RICERCA ITALIANA     

Meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella regolazione della risposta immune adattiva

Università degli Studi di Firenze

Abstract

L’immunoregolazione è un network complesso che comprende un numero sempre maggiore di cellule e segnali in grado di modulare fino ad inibire la risposta immunologica rivolta verso antigeni ‘self’ e ‘nonself’. Le cellule coinvolte non sono solo i linfociti T regolatori (Treg) che stimolati da particolari sottopopolazioni di cellule dendritiche (DC) sono in grado di sopprimere la risposta effettrice, ma anche altre cellule (NK, T g/d e Cellule Mesenchimali Staminali, MSC). Dati recenti, dimostrano che cellule T helper dei tre bracci della immunità adattiva (Th1/Th2/Th17) hanno una diversa suscettibilità all’azione delle cellule Treg tradizionali. Infine esistono dati discordanti tra l’attività in vitro e quella in vivo delle cellule Treg. Il progetto sviluppa linee di ricerca parallele utilizzando diversi sistemi cellulari coinvolti nell’immunoregolazione (specie incentrati sulle DC e sulla risposta adattiva) al fine di acquisire nuove conoscenze sui meccanismi e di valutare le possibili connessioni tra di loro. Si svilupperanno infine modelli murini che mimano patologie umane per confermare in vivo l’attività di tali cellule. Questo consentirà di poter integrare le conoscenze acquisite e sviluppare collaborazioni tra le Unità di Ricerca (UR) del progetto.
La UR1 ottimizzerà le condizioni in vitro per polarizzare la risposta in senso Th1, Th2, Th17 e Treg sia da cellule T naive che T memoria. Inoltre svilupperà modelli in vivo di infiammazione cronica del polmone (asma) e dell’intestino (IBD) o deriverà cellule T da sangue periferico o da BAL di pazienti asmatici o da biopsie intestinali di pazienti con malattia di Crohn. Su tali modelli saranno valutati i segnali modulanti le risposte Th2 o Th17 sia di tipo molecolare (citochine e ligandi di TLR) che cellulare (Treg). La ricaduta consiste nell’identificazione dei segnali più efficaci per modulare lo sviluppo di risposte Th2 o Th17, come potenziali candidati per una immunoterapia selettiva di queste patologie.
La UR2 ha come obiettivo la definizione dell’effetto immunomodulatorio di batteri patogeni e commensali in DC murine. Mediante la tecnologia dei microarray saranno identificati i meccanismi molecolari fini indotti da classi diverse di batteri in grado di indurre rispettivamente risposte di tipo Th1 o Th17 (patogeni intracellulari e extracellulari) e di tipo Th2 o Treg (antigeni e tossine ambientali e batteri non patogeni).
Lo scopo della UR5 è quello di sviluppare un nuovo metodo per generare cellule Treg in grado di prevenire e migliorare il diabete in topi “diabetici non-obesi” (NOD), modello che rappresenta un prototipo di malattia autoimmune. A tal fine sarà esaminata la relazione bidirezionale esistente tra Treg e il catabolismo del triptofano. La maggiore novità del progetto si basa appunto sull’utilizzo dei cataboliti del triptofano (chinurenine) con DC tollerogeniche (incubate con un peptide diabetogenico) con lo scopo di generare in vivo Treg specifiche, responsabili della prevenzione, ritardo della comparsa o miglioramento del quadro clinico.
La UR4 studierà le interazioni tra cellule NK e DC che costituisce un nuovo meccanismo di controllo dell’immunità innata sulla risposta adattiva. Infatti, le cellule NK attivate dalle DC, rilasciano IFNg che contribuiscono, dopo il contatto DC-T, a polarizzare la risposta in senso Th1. Inoltre, grazie alla loro attività citotossica le cellule NK sono anche capaci di eliminare le DC immature. In particolare lo studio sarà focalizzato sull’interazione NK-DC nel microambiente della decidua, sito in cui viene messa in atto una “fisiologica” regolazione della risposta immune verso il feto e nello stroma tumorale, tessuto in cui, invece, tale immuno-regolazione potrebbe concorrere alla patogenesi della malattia.
La UR3 studierà l’effetto regolatorio delle MSC sul sistema immune soprattutto in relazione alla crescita neoplastica. Le MCS infatti possono proliferare all’interno della neoplasia bloccando l’immunità anti-tumorale. La ricaduta finale consiste nell’ingegnerizzare tali cellule con geni ad attività antiproliferativa, capaci di inibire la crescita neoplastica. At tale scopo si eseguirà una caratterizzazione in vitro ed in vivo dell’influenza delle MSC sull’immunità specifica anti-tumorale in un modello di plasmocitoma murino. Infine si valuterà l’influenza delle MSC sulle funzioni dei neutrofili e del ruolo dei TLR nell’interazione tra neutrofili e MSC. La UR3 e UR1 hanno infatti dimostrato che le MSC utilizzano TLR3 e TLR4 per la loro immunoregolazione e questo potrebbe essere un nuovo meccanismo attraverso il quale lo stroma tumorale interagisce con l’immunità innata e adattiva, creando un’ulteriore barriera immunologica.
Questo studio di tipo traslazionale consentirà di sviluppare collaborazioni tra i 5 partners che sono ognuno leader nel proprio settore in modo da integrare le conoscenze tra i vari sistemi cellulari e molecolari di regolazione dell’immunità innata e adattiva. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Sergio Romagnani Università degli Studi di FIRENZE

Obiettivo del Programma di Ricerca

I meccanismi della cosiddetta tolleranza periferica verso antigeni esogeni comprendono la delezione clonale e l’induzione di anergia nelle cellule T effettrici antigene-specifiche. Inoltre molte evidenze indicano che un’attiva immunosoppressiva da parte di particolari sottopopolazioni di linfociti T regolatori (Treg CD4+CD25+, Tr1, Th3, ecc) è essenziale per l’induzione della tolleranza sia verso antigeni ‘self’ che ‘nonself’. In questo contesto un ruolo centrale viene svolto dalle cosiddette cellule dendritiche (DC) regolatorie, subsets funzionali di DC capaci di attivare alcune sottopopolazioni T regolatorie. Negli ultimi anni sono stati individuati altri meccanismi che coinvolgono anche cellule non-T (Cellule NK e Tg/d, Cellule mesenchimali staminali, MCS) che possono contribuire alla regolazione della risposta immune sia innata che adattiva. Infine sempre molto recentemente è stato descritto una terzo braccio dell’immunità adattiva dovuta ad nuova sottopopolazione di cellule T helper (Th17) diversa dalle classiche cellule Th1 e Th2, e coinvolta nelle alterazioni della flogosi cronica, legata alla presenza di neutrofili. Le cellule Th17 richiedono RORgt come fattore di trascrizione chiave per la differenziazione, il loro sviluppo è indotto dalla combinazione di TGF-beta e IL-6 (la IL-23 e IL-1b forse nell’uomo) e vengono prevalentemente reclutate nella cute e nelle mucose e non risultano suscettibili all’azione delle Treg. Le cellule Th17 possono giuocare un ruolo essenziale nella cronicizzazione dell’asma allergico e nel successivo rimodellamento tissutale nelle forme di autoimmunità in vari modelli animali e nelle malattie umane (Artrite reumatoide, Sclerosi Multipla e Malattie croniche intestinali – IBD).
Con l’identificazione di cellule Th17 e delle varie sottopopolazioni Treg capaci, rispettivamente, di aumentare o ridurre la flogosi, i meccanismi che portano alla immunoregolazione si sono dunque ampliati e costituiscono un network complesso di cellule e segnali solo in parte noti che, agendo in modo sincrono a vari livelli, sono in grado di modulare la risposta immunologica.
L’obiettivo principale del progetto di ricerca consiste nello sviluppare linee di studio parallele su i vari sistemi di immunoregolazione (cellule Treg CD4+CD25high, Tr1, Th3, NK, MCS, ecc) agenti o direttamente sulle cellule T effettrici o, più spesso, indirettamente sulle DC, con lo scopo di poter integrare le conoscenze acquisite tra i vari sistemi e sviluppare collaborazioni già peraltro esistenti, tra le Unità di Ricerca (UR) del progetto.
Il principale obiettivo del della UR1 è lo studio del processo differenziativo delle cellule T effettrici (Teff) Th1/Th2/Th17 e Treg e la loro reciproca attività regolatoria in modelli umani e murini di allergia respiratoria e IBD. Obiettivi specifici riguardano lo studio delle migliori condizioni in vivo ed in vitro per indurre la polarizzazione delle cellule T naive (o memoria) nelle varie sottopopolazioni Th1 o Th12 o Th17 o Treg, ed i meccanismi dovuti a DC prima e dopo stimolo con ligandi di TLR sulla polarizzazione delle cellule Teff. L’immunodeviazione (da citochine – IL-4/IL-13 e IL-12 o ligandi di TLR) e immunoregolazione (cellule Treg e Tr1) in vitro delle risposte Th2 o Th1/Th17 sarà saggiata su linee e cloni Th2 o Th17 generati da sangue periferico di pazienti allergici o con malattia di Crohn (CD), da cellule T presenti nel liquido di lavaggio broncoalveolare di pazienti allergici e nei frammenti chirurgici di pazienti con CD. Gli stessi segnali modulanti saranno saggiati in modelli in vivo che mimano l’allergia respiratoria e le IBD o che utilizzano il trasferimento adottivo di cellule murine o umane in topi SCID.
L’obiettivo della UR2 consiste nell’ analizzare con tecnologia dei microarrays l’effetto immunomodulatorio di batteri patogeni e commensali a livello delle DC. Si cercherà di identificare i patterns molecolari indotti da batteri diversi e il loro contributo allo sviluppo della risposta adattativa. A tale scopo verranno utilizzati classi diverse di stimoli che, agendo su DC, sono in grado di indurre rispettivamente risposte di tipo Th1, Th17 (batteri intracellulari o extracellulari) e di tipo Th2 o Treg (fattori tissutali, antigeni ingeriti mediante la nutrizione o l’interazione con batteri non patogeni della flora intestinale).
L’obiettivo della UR5 è quello di sviluppare un nuovo metodo per generare cellule Treg in grado di prevenire e modificare il decorso della malattia diabetica in topi “diabetici non-obesi” (NOD), modello che rappresenta un prototipo standardizzato di malattia autoimmune. A tal fine sarà esaminata la relazione bidirezionale esistente tra Treg e il catabolismo del triptofano. (quest’ultimo è un meccanismo effettore, ma anche un modo per generare le Treg). La maggiore novità del progetto si basa sull’utilizzo dei cataboliti del triptofano (chinurenine), sia da soli che in associazione con cellule dendritiche tollerogeniche (incubate con un peptide riconosciuto da cellule T diabetogeniche) con lo scopo di generare in vivo Treg specifiche, responsabili della prevenzione, ritardo della comparsa o reversione della patologia diabetica. Al fine di caratterizzare e valutare il potenziale immunosoppressivo di Treg così generate, cellule T CD4+ CD25+, dopo essere state purificate da linfonodi pancreatici di topi normali e topi NOD, saranno sottoposte ad un esame citofluorimetrico completo e analizzate per la loro azione immunosoppressiva sia in vitro sia in vivo.
L’obiettivo della UR4 è quello di valutare il ruolo della interazione tra cellule NK e DC nei meccanismi di regolazione in due condizioni di modificata risposta T adattiva: il microambiente della decidua, sito in cui viene messa in atto una “fisiologica” regolazione della risposta immune (tollerizzazione) verso il feto e lo stroma tumorale, sito in cui, invece, tale immuno-regolazione potrebbe concorrere alla patogenesi della malattia. Grazie all’allestimento di colture cellulari miste sarà valutato se e in che modo i differenti tipi cellulari (fibroblasti, cellule tumorali) e/o fattori extra-cellulari (citochine, chemochine, cataboliti del Triptofano, proteine della matrice extracellulare) presenti nei siti in cui cellule NK e DC entrano in contatto, possano influenzare tale interazione.
L’obiettivo della UR3 è di valutare il ruolo delle MSC nel supportare la crescita neoplastica sia in vitro che in vivo, favorendo la disseminazione della neoplasia, proliferando al suo interno e inibendo l’immunità antitumorale. Questo consentirà di individuare nuove strategie di ingegnerizzazione delle MSC con geni ad attività antiproliferativa capaci di inibire la crescita neoplastica in vitro ed in vivo. Per tale scopo la UR utilizzerà modelli animali in cui l’immunità antitumorale è ben definita e misurabile e la presenza di MSC ingegnerizzate possa essere monitorata. A tale scopo sarà utilizzato un modello di plasmacitoma murino (ibridoma Sp6) del quale è nota la cinetica di immunizzazione, che consentirà di valutare l’influenza in vitro ed in vivo delle MSC sull’immunità specifica T anti-tumorale. Infine sarà studiato in vitro ed in vivo il ruolo delle MSC sulle funzioni dei neutrofili e dei ligandi dei TLR nell’interazione tra neutrofili e MSC.

Come è stato sottolineato in questo studio traslazionale sulla immunoregolazione, ogni UR svolge il programma in settori paralleli e separati che prevedono inizialmente solo interazioni tra le UR soprattutto per scambio di reattivi e ‘know how’ tecnologico. Tuttavia, dato che gli studi convergono prevalentemente sul ruolo delle DC nella polarizzazione delle risposta regolatoria, è prospettabile che col progredire dello studio, potranno essere sviluppate integrazioni maggiori tra i vari partners. <<<

Risultati parziali attesi

RISULTATI FINALI ATTESI
UR1.
- Ottimizzazione delle condizioni di coltura per polarizzare cellule T naive o cellule T memoria verso differenti sottopopolazioni T effettrici o T regolatorie
- Ruolo della interazione tra i ligandi Jagged1/Delta4 su DC e Notch1 sulle T per la polarizzazione in vitro verso cellule effettrici o regolatorie
- Protocollo di espansione in vitro di cellule T effettrici e T regolatorie con la stessa specificità antigenica.
- Differente capacità regolatoria delle Treg sulle popolazioni Th1, Th2 o Th17
- Isolamento ed espansione di cellule Th2 o Th17 da BAL di pazienti allergici o da frammenti bioptici di pazienti con malattia di Crohn
- Modelli murini di asma e di flogosi cronica polmonare.
- Modelli murini di flogosi cronica intestinale
- Nuovi adiuvanti (TLR-L) capaci di deviare le risposte Th2 e Th17 in vitro ed in vivo
- Effetto in vivo della attività di cellule Treg (o Tr1) o citochine regolatorie in modelli murini di asma e di IBD
- Effetti in vivo di cellule Treg umane in topi SCID sensibilizzati con cellule Th2 o Th17 umane.

UR2.
- Profili trascrizionali di DC murine mieloidi attivate con batteri di varia origine
- Nuovi bersagli molecolari e ‘pathways’ rilevanti nella attivazione delle DC e quindi nella polarizzazione della risposta immunitaria adattiva.
- Clusters di geni coinvolti nella polarizzazione Th1, Th2, Th17 e Treg
- Fini meccanismi di attivazione dei linfociti T CD4+ da parte delle DC
- Definizioni di nuovi reagenti verso i bersagli molecolari che consentono di bloccare l’attività di geni rilevanti nella polarizzazione Th1/Th2/Th17/Treg mediata dalla DC.

UR3.
- Fenotipo delle MSC umane di origine midollare e da vari organi linfoidi,
- Modello di plasmocitoma murino (ibridoma Sp6) e possibilità di trasfettare molecole costimolatorie che ne limitano la crescita
- Meccanismo di regolazione in vitro ed in vivo indotto da MSC sulla risposta immunitaria specifica anti-tumorale.
- Molecole capaci di inibire l’effetto delle MSC e la cellula target.
- Utilizzo di MSC ingegnerizzate con geni di proteine attive contro cellule mielomatose (IFN-a)
- Effetti in vitro delle MSC sulle molteplici funzioni di neutrofili umani
- Effetto di segnali capaci di attivare i TLR delle MSC e dei neutrofili sulle attività funzionale dei neutrofili

UR4.
- Isolamento di cellule NK e DC dal tessuto deciduale
- Analisi fenotipica e funzionale di DC e NK deciduali
- Effetti della cocultura di DC-NK sulle attività funzionali dei due tipi cellulari
- Effetti del microambiente sulle coculture DC-.cellule NK
- Effetti della cocultura di cellule Tumorali e fibroblasti dello stroma tumorale sulle attività funzionali delle cellule NK ottenute da pazienti neoplastici e da soggetti sani
- Effetti delle cellule NK preincubate con cellule tumorali o fibroblasti sulla funzione di DC immature o mature derivate da SP
- Effetti della interazione DC-NK sull’espressione di recettori inibitori o attivatori delle cellule NK

UR5.
- Identificazione delle condizioni ottimali per generare Treg attraverso l’uso di chinurenine in forma di impianti sottocutanei a lento rilascio;
- Valutazione dell’effetto della combinazione di chinurenine e DC tollerogeniche “caricate” con un peptide rilevante;
- Valutazione del potenziale immunosoppressivo di Treg indotte da farmaci mediante trasferimento in topi NOD non trattati.
- Fenotipo e funzione di cellule Treg indotte in vitro con chinurenine

INTERESSE PER L’AVANZAMENTO DELLE CONOSCENZE

UR1
Il progetto sarà in grado di fornire protocolli standardizzati per derivare cellule T adattive di tipo Th1, Th2, Th17 e Treg partendo sia da cellule T naive che memoria. Questo, insieme con la possibilità di espandere dallo stesso soggetto cellule Teff e Treg con la stessa specificità, potrà offrire un rilevante vantaggio tecnologico per gli studi in vitro ed in vivo di immunoregolazione.
La possibilità di utilizzare modelli in vivo di flogosi respiratoria o intestinale consentirà di valutare il ruolo delle cellule Treg sulle varie risposte Th2 o Th17 associate a patologie. I modelli proposti di deviazione immune con citochine o con TLR.ligandi, così come i sistemi in vitro ed in vivo di immunoregolazione con cellule Treg possono aprire la strada a cocepire nuove strategie terapeutiche per allergie e IBD.

UR2
I segnali responsabili per l’attivazione di DC in condizioni fisiologiche e patologiche non sono ancora del tutto noti. Il progetto consentirà di definire i segnali di attivazione ed i pathways trascrizionali in grado di indurre in maniera efficiente una riprogrammazione genica e una corretta polarizzazione della risposta immunitaria adattiva.

UR3
Lo studio darà informazioni sulle modalità attraverso le quali il microambiente stromale interferisce con l’immunità antitumorale. Sarà anche valutato l’effetto terapeutico di MSC ingegnerizzate con trasferimento di geni per IFN-a , in un modello animale di mieloma che potrà costituisce un valido sistema di riferimento per lo studio in vivo dell’immunità antitumorale. In questo contesto si inserisce anche gli avanzamenti nella comprensione tra cellule dell’immunità innata (granulociti), MSC e immunità specifica anti-neoplastica

UR4
Un “Cross-talk” complesso ed articolato tra cellule NK e DC è stato interpretato come un nuovo meccanismo attraverso il quale l’immunità innata può influenzare la risposta specifica mediata dai linfociti T. Infatti, a seguito del contatto NK/DC, le cellule NK si attivano e sono indotte a rilasciare citochine mentre le DC acquisiscono la capacità di interagire con i linfociti T e innescare una risposta specifica di tipo Th1. Lo studio consentirà di comprendere l’influenza di differenti tipi cellulari e/o fattori extra-cellulari microambientali sull’interazione DC–NK in due situazioni speculari: nella decidua in cui vi è una “fisiologica” regolazione della risposta immune verso il feto e nello stroma tumorale dove la immunoregolazione contribuisce alla crescita neoplastica

UR5
La maggiore novità del progetto si basa sull’utilizzo dei cataboliti del triptofano (chinurenine), sia da soli che in associazione con cellule dendritiche tollerogeniche (incubate con un peptide riconosciuto da cellule T diabetogeniche) con lo scopo di generare in vivo Treg specifiche, responsabili della prevenzione, ritardo della comparsa o reversione della patologia diabetica.

POTENZIALITA’ APPLICATIVE
UR1
La principale ricaduta applicativa del progetto consiste nella disponibilità di sistemi in vitro per isolare cellule T effettrici (Teff) Th1/Th2/Th17 e T regolatorie (Treg) e di modelli in vivo per la valutazione di segnali molecolari o cellulari in grado di deviare o regolare la risposta Th2 o Th17. Questi ultimi possono costiture un punto di partenza per concepire nuove strategie terapeutiche della allergia respiratoria e delle Malattie croniche Intestinali.

UR2
La definizione dei segnali attivatori e la loro comprensione consentirà di capire come la DC è in grado di indurre diversi tipi di cellule T e quindi di orchestrare l’immunità adattativa.
Inoltre, questi studi consentiranno l’identificazione di nuovi target molecolari o di nuovi pathway cellulari importanti nel processo di polarizzazione della risposta immunitaria che possono essere manipolati a scopo terapeutico nelle patologie polarizzate in senso Th1/Th17 o Th2.

UR3
Una delle applicazioni maggiori del progetto è l’impiego di MSC ingegnerizzate come terapia cellulare mirata anti-mieloma (Sp6) murino, per poi pensare ad un possibile trasferimento in animali maggiori e quindi nell’uomo, analogamente a quanto descritto per il melanoma ed i gliomi. Questo sistema in vivo che utilizza il trasferimento genico con vettori lentivirali, comunque può costiture un modello utile per testare pannelli di molecole notoriamente attive contro le cellule di mieloma.

UR4
Lo studio permetterà di acquisire nuove conoscenze e nuovi targets terapeutici sulle interazioni funzionali tra cellule dNK e dDC, e di definire nuovi targets terapeutici per modulare (direttamente o indirettamente) la risposta T anti-tumorale.

UR5
La messa punto di procedure tollerogeniche efficaci nel diabete sperimentale potrebbe aumentare grandemente la riuscita del trapianto di insule senza dover ricorrere alle procedure standard di immunosoppressione che prevedono l’uso cronico di farmaci certamente tossici. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La regolazione delle risposte immuni verso antigeni self e non-self è un processo complesso che prevede lo sviluppo di un adeguate bilanciamento tra immunità e tolleranza.
Sulla base di studi negli animali, sono state proposte due sottopopolazioni di cellule T regolatorie (Treg) che differiscono per specificità e meccanismi effettori: le cosiddette Treg naturali (CD3+CD4+CD25high) che si sviluppano nel timo e danno vita ad una popolazione circolante di cellule specifiche per antigeni ‘self’ deputate a prevenire potenziali reazioni autoimmuni. La seconda è quella delle Treg adattive (Tr1 e Th3) che si sviluppano come conseguenza di qualsiasi risposta adattiva in particolari condizioni di esposizione di antigene e/o di costimolo da parte di cellule dendritiche (DC) (1). Sono state dimostrate nel topo e nell’uomo cellule Treg CD4+CD25+ specifiche per antigeni esogeni (2, 3, 4).
Le origini, le caratteristiche di riconoscimento e le basi molecolari della funzione soppressiva di cellule Treg umane appaiono dunque controverse, così come il loro rapporto con altre popolazioni di cellule regolatorie o di cellule effettrici.
La differenziazione delle cellule T helper nei “lineages” Th1 e Th2 è stata lungamente studiata nell’ultima decade, dimostrando che la polarizzazione verso un lineage è determinato dalle citochine microambientali prevalentemente prodotte dalle DC. Il paradigma Th1/Th2 è stato usato per spiegare le funzioni delle cellule T durante la risposta immune o nelle malattie croniche immuno-mediate. Per esempio, la risposta Th1 è stata associata a infezioni e a malattie autoimmuni organo-specifiche, mentre le cellule Th2 a infezioni parassitarie e all’atopia (5)
Negli ultimi 2 anni è stata descritta una nuova sottopopolazione di cellule T effettrici (Th17) appartenente ad un “lineage” diverso dalle cellule Th1 e Th2, coinvolta nelle alterazioni della flogosi cronica, legata alla presenza di neutrofili (6, 7). Le cellule Th17 mancano dei fattori trascrizionali delle cellule Th1 e Th2 (Tbet e GATA3) mentre richiedono RORgt come fattore di trascrizione chiave per la differenziazione (6-8). E’ stato anche dimostrato che le cellule Th17 vengono reclutate nella cute e nelle mucose per l’espressione preferenziale di recettori chemochinici come CCR4 e CCR6 che mediano la chemiotassi da parte di CCL17 (TARC) e CCL20 (Mip3a) (4, 9).
Lo sviluppo dei Th17 da cellule T naive può essere indotto nel topo dalla combinazione di TGF-beta e IL-6, mentre la IL-21 e soprattutto la IL-23 sono responsabili dell’amplificazione e stabilizzazione di queste cellule (10,11). Nel topo come nell’uomo l’induzione di cellule Th17 dipende dalla IL-23 in sinergia con la IL-1b (12). E’ da notare che la stessa citochina (TGF-b) può essere coinvolta nello sviluppo di cellule Treg e Th17 (altamente patogenetiche), suggerendo una cross-regolazione complessa per le cellule Th17 (12). Nell’uomo è stato anche dimostrato che cloni Th17 sono insensibili alle cellule Treg (4). E’ stato chiaramente dimostrato che le cellule Th17 rispondono a funghi e a patogeni extracellulari e sono rilevanti nel mantenimento dell’infiammazione. Ad esempio, possono giuocare un ruolo essenziale nella cronicizzazione dell’asma allergico e nel rimodellamento tissutale (13). Dati consolidati indicano che le Th17 sono fortemente proinfiammatorie e se riconoscono antigeni self, possono sviluppare una autoimmunità severa in vari modelli animali e nelle malattie umane (Artrite reumatoide, Sclerosi Multipla e Malattie croniche intestinali – IBD) (14,15,16).
Con l’identificazione dei linfociti effettori Th17 e con la definizione di nuove cellule e meccanismi di regolazione capaci di modulare la flogosi, la maggior parte dei risultati che sembravano acquisiti sulla regolazione delle risposte immuni devono essere rivisti. In particolare devono essere chiarite le cross-regolazioni reciproche di cellule Th1, Th2 e Th17 ed il ruolo giocato dalle DC e dalle citochine (IL-4/IL-13 e IL-12) nella fisiopatologia (specie nelle patologie allergiche e autoimmuni). Questi aspetti saranno essenzialmente studiati con sistemi in vitro and in vivo dalla UR1 in connessione con UR2 (cellule DC) e UR4 (cellule Treg e IDO).

Le DC sono divenute una cellule molto rilevante per la manipolazione del sistema immunitario con lo scopo di aumentare una risposta immune carente (malattie infettive e cancro) o di ridurla in corso di allergie, malattie autoimmuni e trapianti. Una migliore comprensione del ruolo delle DC nella polarizzazione delle cellule T, è essenziale per lo sviluppo di terapie per queste patologie. Le DC CD11c+ immature sono presenti negli epiteli della cute e nei tessuti mucosali (17, 18) e possono parzialmente maturare in risposta a patogeni con conseguente migrazione dall’epitelio ai linfonodi drenanti (19). L’attivazione operata da agenti microbici e/o la presenza di fattori derivati dai tessuti in contatto con i patogeni stessi, accellera il processo di migrazione e di maturazione. Le DC mature istruiscono i linfociti T naive a diventare T effettori specifici. La risposta adattativa ai patogeni è largamente determinata da segnali che condizionano le DC ad esprimere molecole con capacità polarizzante della risposta T. Sono ben noti alcuni fattori favorenti lo sviluppo di risposte di tipo Th1 o Th17, o Th2 (20-23) insieme a segnali che favoriscono lo sviluppo di cellule Treg come il TGF-b e IL-10 (24, 25).
Le DC immature sono in grado di discriminare patogeni attraverso l’espressione di recettori in grado di riconoscere pattern cellulari (PRR) presenti sulla loro superficie (26). Un esempio sono i recettori Toll like (TLR), i recettori C-type lectins e i recettori per il mannosio. La cascata di segnali dei TLR induce la maturazione delle DC portando ad aumento dell’immunogenicità delle cellule stesse e al priming di cellule T (27). Inizialmente si riteneva che l’attivazione dei TLRs portasse allo sviluppo di DC in grado di promuovere solo risposte Th1, mentre recentemente è stato dimostrato che DC attivate attraverso TLR2 ( e altri TLR) inducono cellule Th2 o Treg. Le DC attivate da agenti virali o batteri intracellulari inducono lo sviluppo di cellule T di tipo Th1, batteri extracellulari inducono i Th17, e le infezioni da elminti istruiscono lo sviluppo di cellule Th2 (28). Inoltre, alcuni patogeni hanno sviluppato meccanismi di evasione per evitare l’interazione con molecole in grado di condizionare le DCs (29). Infatti, in condizioni di omeostasi, alcuni microrganismi della flora batterica (ad esempio: Lactobacilli, lactococci o bifidobatteri) istruiscono le DC ad attivare Th2 o Treg (30, 31) e per questo è stato suggerito un loro utilizzo nella prevenzione delle malattie autoimmuni o delle allergie. La UR2 studierà a livello molecolare la modulazione dei segnali indotti dall’interazione tra DC e batteri interi (sia commensali che patogeni) e soprattutto quelli coinvolti nella regolazione della risposta immunitaria adattiva.

Studi di regolazione linfocitaria, indicano che il sistema immunitario usa una forma di comunicazione bidirezionale, nota come “reverse signalling”, che permette a coppie di “co-recettori“ posti su cellule adiacenti di interagire, comportandosi, in modo reciproco, da ligandi e recettori. Questo meccanismo si verifica ad esempio, per la triade di “co-recettori” CTLA-4, CD28 e B7, così da operare un signaling intercellulare bidirezionale e un condizionamento univoco di cellule T e DC (32-34). Infatti, DC murine ed umane (35) rispondono—grazie al signaling intracellulare di B7—a CTLA-4 quale ligando attivando il pathway immunoregolatorio del catabolismo del triptofano (36). Questo pathway, iniziato dall’enzima indoleamina 2,3-diossigenasi (IDO; codificato da INDO) è sotto il controllo trascrizionale degli interferoni (IFN) (37), attraverso il coinvolgimento di fattori di trascrizione non ancora ben caratterizzati appartenenti alla famiglia del NF-kB (32, 38), e questo fenomeno è spesso associato all’espressione di citochine anti-infiammatorie come la IL- 10 (39, 40). Come è stato accennato, le cellule T CD4+CD25highFoxp3+ non solo agiscono come Treg naturali o adattiva nell mantenimento della tolleranza verso il self, ma hanno anche una potenzialità nel trattamento di malattie croniche ed infiammatorie. L’ontogenesi, le proprietà e le basi molecolari per l’attività soppressiva delle cellule Treg murine ed umane sono tuttavia ancora controverse, così come la loro relazione con altre cellule regolatorie (41-44)
Il reverse signalling che nelle DC porta all’attivazione di IDO fa parte dei meccanismi effettori contatto-dipendenti delle cellule Treg naturali che esprimono CTLA-4 di superficie (45-47), conciliando il ruolo primario di IDO nella gravidanza dei mammiferi (48) con quello, più recente, delle cellule T regolatorie (49). C’è inoltre un’aumentata attenzione nei confronti di un potenziale più ampio ruolo immunomodulatorio di IDO in fisiopatologia. IDO ha infatti acquisito una ruolo centrale nella regolazione dell’omeostasi e nella plasticità del sistema immune con implicazioni in molti aspetti dell’immunopatologia (50-54). Il progetto di ricerca della UR4 ha come scopo l’ulteriore studio della natura e dei meccanismi che regolano il rapporto tra IDO e le cellule Treg (55), soprattutto in relazione all’autoimmunità in un modello sperimentale di diabete di tipo I

Un terzo sistema cellulare di regolazione delle risposte immunitarie è costituito dalle interazioni tra cellule NK e DC. Mediante esperimenti di co-coltura con cellule NK di sangue periferico e DC, sono state definite le modalità del “cross-talk” fra questi 2 tipi cellulari. Differenti sottopopolazioni di cellule NK, con peculiari proprietà funzionali, sono coinvolte con diverse modalità nel processo che va dall’induzione della maturazione delle DC fino alla induzione della risposta T specifica. Nell’uomo, le cellule NK CD56++CD16+/- producono IFN-g in risposta alle DC in corso di maturazione. In questo modo, cooperano con le DC stesse nell’indurre una risposta di tipo Th1. Mentre le cellule NK inducono la maturazione delle DC e la produzione di IL-12, eliminano nel contempo le DC con un non appropriato livello maturativo (56-58). Interagendo con le DC, le cellule NK possono giuocare un ruolo chiave nella polarizzazione della risposta specifica verso un profilo di tipo Th1. Ciò è anche suggerito dalla recente evidenza del nostro laboratorio che, in pazienti con allergia respiratoria, le cellule NK hanno una ridotta capacità a indurre la maturativo delle DC e di produrre IFN-g in risposta alle DC (59). Le modalità di interazione in vivo tra cellule NK e DC sono tuttora incerte. E’ possibile che sia modulata in maniera differente in compartimenti diversi quali i linfonodi, i tessuti periferici e i siti tumorali. Infatti il risultato di queste interazioni potrebbe dipendere dai tipi cellulari presenti e dai fattori prodotti in situ. Per verificare questa possibilità la UR5 analizzerà cellule derivate da tessuti che presentano diversi tipi di risposta immunitaria: la decidua, dove si instaura una tolleranza fisiologica verso il feto, e lo stroma tumorale, nel quale le influenze del microambiente possono indurre una tolleranza“patologica” verso le cellule tumorali.

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono precursori non-ematopoietici inizialmente descritti nel midollo osseo (60), capaci di differenziare in vitro in adipociti, osteoblasti, condroblasti, miociti (61-66), ma anche in cellule neurali (67). MSC possono essere ottenute anche da altri tessuti linfatici e non (62-64, 68). Le MSC sono negative per marcatori emopoietici ed endoteliali, ed esprimono CD105, CD73, CD106, CD44, CD90, CD29, STRO-1, CD47, CD146, CD49a, CD164, CD166 (60-64). Le MSC esprimono anche molecole di adesione, chemochine, recettori per citochine e molecole della risposta immune (MHC di classe I e II, IFN-?R) (64, 69, 70). Le MSC hanno spiccate proprietà immunoregolatorie sia in vitro che in vivo in modo MHC-indipendente (69, 70). Inibiscono la proliferazione T in risposta a stimoli policlonali o ad antigeni in linfociti T naive e memory. L’effetto inibitorio delle MSC interessa praticamente tutti le cellule effettrici immuni: cellule T CD4+ e CD8+, B, NK (69) e DC di origine monocitaria (71, 72). In vivo, le MSC prolungano la sopravvivenza di trapianti cutanei incompatibili, riducono l’incidenza di graft-versus-host disease (GvHD) se trapiantate con cellule staminali emopoietiche (73); curano la GvHD di grado IV refrattaria (70); migliorano nel topo l’encefalomielite autoimmune sperimentale (74). L’effetto immunoregolatorio delle MSC dipende sia dal rilascio di fattori solubili che dal contatto. TGF-β1, HGF, PGE2, VEGF e IDO (64, 65, 69) agiscono come mediatori. Lo stesso IFN-? induce l’effetto immunoregolatorio delle MSC sui cellule T, NK e B (65, 69). Recentemente, la UR3, in collaborazione con la UR1, ha dimostrato un ruolo importante anche per i TLR3 e TLR4 (75). Le MSC possono supportare la crescita neoplastica sia in vitro che in vivo, favorendo la disseminazione della neoplasia, proliferando al suo interno (66) e conferendo una resistenza all’immunità antitumorale (66). Il trasferimento nelle MSC di geni ad attività antiproliferativa, come IFN-β, non solo inibisce la crescita neoplastica in vitro ed in vivo, suggerendo che questo potrebbe divenire uno strumento molto efficace per una terapia mirata.
E’ chiaro che nello sviluppo tumorale, inoltre, un ruolo è sicuramente svolto anche da alcune cellule dell’immunità innata quali i neutrofili (76). Rilasciando chemochine e TNFa, i neutrofili possono indurre la maturazione e l’attivazione delle DC, che determinano proliferazione dei linfociti T e polarizzazione Th1 (77). Tuttavia, i neutrofili presenti nel microambiente tumorale possono promuovere sia l’immunosorveglianza che la progressione neoplastica, anche interagendo con altre cellule effettrici (NK). Analogamente, l’arginasi I prodotta dai neutrofili sopprime la proliferazione e la sintesi di citochine dei linfociti T, mentre la lattoferrina modula la produzione di citochine Th1/Th2. I neutrofili riconoscono i patogeni attraverso molti TLR (78) tranne TLR3, che regolano le loro funzioni in maniera ancora ignota. Dato che le MSC utilizzano TLR3 e TLR4 per la loro immunoregolazione (75), questa potrebbe costituire una nuova modalità attraverso la quale lo stroma dei tumori inibisce gli effettori dell’immunità innata.
Le molecole e i sistemi cellulari sopra esaminati, che sono responsabili di gran parte dei meccanismi di immunoregolazione, sono finemente interconnessi e, come abbiamo sottolineato, probabilmente presentano meccanismi comuni. La ricerca che viene proposta dal network di 5 gruppi (leader in questo settore), intende approfondire lo studio della soppressione in ognuno di questi modelli allo scopo di poterne condividere e verificare i potenziali meccanismi comuni. <<<