revolutionize medicine and disease treatment. This project has clear and timely relevance to, and potential to influence, new strategies and interventions to treat heart disease and failure, improve long-term health, quality of life and prolong independent living. Timely experimental data and fundamental scientific information gained from undertaking the proposed project make it extremely likely that future protocols will be soon be developed and become part of the standard treatment for acute myocardial infarction and chronic heart failure. Such protocols can however only develop at a speed concomitant with our understanding of the biology of hCSCs. This is currently rudimentary. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La morte e la rigenerazione miocitaria sono alla base dell’omeostasi cardiaca: Fino a non molto tempo fa, il cuore adulto era considerato un organo post-mitotico, privo di potenziale rigenerativo. Recentemente, questo concetto sta evolvendo. È noto che il cuore di mammifero adulto è formato principalmente da cellule contrattili terminalmente differenziate. Tuttavia, nel cuore adulto, incluso quello umano, sono presenti miociti in mitosi. Questi miociti ciclanti costituiscono una piccola popolazione di cellule telomerasi positive, che incorporano BrdU e che sono significativamente più piccole rispetto alla media dei miociti. Pertanto, tali miociti ciclanti potrebbero rappresentare in realtà precursori cellulari derivati da cellule staminali e, pertanto, cellule immature e ancora non definitivamente uscite dal ciclo cellulare. Inoltre, i miociti positivi per BrdU non esprimono la proteina del retinoblastoma (pRb), ma risultano essere positivi per la proteina p107, come atteso da cellule differenziate non ancora uscite dal ciclo cellulare. Maturati e terminalmente differenziati, tali miociti diventano pRbpos e p107neg (dati non pubblicati). Questa tesi è stata ulteriormente avvalorata dalla scoperta della presenza di un elevato numero di miociti di nuova formazione all’interno dell’area perinfartuale di un infarto miocardico acuto (IMA) nel tessuto cardiaco umano. Questi dati tuttavia non rispondono al quesito sull’origine di questi miociti ciclanti e del loro drammatico incremento in risposta ad ischemia e ad un sovraccarico acuto. È inoltre chiaro che in questi pazienti con IMA, la rigenerazione miocardica non era sufficiente ad impedire la formazione della cicatrice.
Tutto ciò che si conosce riguardo l’origine di questi miociti ciclanti deriva da due fonti: trapianti umani sex-mismatched e stenosi aortiche nell’uomo. La trans-differenziazione delle cellule derivate dal midollo osseo (BMDC) in miociti e vasi coronarici, una volta iniettate in miocardio ischemico, così come l’elevato livello di BMDC circolanti, capaci in modo simile di rigenerare il tessuto miocardico, prodotto dalla somministrazione di citochine, ci consente di ipotizzare che queste cellule circolanti possano colonizzare in modo continuo il tessuto miocardico e contribuire alla formazione di nuovi miociti. I casi di trapianto cardiaco sex-mismatched nell’uomo nei quali un cuore di donna veniva trapiantato in un uomo, hanno dimostrato che, subito dopo il trapianto, all’interno dei cuori femminili vi era un numero significativo di miociti e vasi coronarici positivi per il cromosoma Y. Sebbene vi siamo notevoli differenze nel grado di chimerismo nei cuori trapiantati, tali differenze sono probabilmente dovute alla tecnica utilizzata, ma il fenomeno qualitativamente è inequivocabile. Queste cellule maschili all’interno del cuore femminile derivavano dall’ospite, colonizzavano il cuore trapiantato e successivamente si differenziavano. È stato ipotizzato che queste cellule migranti capaci di generare miociti possedessero alcune delle caratteristiche delle cellule staminali o dei precursori cellulari in modo da poterle identificare all’interno del tessuto miocardico del cuore del donatore. Infatti, cellule primitive originate sia dal donatore che dell’ospite che esprimono gli antigeni di superficie tipici delle cellule staminali sono state identificate del cuore del donatore e all’interno del tessuto atriale residuo dell’ospite. Alcune di queste cellule maschili esprimono già proteine sarcomeriche cardiache. In modo importante, cellule identiche sono state trovate in cuori normali di diverse specie. Queste cellule primitive sono state individuate mediante l’utilizzo di tre comuni markers di superficie espressi dalle cellule staminali: c-kit, sca-1 e MDR1. Tali cellule sono state trovate tra i miociti sia isolate che in piccoli gruppi con caratteristiche di espansione di tipo clonale. Poco dopo aver riportato i dati sul chimerismo, è stata documentata un’elevata percentuale di iperplasia miocitaria nei pazienti con stenosi aortica. In questi pazienti vi è un significativo incremento nella popolazione cellulare di cellule con caratteristiche tipiche delle cellule staminali. L’attivazione di queste cellule determinava la comparsa sequenziale di piccole cellule che si differenziavano verso il fenotipo miocitario in una maniera che sembra ricapitolare la differenziazione dei miociti fetali. Pertanto, sebbene la maggior parte dei miociti nel cuore adulto siano terminalmente differenziati e incapaci di rientrare nel ciclo cellulare, vi è una piccola popolazione di miociti di nuova formazione, risultato della differenziazione delle cellule stem-like, che non sono ancora definitivamente differenziate e che possono ancora sottoporsi a pochi cicli di replicazione cellulare.
Cellule miocardiche con caratteristiche di cellule staminali: Qualunque sia l’origine delle cellule primitive, la loro presenza nel cuore normale e trapiantato, insieme con l’osservazione che alcune di queste cellule hanno già intrapreso il programma di espressione genica specifico delle linee cellulari miocardiche, suggerisce che esse possano essere realmente cellule staminali cardiache. Questa evidenza, comunque dimostra con certezza una relazione tra le cellule primitive e le cellule cardiache terminalmente differenziate. Per risolvere questo quesito, abbiamo dimostrato che le cellule lineage negative e c-kit positive isolate da cuori di ratto adulto possono essere coltivate in vitro e clonate sia in aderenza che in sospensione. In sospensione, queste cellule formano sfere costituite da centinaia di elementi cellulari, simili ai corpi pseudoembrioidi formati dalle cellule neurali (neurosfere); per analogia abbiamo chiamato questi cloni “cardiosfere”. La progenie di un singolo clone generava cellule che esprimevano marker biochimici specifici di miociti, cellule muscolari lisce e cellule endoteliali, sebbene avessero una morfologia anomala e fino ad ora i miociti fossero privi di proprietà contrattili o di strutture sarcomeriche organizzate. Questi risultati supportano il concetto che le cellule Linneg c-kitpos sono vere cellule staminali cardiache, poiché sono clonogeniche, multipotenti e capaci di autopropagarsi. Altre cellule “staminali” cardiache sono state descritte da altri gruppi di ricerca, tuttavia queste hanno fenotipi diversi, non tutti compatibili con i criteri di clonogenicità, multipotenza e self-renewal e non tutte hanno mostrato in vivo capacità rigenerative dopo un danno miocardico. Risultati preliminari simili sono stati ottenuti recentemente con cellule cardiache Linneg c-kipos isolate da biopsie e frammenti di tessuto miocardico umano (hCSCs).

Le CSCs rigenerano miocardio funzionale dopo IM. Quando CSCs di ratto sono state iniettate in miocardio ischemico, queste si sono differenziate in nuovi miociti e strutture vascolari, ripristinando la funzione cardiaca. Per accertare il potenziale cardiogenico delle presunte cellule staminali/progenitrici umane, la progenie di una singola cellula marcata con un vettore retrovirale codificante per EGFP è stata iniettata nella zona peri-infartuale di un recente infarto miocardico in ratti nu/nu. Nella maggior parte degli animali trattati, tale clone di hCSCs ha rigenerato il tessuto miocardico con miociti completamente differenziati e capaci di contrarsi, arteriose permeabili e capillari. Questo fenomeno era associato al recupero della funzione cardiaca. Non sorprendentemente, non vi era evidenza di fusione tra il miocardio umano di nuova generazione e il miocardio del ratto ricevente. In modo simile a quanto osservato nel caso delle cellule derivate dal midollo osseo, non era stata rilevata una significativa fusione tra le cellule del donatore e quelle dell’ospite. Nonostante i rigorosi criteri richiesti da alcuni prima di poter definire staminale un dato tipo cellulare, l’evidenza sta dimostrando che la progenie di una singola cellula miocardica c-kitpos è capace di espandersi in maniera esponenziale quando trapiantata in cuori danneggiati ed è capace di dare origine ai tre principali tipi cellulari cardiaci e di organizzarli in modo tale da formare miocardio funzionale.

Le cellule staminali cardiache sono distribuite in maniera non uniforme nel miocardio possono essere mobilizzate verso un’area infartuata: CSCs all’interno del cuore sono distribuite in modo non omogeneo. Sebbene la maggior parte delle CSC si trovino all’interno del ventricolo sinistro, la loro concentrazione è significativamente più elevata a livello degli atri e nell’apice rispetto alla base e alla regione mediana del ventricolo. In media nel tessuto miocardico sano vi è una CSC ogni ~10,000 miociti o una CSC ogni ~30,000-40,000 cellule miocardiche. Questo numero non include progenitori e precursori cellulari, caratterizzati da specifici markers. Tale concentrazione miocardica di CSCs si avvicina a quella delle HCS del midollo osseo ed è molto simile in differenti specie, comprese quella umana e murina.
Lo stress miocardico determina la sintesi e la secrezione di una moltitudine di fattori di crescita da parte dei miociti che attivano le CSCs. Tra questi, i principali risultano essere il fattore di crescita epatocitario (HGF) ed il fattore di crescita insulino-simile (IGF-1). Le CSCs possiedono i recettori per questi due fattori di crescita e studi in vitro e in vivo hanno dimostrato che il HGF è un fattore chemiotattico per la CSCs in vitro e che l’IGF-1 all’interno del tessuto miocardico promuove la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule. Infatti, la somministrazione locale intra-miocardica di HGF e IGF-1 subito dopo legatura di un’arteria coronarica nel topo determina l’accumulo e l’attivazione di tali cellule nell’area infartuata così come la rigenerazione di tessuto miocardico funzionale. In ogni caso, il significato di questi risultati nell’uomo è discutibile in quanto il peso del ventricolo sinistro del topo è ~50-60mg, mentre nell’uomo è di ~400g. per rigenerare il miocardio infartuato di topo sono necessari solo pochi mg di nuovo tessuto, mentre per la rigenerazione del ventricolo sinistro umano sono previste poche centinaia di grammi di tessuto. Tuttavia, utilizzando un simile regime di citochine è stato possibile attivare le CSCs e di conseguenza generare nuovi miociti (~20%) e strutture vascolari dopo IMA in cuore di maiale che è simile per dimensioni ed anatomia a quello. Tale rigenerazione miocitaria è accompagnata dal recupero quasi completo dei parametri funzionali. Insieme all’isolamento routinario e all’espansione delle CSCs, l’approccio mediante somministrazione di fattori di crescita per attivare le CSCs possiede un ovvio potenziale di applicabilità clinica.

La perdita e/o l’invecchiamento delle CSCs determinano una riduzione del numero di miociti e un peggioramento delle funzione ventricolare: Se l’omeostasi cellulare cardiaca dipende dalla rigenerazione di miociti e cellule vascolari da parte delle CSCs , è possibile che una riduzione della funzionalità delle CSCs, dovuta alla loro morte o al loro divenire non produttive, possa causare una progressiva perdita miocitaria ed una riduzione della funzione ventricolare. Ciò è esattamente quello che accade negli animali da esperimento e negli uomini. La proliferazione cellulare nei mammiferi, incluso l’uomo, è dipendente dalla funzionalità delle telomerasi. L’accorciamento dei telomeri è causato dall’invecchiamento ed è conseguente allo stress ossidativo.

La conseguenza del fisiologico invecchiamento sulla crescita e sulla differenziazione delle CSCs è stata valutata sia in topi normali (WT) sia in topi transgenici che over-esprimono il fattore di crescita insulino-simile (IGF-1) sotto il promotore della catena pesante della miosina (TG). I prodotti genici implicati nell’arresto della crescita e nella senescenza, come p27KIP1, p53, p16INKa4 e p19ARF aumentano progressivamente con l’età negli animali WT, ma risultano attenuati nei TG. Il numero di CSCs nella parete ventricolare sinistra era ridotto del 47% nei WT rispetto ai TG a 4 mesi. Dopo 22 mesi, il 70% delle CSCs nei Wt, ma solo il 16% nei TG erano p16INKa4 positivi, indicando un blocco del ciclo cellulare. A 22 mesi, il numero di CSCs in apoptosi era 5 volte maggiore nei WT rispetto ai TG. A 22 mesi, questo risultava in un decremento del 33% del numero di miociti ed in scompenso nei topi WT, mentre nei TG si riscontrava una normale performance ventricolare ed un normale numero di miociti. Quindi, l’invecchiamento delle CSCs porta allo sviluppo di disfunzione cardiaca e scompenso. In maniera interessante, questa progressione è favorevolmente inibita da fattori di crescita come l’IGF-1.

L’invecchiamento e l’ischemia, inoltre, inducono la fuoriuscita delle hCSCs dal pool funzionale, riducendo il loro incremento nel numero assoluto. In cuori umani anziani, è stata evidenziato invecchiamento delle CSCs che determina deficit di rigenerazione miocardica e aumento della morte cellulare con conseguente scompenso cardiaco. Più nello specifico, biopsie endocardiche da 19 pazienti giovani con cardiomiopatia dilatativa, ma senza evidenza di patologia coronarica o metabolica sono state comparate con 7 biopsie di soggetti di pari età con normale funzione ventricolare. Quantitativamente, il numero di CSCs era incrementato due volte nei cuori malati rispetto ai controlli. Tuttavia, il 59% delle CSCs isolate da cuori patologici risultava essere p16INKa4 positive rispetto al 17% dei controlli. Fenomeni di apoptosi e necrosi delle CSCs sono stati detectati in 10 su 19 biopsie. In tutti i casi queste erano p16INKa4 positive. Nessuna delle CSCs identificate nei controlli mostrava segni di necrosi e/o apoptosi. La morte miocitaria in entrambi i gruppi era determinata solo dalla positività a p16INKa4, ma era 3 volte più alta nei cuori patologici rispetto ai controlli. Come negli animali da esperimento, l’alterata funzione delle CSCs (senescenti) risultava in un decremento della rigenerazione miocitaria e nell’incremento del numero di miociti senescenti. La più alta suscettibilità delle cellule senescenti (sia miociti che CSCs) al segnale di morte insieme alla riduzione della percentuale di rigenerazione miocitaria può, in individui suscettibili, evolvere in dilatazione e scompenso cardiaco. È stato dimostrato che il numero totale di CSCs aumenta significativamente nel ventricolo sinistro dopo infarto del miocardio acuto e cronico rispetto ai controlli. Questa espansione di CSCs, tuttavia, è accompagnata da un concomitante incremento della frazione di CSCs p16INKa4-p53 positive non in ciclo e senescenti. Le CSCs senescenti hanno telomeri corti ed un’alta percentuale di tali cellule dopo infarto acuto e cronico vanno in apoptosi.

Da questi dati risulta chiaro che la caratterizzazione delle CSCs è un fondamentale parametro di valutazione per il potenziale rigenerativo del miocardio. In maniera sorprendente, le CSCs non funzionali costituiscono approssimativamente la metà del pool totale delle CSCs nella popolazione di pazienti candidati al trapianto di CSCs e/o all’attivazione di CSCs in situ mediante l’uso di citochine. Tali CSCs senescenti non possono contribuire alla rigenerazione miocardica. Per questo motivo, è determinante dal punto di vista clinico capire il meccanismo responsabile di questo stato non funzionale a fine di sviluppare nuovi approcci atti a prevenire o revertire tale stato qualora fosse necessario. Sono inoltre importanti le caratteristiche delle hCSCs che originano dalle diverse camere cardiache ed è fondamentale determinare i fattori che governano la loro self-renewal e la loro capacità di differenziarsi verso la linea cardiaca. Ottenere tutti questi dati sulla biologia e sul potenziale rigenerativo delle hCSCs è essenziale per approfondire le nostre conoscenze sulla biologia cardiaca e per disegnare i migliori protocolli e trials clinici di rigenerazione miocitaria dopo danno miocardico. <<<