RICERCA ITALIANA     

Trasduzione del segnale inositide-dipendente nel nucleo: bersagli molecolari e farmacologici

Università degli Studi di Bologna

Abstract

Durante la stesura di questo progetto di ricerca, i responsabili delle singole unità hanno ben avuto in mente una frase di una review di R.F. Irvine (Nat Rev Mol Cell Biol 2003,4:349-360): “If we look at how phospholipids and their signalling and regulatory functions are now appreciated as being central to almost every aspect of cell biology, it could be that a similar revolution in attitude to nuclear lipids might now be due. If this review does no more than to hasten that revolution, it will have served its purpose well”. In effetti sembra che la review di Irvine abbia raggiunto il suo scopo nella comunità scientifica internazionale, infatti dal 6 all’11 febbraio 2005 si è tenuta la nuova Gordon Conference SIGNAL TRANSDUCTION WITHIN THE NUCLEUS, organizzata dal PI di questo progetto e RIPETUTA CON SUCCESSO NEL 2007 (MARZO 25-30, VENTURA CA) particolarmente focalizzatE sul signalling inositide-dipendente. Lo scopo che noi ci prefiggiamo, partendo proprio da quanto discusso in quella conferenza, è quello di identificare i bersagli del signalling dei polifosfoinositidi e se alcuni dei suoi enzimi possono essere a loro volta bersagli di molecole/farmaci in grado di influenzare il ciclo cellulare in cellule neoplastiche umane. Lo schema sotto riportato indica quali sono le conoscenze attuali e i problemi da affrontare.

E’ noto che nelle sindromi mielodisplastiche (MDS)ad alto rischio vi sono alterazioni significative nella espressione di intermedi del signalling inositide dipendente come la Fosfolipasi C (PI-PLC)beta1 nucleare e l’asse Fosfatilinositolo 3-chinasi (PI3K)/Akt. E’ però ancora da definire se altre PI-PLC sono presenti e coinvolte in queste cellule, se la PI-PLCbeta1 nucleare possa essere bersaglio di trattamenti farmacologici ed in particolare di agenti demetilanti e se Akt possa essere modulato da particolari protein chinasi C (PKC) ed in particolare dalla PKC epsilon o se la sua attivazione è solo PI3K-dipendente. Le 4 unità di ricerca di questo progetto si sono organizzate per affrontare questa problematica con lo scopo di chiarire i punti ancora oscuri e fornire da un punto di vista molecolare nuovi strumenti per l’applicazione clinica di terapie sempre più mirate nelle MDS ad alto rischio che evolvono in maniera rapida, non prevedibile e fatale verso la leucemia mieloiode acuta (AML) secondaria. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Lucio Cocco Università degli Studi di BOLOGNA

Obiettivo del Programma di Ricerca

La regolazione del ciclo dei lipidi dell’inositolo è ampiamente indipendente da quello presente nella membrana plasmatica, suggerendo che il nucleo costituisce un compartimento funzionalmente distinto per quanto riguarda il metabolismo dei fosfoinositidi; è stato descritto che la PLCbeta, le PI-kinasi, gli inositidi fosforilati in 3’, la PI3K e Akt sono presenti nel nucleo in domini particolari chiamati speckles legati ad eventi trascrizionali e di splicing (Anderson lab. in Mol Biol Cell. 1998 Dec;9(12):3547-60; Cocco lab. in Proteomics, 2006 Nov;6(21):5725-34; e vedere lo schema qui sotto riportato)

Ciò induce a pensare che questi enzimi del signalling inositidico, oltre ad avere come bersagli fattori di trascrizione e di splicing (Cocco et al. BBA, 2006, 1761:509-21), possono influenzarsi fra di loro ed essere bersagli di trattamenti terapeutici.
Il progetto che si svilupperà in due anni cercherà di raggiungere i seguenti obiettivi:
- capire la via di attivazione di Akt nei blasti dei pazienti MDS ad alto rischio, nello specifico verificare se questa attivazione sia dipendente dalla via di trasduzione PI3K o dalla traslocazione/localizzazione della PKCepsilon al nucleo, che abbiamo recentemente dimostrato essere coinvolta nel differenziamento megacariocitico delle cellule umane CD34+ (Gobbi, Cocco, Vitale, Stem Cells. 2007 Sep;25(9):2322-9).
La identificazione della via di attivazione evidenzierà l’enzima specifico che potrà essere target di nuovi inibitori selettivi. Saranno le Unità Miscia e Billi che, grazie alle loro competenze specifiche, si occuperanno di PKCepsilon e PI-3K rispettivamente.
- ricercare la presenza della PLCbeta2 (Unità Capitani) in campioni ottenuti da pazienti MDS ad alto rischio e da campioni di donatori sani, la differente espressione nelle due popolazioni, possibili anomalie cromosomiche, considerando che la variante M3 della AML, la leucemia promielocitica acuta (APL), è caratterizzata da una traslocazione che coinvolge il cromosoma 15 sul quale è localizzato il gene che codifica per la PLC-beta2;
- verificare (Unità Cocco) se la PLC-beta1 è ipermetilata in blasti di pazienti MDS ad alto rischio e valutare se l’azione demetilante della azacitidina sia responsabile della aumentata espressione riscontrata in pazienti responsivi, e quindi dimostrare che la PLCbeta1 può essere considerata come un fattore prognostico per la risposta alla terapia demetilante. Inoltre, grazie a dati preliminari che mostrano che nel promotore della PLCbeta1 si trovano 2 isole CpG di cui una è metilata in maniera costitutiva e un’altra, che è demetilata in cellule mononucleate di donatori sani e metilata in un piccolo numero di pazienti MDS esaminati fino ad ora, si cercherà di verificare se l’attivazione del promotore della PLC-beta1 sia dovuta alla demetilazione di questa seconda isola, indotta da azacitidina, in modo da spiegare il meccanismo molecolare di questo farmaco sul signalling PI-PLC -dipendente. <<<

Risultati parziali attesi

Il diagramma riportato di seguito riassume dati già ottenuti dai proponenti nel campo della trasduzione del segnale inositide-dipendente nel nucleo in vari modelli ed anche nei blasti di MDS ad alto rischio. Brevemente, per quanto riguarda le MDS ad alto rischio, sappiamo che durante il trattamento con l’inibitore della DNA metiltransferasi, azacitidina, vi è
1. un incremento dell’espressione della PI-PLCbeta1 correlata al miglioramento ed anche alla remissione della patologia
2. un parallelo decremento di p-Akt attivato


Rimangono però ancora dei punti interrogativi:
1. Qual è la via di attivazione di Akt nelle MDS ad alto rischio?
2. L’azacitidina attiva il promotore della PI-PLCbeta1 mediante demetilazione di specifiche isole CpG del promotore?
3. E’ anche la PI-PLCbeta2 coinvolta nella crescita/sopravvivenza dei blasti di MDS ad alto rischio?
Questi sono i punti che la nostra ricerca vuole chiarire.
Nei 2 anni di tempo del progetto riteniamo possibile chiarire il ruolo del signalling inositide-dipendente nel processo di sopravvivenza e crescita nei blasti delle MDS ad alto rischio ed inoltre identificare se alcuni degli enzimi-chiave (PI-PLCbeta (1 o 2); Akt, PI3K, PKCepsilon) sono essi stessi bersagli possibili di trattamenti farmacologici specifici, come per esempio quello con azacitidina.

Risultati attesi
1. Identificare il meccanismo d’azione dell’azacitidina ed in particolare dimostrare che essa è capace di demetilare una specifica isola CpG nel promotore della PI-PLCbeta1 e di conseguenza di attivare il promotore stesso. La definizione di una diretta correlazione tra espressione della PI-PLCbeta1 e miglioramento clinico/remissione della patologia potrà portare alla identificazione della PI-PLCbeta1 come un fattore prognostico nelle terapie demetilanti nelle MDS ad alto rischio. <br />2. Identificare la via di attivazione di Akt. Ci si attende di stabilire se la fosforilazione di Akt e la sua attivazione è dipendente dal signalling a partenza da PI3K o se è dipendente dalla PKCepsilon. In ambedue i casi si chiarirà se Akt presente nel nucleo è fosforilato in questa sede o trasloca dal citoplasma dopo fosforilazione.
3. Stabilire se oltre alla PI-PLCbeta1 anche la PI-PLCbeta2 è coinvolta nel signalling deputato alla crescita/sopravvivenza dei blasti di MDS ad alto rischio.

Nel complesso i risultati attesi porteranno ad un avanzamento della conoscenza del sistema di traduzione inositide-dipendente a livello nucleare. Inoltre, i nuovi dati saranno in grado di determinare la correlazione tra alterazioni di questo sistema di trasduzione del segnale e la clinica nella MDS ad alto rischio e di aprire la strada a nuove terapie rivolte a colpire tappe altamente specifiche del signalling. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L’importanza del ciclo dei fosfinositidi nucleari sta diventando sempre più evidente. Cocco et al. hanno dimostrato per primi che nuclei privati di membrana nucleare sono in grado di sintetizzare in vitro fosfatidilinositolo 4-fostato (PtdInsP) e fosfatidilinosito 4,5- bisfosfato (PtdInsP2). Questa fu la prima evidenza del metabolismo degli inositidi all’interno del nucleo. In seguito, gli stessi autori hanno dimostrato che in fibroblasti 3T3 l’insulin growth factor-I attiva selettivamente la PI-PLCbeta1 (2). Da allora in poi, un numero sempre maggiore di lavori sono stati pubblicati sul metabolismo nucleare dei polifosfoinositidi, dimostrando il loro coinvolgimento nelle risposte cellulari che conducono a differenziamento cellulare, proliferazione e trasformazione neoplastica e nella riparazione del DNA (8).
Un nuovo campo di indagine si è aperto dopo la dimostrazione che anche il nucleo possiede sia inositidi fosforilati in posizione 3 dell’anello dell’inositolo, sia l’enzima responsabile di tale fosforilazione, la PI3K. Oltre alla localizzazione nucleare della PI3K è stata anche dimostrato che il suo bersaglio, Akt, una volta attivato migra nel nucleo, dove risiedono alcuni suoi substrati, dei quali circa 400sono stati identificati, come i fattori di trascrizione della famiglia FoxO (9) e le lamine A/C (10).
In molti casi è stato particolarmente interessante constatare che il metabolismo dei fosfoinositidi nucleari sia del tutto autonomo rispetto a quello citoplasmatico, infatti i meccanismi biochimici che controllano questo ciclo nucleare sono completamente diversi da quelli che intervengono a livello della membrana plasmatica. Ad esempio, in fibroblasti Swiss 3T3 trattati con IGF-I l’attivazione della PI-PLCbeta1 non dipende dalle proteine G (come alpha q/11), ma piuttosto dalla fosforilazione sul residuo di Ser 982 tramite le MAP chinasi che traslocano nel nucleo (11). Successive indagini hanno permesso di evidenziare che l’inibizione della PI-PLCbeta1 si realizza mediante fosforilazione della Ser 887 ad opera della protein chinasi C alpha, attratta nel nucleo dal diacilglicerolo (DAG) prodotto dalla PI-PLC beta1 (12). Un altro dato che conferma l’ipotesi della regolazione indipendente del metabolismo dei fosfoinositidi nucleari è rappresentato dalla PtdInsP chinasi tipo I, la cui attività è controllata dall’interazione con il prodotto del gene del Retinoblastoma (13).
Recentemente è stato dimostrato che alcune molecole coinvolte in questo signalling lipidico, come ad esempio la PI3KC2 alpha, co-localizzano negli “speckles” nucleari, considerati dominii particolarmente ricchi di ribonucloproteine e fattori di “splicing” (14). Negli “speckles “ nucleari sono stati rintracciati anche altri componenti del ciclo quali PtdInsP2 (15), PtsInsP chinasi I alpha, PtdInsP2 chinasi II alpha e beta(16) e PI-PLCbeta1 (17). La disponibilità di anticorpi monoclonali contro PtdInsP e PtdInsP2 hanno permesso l’identificazione in situ di questi inositidi all’interno del nucleo, mediante rilevazione in immunofluorescenza e in microscopia elettronica.
Vi sono poi dati estremamente convincenti riguardo il ruolo chiave svolto dal signalling nucleare dei fosfoinositidi nel regolare la progressione fisiologica attraverso la fase G1 del ciclo cellulare. Ad esempio, in cellule eritroleucemiche murine, l’overespressione nucleare della PI-PLCbeta1 conduce all’aumento della sintesi di ciclina D3, della chinasi cdk4 (18) e del fattore di trascrizione NF-E2 (19). La ciclina D3, e di conseguenza la regolazione della progressione in G1, è dunque un bersaglio specifico del signalling modulato dalla PI-PLCbeta1. Di particolare interesse a questo proposito è la dimostrazione che la ciclina D3 ha un’unica funzione negli stadi precoci dell’emopoiesi (20).
Altro bersaglio della PI-PLCbeta1 è il promotore di CD24, un marker precoce dell’emopoiesi, espresso anche in alcune forme leucemiche. Mediante analisi in microarrays, si è potuto dimostrare che la “up-regulation” della trascrizione di CD24 è provocata dall’overespressione della PI-PLCbeta1, e che il silenziamento della PI-PLCbeta1 conduce alla “down-regulation” della trascrizione di CD24. Tale regolazione avviene almeno in parte a livello trascrizionale, e la “up-regulation” di CD24 è maggiore durante il differenziamento eritroide in vitro (21).
Grazie all’utilizzo della proteomica, si è potuto dimostrare che la PI-PLCbeta1 interagisce e influenza a livello nucleare il fattore di splicing SRp20, appartenente alla famiglia del gene SR, già noto come regolatore di splicing affine e altamente conservato. Si è scoperto che l’overespressione della PI-PLCbeta1 è correlata alla “down-regulation” della quantità di proteina di SRp20 e che SRp20 è associata alla PI-PLCbeta1 nucleare, indicando in questo modo una connessione tra le due proteine (22, si noti che l’articolo è stato oggetto di una intervista in podcast e ha avuto dignità di copertina).
Akt è un’altra molecola chiave nel metabolismo lipidico, connessa ai processi legati al ciclo cellulare. Infatti, nelle cellule HL60, la via di signalling PI3K/Akt è implicata nel controllo della progressione del ciclo cellulare, probabilmente attraverso un meccanismo che coinvolge l’attivazione dei fattori di trascrizione “forkhead”, connessi con l’espressione sia dell’inibitore della chinasi ciclina-dipendente p27Kip1, sia della proteina pro-apoptotica Bim. Precisamente, Akt colpisce p27Kip1, diretto inibitore di cdk2, una delle cdk responsabili dell’attivazione del fattore di trascrizione E2F1 che danno inizio alla duplicazione del DNA. In questo modo viene influenzata la regolazione del ciclo cellulare (23). Inoltre, i componenti l’asse PI3K/Akt sono attivatori della ciclina D1, anch’essa con un ruolo critico nella progressione del ciclo cellulare, che sembra partecipare al danneggiamento della tappa regolativa G1/S del ciclo che conduce poi alla proliferazione cellulare anormale (24). Inoltre Akt promuove la sopravvivenza cellulare e la progressione del ciclo cellulare tramite fosforilazione di MDM2 e GSK-3 (25-27). Avvenuta la fosforilazione ad opera di Akt, MDM2 trasloca nel nucleo e, interagendo con p300 dissociato da p19ARF, conduce alla degradazione di p53 e alla progressione del ciclo cellulare. Akt, fosforilando anche GSK-3, ne inibisce l’attività (28,29).
Partendo dall’evidenza del ruolo chiave rivestito dalla PI-PLCbeta1 nella regolazione della progressione del ciclo cellulare, negli ultimi anni si è potuto caratterizzare il gene di questo enzima, formato da 36 piccoli esoni e introni e localizzato nel braccio corto del cromosoma 20 (20p12.3, vicino ai markers D20S917 e D20S177) (30).
Uno squilibrio della PI-PLCbeta1 sembra sia correlato con trasformazione neoplastica e leuchemogenesi (31).
Le sindromi mielodispastiche (MDS) sono un gruppo eterogeneo di malattie ematologiche dell’adulto che nel 30% dei casi evolvono in leucemia mieloide acuta (AML), senza alcun elemento comune di prognosi e cura. E’ stata dimostrata una delezione allelica nel cromsoma 20q (32) e, anche se non è chiara la relazione tra la maggior parte dei riarrangiamenti e il loro significato biologico, si è potuto evidenziare, in base all’esito clinico, che pazienti affetti da MDS che presentano un cariotipo anomalo sono considerati a maggior rischio per l’evoluzione ad AML rispetto ai pazienti affetti da MDS che presentano invece un cariotipo normale (33). Utilizzando sonde specifiche per il gene della PI-PLCbeta1 (34,35), dall’esone 19 al 32, è stato possibile condurre analisi tramite FISH su pazienti affetti da MDS. Si è potuto evidenziare che pazienti MDS ad alto rischio presentano una delezione mono-allelica del gene della PI-PLCbeta1 (34,35). L’esito clinico di questi pazienti è stato peggiore del previsto perché sono deceduti in breve tempo, compreso tra 1 e 12 mesi. Tutti i pazienti hanno presentato una rapida evoluzione in AML. Questo risultato è avvalorato dall’analisi tramite FISH del gene della PI-PLCbeta4, un altro gene del signalling lipidico, situato nella regione 20p12.3, ad una distanza inferiore a 1Mb dal gene della PI-PLCbeta1. Il gene della PI-PLCbeta4 risulta inalterato nei pazienti MDS che presentano invece delezione del gene della PI-PLCbeta1, suggerendo in tal modo una delezione interstiziale specifica. (35).
PI3K/Akt sembra coinvolto nella sopravvivenza dei blasti MDS (36). Uno studio recente ha infatti evidenziato un’attivazione costitutiva di p-Akt in Ser473 in cellule mononucleate midollari e da sangue periferico in pazienti MDS ad alto rischio, ma non nei pazienti a basso rischio, che al contrario presentano livelli bassi o assenti di p-Akt (37). Inoltre, è stato dimostrato che la maggiore espressione di p-Akt in Ser 473 è accompagnata dall’aumento dell’espressione dell’isoforma p110 delta della PI3K. Oltre a questi dati, è stato osservato che i pazienti MDS ad alto rischio presentano una “down-regulation” di PTEN a differenza di quanto avviene nei controlli da donatori sani e in pazienti MDS a basso rischio (38).
Da studi recenti, anche il mammalian Target of Rapamycin (mTOR) e i suoi bersagli 4E-BPI e p70S6K sembrano coinvolti in questa via di signalling che conduce alla progressione in AML (38).
E’ stato poi possibile dimostrare una correlazione diretta tra Akt attivato e “down-regulation” della PI-PLCbeta1. Queste due molecole sarebbero infatti inversamente correlate fra loro e connesse con la progressione in AML (39). Lo stesso studio ha messo in risalto che la “up-regulation” della PI-PLCbeta1 può essere un elemento prognostico della risposta dei pazienti MDS ad alto rischio al trattamento con azacitidina, indicando che questo enzima può essere un importante bersaglio terapeutico nel trattamento di pazienti affetti da MDS con maggior rischio di evoluzione in AML.
In conclusione, lo stato dell’arte descrive un quadro in cui il ciclo dei polifosfoinositidi nucleari svolge un ruolo chiave nel controllo della crescita cellulare normale, principalmente attraverso la PI-PLCbeta1 e l’asse PI3K/Akt, e si ritiene dunque utile poter determinare se anomalie di questo signalling siano direttamente connesse alla leuchemogenesi.

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