RICERCA ITALIANA     

PROPRIETA' FISICHE DI BIOMATRICI NANOSTRUTTURATE A BASE POLIMERICA

Università degli Studi di Parma

Abstract

Il progetto si propone di approfondire la studio delle proprieta' strutturali e dinamiche di matrici basate su polimeri naturali e sintetici. L'obiettivo di questo studio e' duplice:
- migliorare la conoscenza degli aspetti di base delle interazioni solvente-soluto in gel chimici e fisici;
- utilizzare le informazioni cosi' ottenute per ottimizzare la progettazione di strutture polimeriche e biopolimeriche di interesse per applicazioni biomediche: in particolare nanostrutture per la veicolazione controllata di farmaci.
Il progetto prevede lo studio di due tipi di materiali:
i) matrici basate su l'alcool polivinilico opportunamente modificato per poter ottenere microsfere di idrogel con grande sviluppo superficiale e quindi con elevata capacità di carico di farmaci scarsamente solubili (come ad esempio i farmaci antitumorali) e difficilmente veicolabili da soli.
ii) matrici basate sull'acido ialuronico, HYA, un biopolimero presente nei fluidi sinoviali dei mammiferi. Si studiera' una versione derivatizzata del HYA in cui il 4% dei residui è sostituito con catene idrofobiche alchiliche. Questa forma modificata del HYA e' in grado di formare, anche a concentrazioni di polimero molto ridotte (c < 10 g/l), idrogel stabili con notevoli proprieta' viscoelastiche.
Il nostro obiettivo e' dotare i nuovi sistemi di proprieta', assenti nei materiali di partenza, che rendano possibile modificare le caratteristiche delle biomatrici in risposta a variazioni di parametri termodinamici esterni importanti per applicazioni bio-tecnologiche. Esempi sono, nel caso delle matrici di tipo (i), la termosensibilità, e la presenza di una nanostruttura interna dimensionalmente modulabile; nel caso delle matrici (ii) una aumentata resistenza alla degradazione enzimatica rispetto a quella che si osserva nel polisaccaride naturale. Se queste caratteristiche verranno effettivamente ottenute, i nuovi sistemi cosi' sviluppati saranno in grado di aumentare la biodisponibilita' del farmaco trasportato e quindi la sua efficacia.
Per raggiungere tali risultati occorre una conoscenza dettagliata ed un preciso controllo delle grandezze chimiche e fisiche che determinano le relazioni che legano le proprieta' strutturali e dinamiche delle matrici al loro comportamento in vitro in condizioni fisiologiche. Inoltre in questi biomateriali "compositi" le interazioni acqua-soluto, anche a basse concentrazioni di soluto, possono modificare le proprieta' dinamiche di entrambi. Una descrizione dettagliata dei meccanismi che sono alla base di queste alterazioni non e' ancora disponibile. E' quindi importante studiare le proprieta' conformazionali e dinamiche delle specie macromolecolari, come pure quelle del solvente, in differenti condizioni termodinamiche (concentrazione, temperatura, pressione). Intendiamo sviluppare questo programma ricorrendo ad un approccio integrato che vada dalla ottimizzazione delle metodologie di preparazione delle biomatrici, all'utilizzo di tecniche spettroscopiche avanzate per caratterizzarle a livello microscopico (includendo quelle disponibili presso le grandi facility di radiazione di sincrotrone e di neutroni), allo sviluppo di modelli e di simulazioni al calcolatore. Per questi motivi il team del progetto e' formato da gruppi con competenze chimiche e fisiche complementari e con una approfondita conoscenza delle proprieta' richieste per applicazioni tecnologiche nei settori della veicolazione dei farmaci e dei vettori "intelligenti".
Un ruolo chiave nel progetto sara' svolto dalle simulazioni al calcolatore all'equilibrio e fuori equilibrio. Attraverso una descrizione a livello atomico, delle interazioni, si studiera' in dettaglio la dinamica dei polimeri e del solvente. Tecniche innovative di non-equilibrio verranno utilizzate per descrivere transizioni conformazionali controllate da processi dinamici lenti come quelli che danno luogo ai processi di gelazione. I risultati delle simulazioni forniranno anche una guida per l'interpretazione dei dati di scattering di raggi X e di neutroni fornendo informazioni sulle correlazioni spazio-temporali su lunghezze e tempi caratteristici accessibili agli esperimenti.
Il progetto verra' sviluppato in maniera coordinata da tre Unita' di ricerca (Parma, Roma "Tor Vergata" e Trento). Tra questi gruppi sono in atto collaborazioni da diversi anni su sistemi simili a quelli ora proposti. Questo progetto fornira' l'occasione per rafforzare tali collaborazioni, traendo profitto dalle esperienze accumulate.
Il progetto dara' anche la possibilita' di formare giovani ricercatori (si prevede di assumere quattro postdoc (Assegnisti di Ricerca) ed un dottorando) nei settori delle metodologie di sintesi di materiali innovativi, delle tecniche spettroscopiche avanzate (anche presso le grandi facility internazionali di radiazione di sincrotrone e di neutroni) e dell'utilizzo di tecniche di punta di simulazione al calcolatore. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Antonio Deriu Università degli Studi di PARMA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il progetto si propone studiare delle proprieta' strutturali e dinamiche di matrici innovative (formate da gel e nanogel) adatte per la veicolazione controllata dei farmaci. In particolare si intende studiare:
i) matrici basate su l'alcool polivinilico opportunamente modificato per poter ottenere microsfere di idrogel con grande sviluppo superficiale e quindi con elevata capacità di carico di farmaci scarsamente solubili (come ad esempio i farmaci antitumorali) e difficilmente veicolabili da soli.
ii) matrici basate sull'acido ialuronico, HYA, un biopolimero presente nei fluidi sinoviali dei mammiferi. Si studiera' una versione derivatizzata del HYA in cui il 4% dei residui è sostituito con catene idrofobiche alchiliche. Questa forma modificata del HYA e' in grado di formare, anche a concentrazioni di polimero molto ridotte (c &lt; 10 g/l), idrogel stabili con notevoli proprieta' viscoelastiche.
Il nostro obiettivo è quello di ottenere e caratterizzare sistemi con buone caratteristiche di incapsulazione di molecole bioattive scarsamente o affatto solubili, rilascio localizzato con cinetica controllata, elevata biocompatibilità e quindi bassa risposta immunitaria.
I vettori saranno ottenuti in forma di gel e nanogel. Una accurata progettazione di questi materiali e' necessaria per ottimizzare la localizzazione e l'efficienza di rilascio dei farmaci trasportati. Un altro aspetto assai rilevante che richiede una analisi dettagliata e' quello relativo ai meccanismi di interazione acqua-macromolecola ed al loro ruolo nel determinare le proprieta' strutturali, dinamiche e funzionali dei gel. Nell'ambito del presente progetto intendiamo mettere a punto le metodologie di preparazione dei sistemi sopra citati e caratterizzarne in dettaglio le proprieta' strutturali e dinamiche a livello molecolare utilizzando diverse tecniche di indagine complementari. Per le proprietà strutturali verranno impiegati la densitometria, lo scattering di luce sia statico che dinamico, la diffrazione di raggi X ad alti e bassi angoli, la diffrazione di neutroni a piccoli angoli (SANS). Per le proprietà dinamiche utilizzeremo la spettroscopia di rilassamento NMR, lo scattering elastico (ENS), quasielastico (QENS) ed anelastico (INS) di neutroni e lo scattering non risonante della radiazione gamma Mössbauer (RSMR). Queste spettroscopie, nel complesso, permettono di coprire un intervallo molto ampio di tempi caratteristici: dai femtosecondi (INS) fino ai microsecondi (NMR).
Inoltre si effettueranno misure di microcalorimetria isotema ad alta risoluzione e di calorimetria a scansione sia uniforme che modulata per studiare la stabilita' termodinamica e la cinetica dei processi di gelazione.
Un ruolo chiave nel progetto sara' svolto dalle simulazioni al calcolatore all'equilibrio e fuori equilibrio che affiancheranno le misure sperimentali. Il confronto tra dati sperimentali e risultati delle simulazioni al calcolatore fornira' una guida per una comprensione piu' approfondita dei processi a livello molecolare; inoltre i risultati delle simulazioni di MD contribuiranno ad una piu' dettagliata interpretazione dei dati X e neutronici, fornendo informazioni sulle correlazioni spazio-temporali su lunghezze e tempi caratteristici accessibili agli esperimenti. Essi premetteranno anche di estendere l'analisi ad intervalli di parametri non accessibili alle misure spettroscopiche. Attraverso una descrizione a livello atomico delle interazioni, si studiera' in dettaglio la dinamica dei polimeri e del solvente. Tecniche innovative di non-equilibrio verranno utilizzate per descrivere transizioni conformazionali controllate da processi dinamici lenti come quelli che danno luogo ai processi di gelazione.
Attraverso simulazioni di dinamica molecolare classica sara' possibile discriminare fenomeni dinamici che coinvolgono molecole di acqua con diversi gradi di associazione al reticolo del gel.
Prevediamo che i dati sperimentali unitamente a quelli di simulazione ci permetteranno di affrontare alcuni problemi ancora aperti:
- per quanto riguarda le proprieta' strutturali: i meccanismi di gelificazione, una descrizione delle regioni idrofobiche ed idrofiliche dei network polimerici, la stabilita' dei legami idrogeno in differenti condizioni termodinamiche, l'ordinamento delle molecole di acqua di prima idratazione indotto dall'interazione con il polimero;
- per gli aspetti di dinamica: effetti delle interazioni soluto-solvente sulle proprieta' di diffusivita' del solvente per diversi gradi di associazione con le macromolecole polimeriche, dipendenza della transizioni cinetiche (di tipo "vetroso") delle catene polimeriche dalle condizioni termodinamiche (idratazione, temperatura, ...);
- ottimizzazione dei potenziali efficaci di interazione da utilizzare nelle simulazioni al calcolatore.
Il progetto dara' anche la possibilita' di formare giovani ricercatori (si prevede di assumere quattro postdoc (Assegnisti di Ricerca) ed un dottorando) nei settori delle metodologie di sintesi di materiali innovativi, delle tecniche spettroscopiche avanzate (anche presso le grandi facility internazionali di radiazione di sincrotrone e di neutroni) e dell'utilizzo di tecniche di punta di simulazione al calcolatore.
Inoltre due dottorandi con borsa ministeriale dell'Universita' di Parma lavoreranno a tempo pieno sulle tematiche del progetto. <<<

Risultati parziali attesi

Ci proponiamo di preparare e caratterizzare biomatrici innovative da impiegare come vettori per molecole farmacologicamente attive con caratteristiche di bassa solubilita'. La disponibilta' di tali matrici, con elevate caratteristiche di biocompatibilita' (bassissima risposta immunitaria), consentira' di aumentare la biodisponibilita' dei farmaci realizzando un rilascio localizzato e con cinetiche modulabili.

Il principale risultato atteso per questo progetto e' la messa a punto di protocolli di preparazione ottimizzati per le due classi di biomatrici che si intende studiare:
i) matrici basate su l'alcool polivinilico opportunamente modificato per poter ottenere microsfere di idrogel con grande sviluppo superficiale e quindi con elevata capacità di carico di farmaci scarsamente solubili (come ad esempio i farmaci antitumorali) e difficilmente veicolabili da soli.
ii) matrici basate su una forma modificata dell'acido ialuronico (in cui il 4% dei residui è sostituito con catene idrofobiche alchiliche) che e' in grado di formare, anche a concentrazioni di polimero molto ridotte (c &lt; 10 g/l), idrogel stabili con notevoli proprieta' viscoelastiche.

Le informazioni ottenute sui gel di PVAMA saranno anche utili come punto di partenza per ulteriori studi su nuovi sistemi multifunzionali basati sul PVA. Come esempio si possono citare studi recenti che hanno mostrato come, incapsulando la molecola "Gadolinium diethylenetriamine pentaacetic acid (Gd-DTPA)" in una microparticella polimerica biodegradabile, sia possibile controllare in maniera non invasiva con NMR-imaging il rilascio intravescicolare dei farmaci [1]. In un contesto simile, microparticelle a base di PVAMA-NiPAAM, che incapsulino sia agenti di contrasto che agenti terapeutici, possono consentire un approccio promettente per terapie con rilascio controllato tramite tecniche di imaging.

Gli studi strutturali e dinamici, oltre a fornire le informazioni specifiche per le biomatrici studiate nell'ambito del progetto, forniranno elementi molto utili per affrontare diversi problemi ancora aperti nel campo degli idrogel chimici e fisici. In particolare, dal punto di vista strutturale ci aspettiamo di contribuire ad una migliore definizione di
- meccanismi di formazione dei gel e loro cinetica;
- localizzazione delle regioni idrofobiche ed idrofiliche in un polimero con caratteristiche di polieletttrolita;
- grado di persistenza dei legami idrogeno in differenti condizioni termodinamiche;
- organizzazione dell'acqua di idratazione attorno alle catene che formano il reticolo disordinato del gel.

Gli studi spettroscopici (tramite NMR, ENS, INS e QENS) porteranno ad una migliore comprensione dei meccanismi di interazione soluto-solvente, un argomento di rilevanza generale per la gran parte dei sistemi biologici. Da questo punto di vista i reticoli di PVA e lo HYA possono essere considerati come sistemi modello con caratteristiche simili a quelle di strutture biopolimeriche di maggiore complessita' (come ad esempio polipeptidi e polinucleotidi) soprattutto per quel che riguarda processi dinamici di carattere generale come:
- le proprieta' di diffusivita' del solvente per diversi gradi di associazione con le macromolecole;
- la dipendenza dai parametri termodinamici (idratazione, temperatura,...) delle transizioni cinetiche (di tipo 'vetroso') nei biopolimeri.

I principali risultati attesi (punti (i) e (ii)) sono di diretta rilevanza per applicazioni in campo farmacologico infatti:
- sistemi a base di PVA sono gia' stati presi in considerazione negli ultimi anni come matrici per la veicolazione di farmaci (si veda per esempio [2, 3] e le referenze ivi citate);
- parimenti, i sistemi basati sul HYA sono oggetto di grande interesse come sistemi particolarmente versatili e idonei per diverse applicazioni biomediche (si veda per esempio [4, 5] e le referenze ivi citate).

1. HH. Chen, C. Le Visage, B. Qiu, X. Du, R. Ouwerkerk, KW Leong and X. Yang, "MR Imaging of biodegradable polymeric microparticles: a potential method of monitoring local drug delivery", Magn. Res. in Medicine, 53 (2005) 614-620.
2. Kim C-J., Lee P.I., "Composite Poly(vinyl alchol) beads for controlled drug delivery", Pharmaceutical Research, 9 (1992) 10-16.
3. SS. Venkatraman, TO. Murdock, S. Pudjijanto "Pharmaceutical hydrogel formulations, and associated drug delivery devices and methods", US Patent Issued on March 21, 2000.
4. Y-H Liao, SA Jones, B Forbes, GP. Martin and MB. Brown "Hyaluronan: pharmaceutical characterization and drug delivery", Drug Delivery, 12 (2005) 327-342.
5. G. Kogan, L. Soltes, R. Stern, P. Gemeiner "Hyaluronic acid: a natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial applications", Biotechnol. Lett. 29 (2007) 17-25. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Negli anni recenti la ricerca farmaceutica ha dovuto affrontare problemi complessi connessi con lo sviluppo di nuove metodologie terapeutiche. La progettazione di nuovi sistemi farmacologicamente attivi richiede un approccio integrato in cui l'azione del principio attivo venga assistita e massimizzata grazie ad un opportuno mezzo di trasporto che consenta anche il rilascio controllato del farmaco nella regione in cui questo deve agire. Tali vettori sono per lo più sistemi idrogel costituiti da un mezzo disperdente e da una componente polimerica in grado di rispondere a gradienti di parametri fisici e chimici come temperatura, pH, affinità a recettori, ecc... Questi sistemi costituiscono un settore importante dei biomateriali ed il loro studio è destinato a svilupparsi ulteriormente nei prossimi anni [1-3]. L'obiettivo è quello di ottenere sistemi che offrano una alta biodisponibilità del farmaco, un rilascio localizzato con cinetica controllata e complessivamente una elevata biocompatibilità. Questi obiettivi si possono realizzare con l'uso di nuove piattaforme polimeriche. In quest'ottica, nel presente progetto si utilizzeranno due tipi di biomatrici con differenti caratteristiche fisiche e chimiche:
(i) micro/nanogel iniettabili a base di alcool polivinilico;
(ii) idrogel macroscopici a base di acido ialuronico.
Le caratteristiche più importanti dei sistemi (i) sono:
- Rapporto superficie/volume molto grande, ottimale per il raggiungimento di un’alta efficienza di carico e di rilascio per il trasporto molecolare.
- Dimensioni globali che permettano la somministrazione per via parenterale (iniettabilità).
- Versatilità chimica della superficie per la funzionalizzazione con opportune specie molecolari che rendano possibile la localizzazione della piattaforma sui recettori delle cellule da trattare, aumentando in modo sensibile la biodisponibilità del farmaco.
I sistemi (ii) sono biomatrici macroscopiche che rientrano, per le loro caratteristiche di equilibrio e dinamiche, nella classe degli idrogel. Caratteristiche distintive di questi sistemi sono:
- L’iniettabilità dovuta alla bassa resistenza di shear.
- La possibilità di caricare il gel con farmaci antinfiammatori.
- Un aumento della resistenza alla degradazione enzimatica.
Le due classi di biomatrici che verranno studiate in questo progetto derivano da differenti meccanismi di autoassemblaggio:
Le matrici (i) sono formate da microparticelle di idrogel reticolati chimicamente a base di poli (vinil alcool)-polimetacrilato PVAMA (vedi Schema 1).


Tali sistemi sono già stata sintetizzati e caratterizzati nei laboratori dell'Unita' di ricerca di Roma "Tor Vergata" [4, 5]. Questo materiale è stato studiato come sostituto del umor vitreo umano ed offre la base di partenza per una nuova classe di microgel termosensibili potenzialmente utilizzabili come microdispositivi per il trasporto e il rilascio di farmaci in condizioni fisiologiche.
Le matrici (ii) sono idrogel macroscopici stabilizzati da interazioni non-covalenti e basati su acido ialuronico, HYA, parzialmente idrofobizzato graffando la catena con gruppi laterali alchilici; queste matrici sono indicate nel seguito come HYADD. HYA e' un polisaccaride con notevole ricchezza funzionale in natura, difficile da riscontrare in altri polimeri (vedi Schema 2) [3].


Fino agli anni 70, l’HYA è stato considerato una molecola capace di aumentare la viscosità del fluido sinoviale in cui è presente. In seguito si è visto che questo biopolimero partecipa alla costituzione della cartilagine articolare dove costituisce il rivestimento dei condrociti e, in presenza di proteine che regolano i processi di aggregazione nella cartilagine, si organizza in grandi aggregati con densità di carica negativa molto alta, capaci di richiamare ingenti quantità di acqua nei tessuti per effetto osmotico. Inoltre l’HYA partecipa a diverse interazioni cellulari come recettore del CD44, una proteina che regola il processo di adesione in cellule tumorali. In ambito biomedico l’HYA viene utilizzato come supporto cellulare nell’ingegneria tissutale e trova applicazione nel trattamento di patologie osteoarticolari del ginocchio e in generale come supplemento del fluido sinoviale presente nelle giunzioni. L’attenzione di laboratori di ricerca accademica e industriale si è recentemente diretta su un derivato dello HYA in cui appena il 4% dei residui è sostituito con catene alchiliche a sedici atomi di carbonio. Questo HYA modificato forma idrogel a concentrazioni molto basse, probabilmente grazie alla aggregazione delle catene laterali idrofobiche.
La conoscenza dettagliata della struttura dei reticoli polimerici dei gel e' un pre-requisito necessario per ottimizzare le capacita' di veicolazione per farmaci ed ambienti specifici. Un ulteriore aspetto importante e' quello della descrizione delle interazioni acqua-macromolecola e del loro ruolo nel determinare le proprieta' strutturali, dinamiche e funzionali dei gel. Negli idrogel polimerici e biopolimerici i legami idrogeno si stabiliscono tra molecole d'acqua, tra l'acqua e la macromolecola ed anche all'interno della macromolecola. Il primo strato di molecole di idratazione (d &lt; 5Å) è in forte interazione con la biomolecola stessa e concorre quindi a determinarne la mobilità, a controllare i processi di associazione e dissociazione, la formazione di legami idrogeno ed i fenomeni di trasferimento protonico [7,8]. Le interazioni acqua-macromolecola sono a corto raggio, ciò nonostante il loro effetto complessivo si propaga su scale di lunghezza relativamente estese, esse possono quindi modificare, anche per basse concentrazioni di biomolecole, le proprietà di diffusività traslazionale e rotazionale di estesi volumi di acqua interstiziale [9].
Ad esempio, nei polisaccaridi al variare dell’idratazione e' possibile realizzare una varietà di strutture differenti: dalle fibre ordinate e fortemente aggregate alle basse idratazioni, fino a gel estremamente diluiti che sono però sufficientemente stabili anche per concentrazioni di polisaccaride molto ridotte (fino a concentrazioni inferiori a 1%). D’altra parte l’acqua agisce come plasticizzante per le catene polisaccaridiche che formano il reticolo del gel con effetti quindi non solo sulla conformazione delle catene stesse, ma anche sulla loro dinamica a livello molecolare [10,11].
Lo studio delle proprieta' microscopiche e mesoscopiche di gel polimerici e biopolimerici richiede l'uso combinato di diverse tecniche di indagine.
Per le proprietà strutturali vanno citate lo scattering di luce sia statico che dinamico, la diffrazione di raggi X a piccoli angoli (particolarmente efficace con le moderne sorgenti di radiazione di sincrotrone), la diffrazione di neutroni a piccoli angoli. Si tratta di tecniche fortemente complementari:
i. il loro uso combinato permette di ottenere informazioni strutturali su una scala di distanze molto ampia, dalle distanze atomiche fino ai micron.
ii. la diversa sensibilità dei raggi X e dei neutroni agli elementi più leggeri, permette di separare nei profili di diffrazione i contributi delle diverse specie molecolari presenti ed anche di individuare la distribuzione dell'acqua di idratazione.
Per quanto riguarda le proprietà dinamiche a livello microscopico, vanno ricordate: la spettroscopia di rilassamento NMR [12], le misure di potenziali chimici [13], i rilassamenti dielettrici e la spettroscopia a microonde [14]. E’ stato cosi’ mostrato che l'acqua legata a siti idrofili e' caratterizzata da tempi di rilassamento maggiori di quelli dell'acqua pura e ciò può essere interpretato in termini di un aumento della connettività della rete di legami idrogeno [15]. Negli ultimi dieci anni si sono aggiunti dati ottenuti con simulazioni di dinamica molecolare (MD) via via più complesse e con esperimenti di scattering sia quasielastico (QENS) che anelastico ad alta risoluzione (INS) con neutroni termici o 'freddi', come pure misure di scattering della radiazione gamma Mössbauer (RSMR). Le misure RSMR, condotte da noi su sistemi saccaridici simili a quelli proposti nel presente progetto, hanno mostrato che l'acqua di idratazione è fortemente strutturata. Tale ordine non è solo di tipo statico, ma anche dinamico, difatti è stata messa da noi in evidenza l'esistenza di modi vibrazionali acustici (fononi longitudinali) che si propagano in queste strutture ordinate di acqua [16-19]. Le misure QENS ed INS sugli strumenti di ultima generazione [20-24], hanno fornito dati di notevole interesse sul fattore di struttura dinamico S(Q,w) in un ampio intervallo di momenti scambiati (hQ) e di energie scambiate (hw). Tali intervalli corrispondono a lunghezze dell'ordine di 1- 100 Å ed a tempi che vanno da quelli tipici delle vibrazioni localizzate ad alta frequenza (10^(-12) - 10^(-13) s) a quelli più lunghi (nella regione dei ns) che caratterizzano i moti diffusivi a livello molecolare. Va anche rimarcato che le tecniche RSMR e quelle di scattering neutronico sono fortemente complementari nello lo studio della dinamica a scala atomica e molecolare. Infatti la tecnica RSMR è sensibile solamente agli atomi piu' pesanti (ossigeno nel caso dell'acqua) essendo l'idrogeno pressoche' 'invisibile' per i raggi gamma. Viceversa lo scattering di neutroni è dominato dall'idrogeno (sezione d'urto (H) ~ 20 x sezione d'urto(O)) e quindi i due dati forniscono complessivamente un ampio quadro dei vari aspetti della dinamica roto-traslazionale delle molecole.
Sul fronte delle simulazioni numeriche, le aumentate potenzialità di calcolo hanno recentemente consentito lo studio di sistemi macromolecolari sempre più complessi per mezzo della simulazione al calcolatore, in particolare con metodi di dinamica molecolare classica. Nel contempo sono state sviluppate nuove tecniche di risoluzione dell'equazione di Fokker-Planck, basate sul Path-Integral e il metodo degli istantoni, che in prospettiva permetteranno di comprendere il dettaglio di trasformazioni conformazionali che avvengono in tempi lunghi a seguito di una successione di eventi rari.
Nel gruppo di Trento e' presente un know-how specifico in entrambi questi settori.
Sul fronte della dinamica molecolare è stata sviluppata in passato una notevole esperienza nello studio di molecole glicolipidiche e nello sviluppo correlato di potenziali a livello atomistico per la descrizione dei campi di forza[25]. I risultati sono stati positivamente confrontati con quelli ottenuti sperimentalmente per mezzo di scattering X, sia a basso (SAXS) che alto angolo (WAXS) raggiungendo un'ottima coincidenza fra sistema simulato e sistema reale [26-28].
E' possibile aspettarsi che la creazione di matrici a base di polimeri sia un fenomeno di tipo cooperativo, che coinvolge molteplici coordinate di reazione in una sequenza dominata da eventi rari. Queste transizioni configurazionali possono essere descritte analiticamente come proprietà geometriche delle singole molecole. Per l'analisi di questo ed altri processi è possibile utilizzare un metodo variazionale, messo a punto a Trento ed originariamente applicato allo studio del protein-folding [29,30], che permette di investigare le modalità di transizione conformazionale tra uno stato iniziale ed uno stato finale assegnati, utilizzando una versione generalizzata dell'azione di Onsager-Machlup [31] nella formulazione di Hamilton-Jacobi. Il metodo, che non richiede approssimazioni ulteriori a quelle che riguardano la dinamica di Langevin che si assume descrivere il processo, consente di ottenere il cammino più probabile nello spazio delle configurazioni senza dover identificare a priori alcuna coordinata di reazione, come avviene nel caso di altri metodi per l'analisi di eventi rari (e.g. [32]). A differenza dei metodi di dinamica molecolare, questo approccio permette di evitare di investire tempo computazionale quando il sistema non è in evoluzione e quindi risolve il problema dell'esistenza di scale di tempi diversi in eventi rari.
Per quanto riguarda il problema della definizione del campo di forze, recentemente è stata sviluppata una versione di GROMOS applicabile a sistemi mono- e di-saccaridici[33, 34]. Questo potenziale puo' essere esteso alla descrizione del HYA. recentemente il campo di forze GROMOS e' stato impiegato dal gruppo di Roma "Tor Vergata" per descrivere idrogel di PVA [35], senza inclusioni di MA. Tali campi di forze costituiscono il punto di partenza necessario sia per le simulazioni di dinamica molecolare che, nel lungo termine, per le simulazioni di tipo variazionale (DFP).

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