RICERCA ITALIANA     

Supramolecular complexes of sorcin in the generation and regulation of Calcium-dependent cellular functions

Università degli Studi di Siena

Abstract

Lo ione calcio è un secondo messaggero che regola diverse funzioni cellulari modulando l’attività enzimatica e l’espressione genica (Berridge, 1993). Il segnale calcio si basa sia sulla capacità di mantenere i livelli basali di Ca2+ libero nel citosol nell’ordine di 100 nM grazie all’attività di trasportatori di Ca2+ della membrana plasmatica e del reticolo endoplasmatico, sia sulla capacità di regolare gli incrementi transienti di Ca2+ nell’ordine di µM, permettendone l’ingresso dai liquidi extracellulari o il rilascio dai depositi intracellulari del reticolo endosarcoplasmatico (Pozzan et al., 1994). Elementi chiave per la trasduzione del segnale Ca2+ sono numerose proteine che si associano ad esso e che, in seguito al legame con il Ca2+, acquistano la capacità di interagire con specifiche proteine bersaglio e regolarne quindi la funzione. La maggior parte delle proteine che legano il Ca2+ contiene caratterisitici motivi “EF hands” e CaM è probabilmente la più nota.
La sorcina è una proteina di 22 KDa ubiquitaria che lega il Ca2+ appartenente alla famiglia delle proteine con cinque “EF hands” la quale, in seguito al legame con il Ca2+, subisce un cambiamento conformazionale che permette l’interazione reversibile con le proteine bersaglio. Nel cuore sorcina è implicata nella regolazione dei processi di eccitazione, contrazione e rilassamento, dove gioca un ruolo importante nella transizione tra i cicli di contrazione e di rilassamento. Sorcina ha almeno tre diverse funzioni: 1) inibisce il rilascio di Ca2+ dal SR attraverso l’inibizione di RyR2, 2) aumenta l’ingresso di Ca2+ dal citosol al SR attivando SERCA2a, 3) favorisce l’estrusione di Ca2+ attraverso il sarcolemma aumentando l’attività di NCX (Lokuta et al., 1997; Farrell et al., 2003, Seidler et al., 2003, Matsumoto et al., 2005).

Oltre a sorcina, l’attività di RyR2 è regolata da molte proteine e interattori. I risultati ottenuti nell’ultimo decennio hanno inoltre richiamato l’attenzione sulla fosforilazione come uno dei maggiori meccanismi regolatori post-traduzionali dell’attività di RyR ed è stato studiato in modo approfondito per RyR2 nelle cellule cardiache. Il legame di FKBP12.6 a RyR2 sembra contribuire alla stabilizzazione del canale e questo legame sembra essere turbato dalla fosforilazione PKA-dipendente della Ser2808 di RyR2. In accordo, nell’insufficienza cardiaca l’iperfosforilazione di RyR2 da parte di PKA indotta da stimolazione beta adrenergica cronica può risultare in aritmia (Marx et al., 2000; Ono et al., 2000; Yano et al., 2000; Reiken et al., 2003a; 2003c). Mutazioni nel canale RyR2 riscontrate in pazienti con aritmie indotte da esercizio ereditate geneticamente sembrano modificare l’affinità del canale per FKBP12.6. Queste mutazioni sembrano anche risultare in un aumento dell’attività del canale, suggerendo che canali RyR2 “leaky” potrebbero essere davvero responsabili dell’innesco in questi pazienti di aritmie cardiache fatali (Weherens et at., 2003; Marks et al 2007). Nel complesso questi dati indicano un ruolo importante degli eventi di fosforilazione nella regolazione di RyR2.
Recentemente è stato osservato che la subunità beta della caseina chinasi 2 (CK2) interagisce con sorcina (Arrigoni et al. non pubblicato). A questo proposito è interessante notare che la sequenza aminoacidica di sorcina contiene diversi siti di consenso per la fosforilazione da parte di CK2 (Pinna e Ruzzene, 1996) facendo ipotizzare che l’interazione tra sorcina e CK2 potrebbe avere una funzione regolatoria. Considerando le evidenze che indicano l’importanza del ruolo della fosforilazione nella regolazione della funzione di RyR, sarebbe importante verificare se CK2 possa avere un ruolo nella regolazione del rilascio di Ca2+ da parte di RyR2, sia indirettamente attraverso la regolazione di sorcina, che direttamente attraverso la fosforilazione di RyR2 stesso.
Questo progetto mira ad analizzare direttamente il ruolo delle interazioni di sorcina con RyR2 e con NCX e il possibile ruolo di CK2 nella regolazione delle interazioni tra queste proteine. Gli scopi principali del progetto saranno l’identificazione dei siti di legame per sorcina presenti in RyR2 e in NCX, lo studio dell’esistenza di siti di fosforilazione di CK2 in RyR2 e se e come la fosforilazione di sorcina mediata da CK2 possa influire sul legame eo sulla regolazione di RyR2.
La caratterizzazione di queste interazioni comprenderà studi strutturali e di determinazione della topologia delle interazioni, consentendo una migliore comprensione del ruolo fisiologico di sorcina nel cuore. Inoltre il progetto ha importanti relazioni d’elevato impatto clinico con rilevanti patologie cardiache e con importanti processi quali apoptosi e Multi Drug Resistance (MDR) per i quali potrebbe aprire la strada allo sviluppo di nuovi strumenti farmacologici. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Vincenzo Sorrentino Università degli Studi di SIENA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo studio di sorcina e delle sue proteine bersaglio eo interattori rappresenta un punto comune nella ricerca delle tre unità che partecipano a questo progetto. L’unità Colotti ha un’esperienza di lunga durata nello studio delle proprietà strutturali e funzionali di sorcina. Al contrario l’unità Sorrentino è nota per la ricerca sulla genetica e sulla funzione dei recettori della rianodina, e l’unità Ruzzene può fornire un supporto rilevante nello studio della fosforilazione proteica. Ci aspettiamo che, data questa formazione, l’attività coordinata delle tre unità che partecipano a questo progetto possa contribuire ad una migliore comprensione dell’interazione che avviene tra sorcina e RyR2 e tra sorcina e CK2. Saranno studiate anche le basi molecolari della formazione di sorcina-NCX. Nella regolazione della contrazione cardiaca RyR2 e NCX rappresentano interattori chiave: RyR2 è coinvolto essenzialmente nella fase di eccitazione-contrazione, e la sua apertura determina l’aumento della concentrazione citosolica di calcio, mentre NCX contribuisce maggiormente nella fase successiva di rilassamento. Poichè c’è un’interazione tra sorcina e CK2, ci aspettiamo di capire se questa interazione possa risultare nella fosforilazione di sorcina e, se questo fosse il caso, di verificare se i siti bersaglio presunti di CK2 siano effettivi e se la fosforilazione di sorcina influenzi il suo legame eo la sua attività regolatoria su RyR2.
Ci aspettiamo che le attività pianificate forniscano delle informazioni dirette per comprendere se RyR2 può essere un substrato di CK2 e portino all’eventuale identificazione dei siti di fosforilazione. Il possibile coinvolgimento di CK2 nella fosforilazione di RyR2 è di particolare interesse poichè l’iperfosforilazione di RyR2 sembra essere un modo per regolare l’attività del canale ed è stata associata a diverse patologie cardiache. La fosforilazione mediata da PKA di Ser2808 in RyR2 sembra infatti contribuire alla destabilizzazione del canale diminuendone il legame con FKBP12.6. In accordo, nell’insufficienza cardiaca l’iperfosforilazione cronica di RyR2 mediata da PKA può risultare in una chiusura incompleta del canale con conseguente perdita di Ca2+ durante la diastole, che a sua volta causa deplezione del contenuto di Ca2+ dal SR e ridotto rilascio di Ca2+ in risposta all’attivazione del recettore. (Marx et al., 2000; Marks et al., 2007). Inoltre alcune mutazioni nel canale RyR2 riscontrate in pazienti affetti da aritmie indotte da esercizio sembrano provocare una riduzione dell’affinità del canale per FKBP12.6, e indurre un aumento dell’attività del canale che potrebbe essere responsabile dell’innesco delle aritmie cardiache fatali (Weherens et at., 2003). Sebbene il ruolo della fosforilazione di RyR2 nello sviluppo della patologia cardiaca rimanga ancora da chiarire e altri elementi possano contribuire alla patogenesi della disfunzione e dell’insufficienza cardiaca (Benkuski et al., 2007; Ferrero et al., 2007), il ruolo della fosforilazione nella regolazione dell’attività del canale RyR2 è sicuramente un problema di rilievo. Se si scoprisse che CK2 è coinvolta nella regolazione sorcinaRyR2, sarebbe importante considerare la possibilità che ha CK2 di essere un bersaglio per l’intervento farmacologico, data la disponibilità di inibitori di CK2 altamente specifici e permeabili. Il rapporto tra sorcina, CK2 e RyRs nel contesto della resistenza multipla a farmaci (MDR) sarebbe anche di estremo interesse considerando lo scarso livello di informazioni sul meccanismo che porta a MDR. Poichè MDR rappresenta uno dei motivi principali di fallimento nella terapia dei tumori, anche il potenziale risvolto medico di queste implicazioni è molto elevato. <<<

Risultati parziali attesi

Lo studio di sorcina e delle sue proteine bersaglio rappresentano un punto in comune nella ricerca delle tre unità che partecipano a questo progetto. La sorcina, grazie alla costituzione dinamica di complessi, contribuisce alla regolazione di canali ionici quali i recettori della rianodina (RyR2), il canale del Ca2+ voltaggio-dipendente di tipo L, lo scambiatore Na+-Ca2+ (NCX) e la Ca2+-ATPase del reticolo sarcoplasmatico (SERCA2a) cardiaco. Complessivamente sorcina partecipa nel diminuire la concentrazione citosolica di Ca2+ agendo con almeno tre diverse modalità: inibisce il rilascio di calcio dal SR inibendo RyR2, aumenta l’ingresso di calcio dal citosol al SR attivando SERCA2a e ne favorisce l’estrusione attraverso il sarcolemma attivando NCX. La conoscenza delle basi molecolari dell’interazione di sorcina con i due canali permetterà di comprendere le alterazioni funzionali dei canali quando sono mutati. Basandoci sulle esperienze precedenti delle unità che partecipano ci aspettiamo alla fine del primo anno di avere definito le regioni importanti per l’interazione tra RyR2 e sorcina e tra il loop citosolico di NCX e sorcina.
La caratterizzazione della topologia delle interazioni sorcina-RyR2 e sorcina-NCX sarà importante per svelare i meccanismi molecolari alla base del ciclo di eccitazione-contrazione-rilassamento nei miociti. La conoscenza dei dettagli molecolari dei complessi sovramolecolari studiati avrà un impatto nella comprensione di come proteine sensore possono regolare processi fisiologici complessi come sorcina (o calmodulina) nel cuore. La caratterizzazione recente del mutante naturale di sorcina F112L conferma l’importanza di sorcina nel controllo della contrazione cardiaca. La sostituzione del residuo F112, localizzato all’estremità dell’elica D vicino ad Asp113, che lega il calcio nel terzo “EF hand”, è stata associata a cardiomiopatia ipertrofica famigliare e ipertensione, confermando l’importanza di definire la topologia delle interazioni di sorcina con RyR e con NCX per ottenere una conoscenza più approfondita nelle diverse patologie cardiache che potrebbe risultare nella comprensione dei meccanismi molecolari che ne sono alla base.

Stiamo inoltre pianificando di sviluppare una serie di esperimenti per ampliare le nostre conoscenze sull’interazione tra sorcina e CK2 e tra CK2 e RyR2. Per quanto riguarda il primo punto ci aspettiamo che alla fine del primo anno saranno definite le caratteristiche dell’interazione CK2-sorcina e che avremo i risultati sulla fosforilazione di sorcina da parte di CK2. Su questa base verrà avviato il protocollo per la produzione di anticorpi fosfo-specifici di coniglio. Un primo risultato di questa parte di studio sarà la determinazione del diverso comportamento biochimico e fisiologico di sorcina in seguito all’interazione eo fosforilazione da parte di CK2. Ci aspettiamo risultati preliminari, in termini di affinità per il calcio di sorcina e interazione con RyR2, utilizzando sorcina in presenza di subunità di CK2 (quelle importanti per l’interazione) o fosforilata in vitro da CK2. Durante il secondo anno dovremo spostare il nostro studio a modelli cellulari e ci aspettiamo risultati sull’associazione in vivo sorcina-CK2 e sulla fosforilazione di sorcina CK2-mediata; dovremo confermare gli effetti di CK2 sulla funzione di sorcina soprattutto mediante la produzione di mutanti di sorcina fosfo-mimici o la riduzione dell’espressione eo dell’attività di CK2 nelle cellule.
Per quanto riguarda l’interazione tra RyR2 e CK2, ci aspettiamo, come primo punto entro la fine del primo anno, di verificare la fosforilazione di RyR2 CK2-dipendente. La caratterizzazione biochimica e funzionale di questa interazione occuperà probabilmente la maggior parte del secondo anno, con particolare attenzione allo studio della fosforilazione di RyR2 in vivo e all’analisi del suo effetto sulla funzione di RyR2. In particolare, ci aspettiamo delle evidenze sul ruolo di CK2 (da solo o in combinazione con altre chinasi) nell’iperfosforilazione di RyR2, che spesso è riportata nell’insufficienza cardiaca. Questi risultati potrebbero fare luce sulla controversa fosforilazione di RyR2 in condizioni patologiche. Se CK2 risultasse essere coinvolto si dovrà considerare come un possibile bersaglio clinico, data la disponibilità di inibitori di CK2 che, a differenza di quanto succede per la maggior parte delle altre chinasi, sono altamente specifici (oltre che potenti e permeabili alla membrana cellulare).
La relazione tra sorcina, CK2 e RyR nel contesto della resistenza multipla a farmaci (MDR) sarà anche di estremo interesse considerando lo scarso livello di informazione sul meccanismo che porta a MDR. Nel caso i nostri risultati indicassero che CK2 è necessaria per il ruolo anti-apoptotico di sorcina (possibilmente in relazione alla sua associazione con i RyRs), sarebbe una importante scoperta nel campo ancora confuso di MDR, la cui rilevanza medica è ovvia (poichè rappresentauno dei motivi principali di fallimento della terapia dei tumori), ma della quale i meccanismi molecolari sono ancora poco chiari. Sia sorcina che CK2 sono stati trovati sovraespressi in alcune cellule MDR, ma il loro coinvolgimento esatto in questo contesto non è stato ancora chiarito; la conoscenza della loro possibile connessione potrebbe fornire nuovi elementi per superare il fenomeno MDR. Anche in questo caso l’inibizione farmacologica di CK2, già disponibile e ben nota da un punto di vista biochimico, potrebbe essere considerata come uno strumento clinico. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Ca2+ regola numerose funzioni nelle cellule eucariotiche
Le funzioni cellulari dipendenti dal Ca2+ comprendono un’ampia gamma di processi cellulari, quali secrezione, espressione genica, contrazione muscolare, fertilizzazione di oociti, divisione cellulare, apoptosi, virtualmente in tutti i tipi di cellule eucariotiche (Berridge, 2006; Rizzuto and Pozzan, 2006). E’ stato dimostrato che il Ca2+ è particolarmente idoneo ad agire come secondo messaggero e regolatore delle funzioni cellulari grazie all’elevato gradiente di concentrazione tra l’ambiente extra-cellulare ed il citosol. Questo consente cambiamenti rapidi e reversibili della sua concentrazione all’interno della cellula, una proprietà fondamentale perchè un secondo messaggero agisca in modo appropriato. Inoltre la specifica combinazione di dimensione e di carica del Ca2+ permettono il suo legame reversibile con ligandi che hanno una complessità strutturale sufficiente ad assicurare un’interazione specifica. La concentrazione citosolica di Ca2+ è regolata dal trasporto attraverso la membrana plasmatica e attraverso le membrane intracellulari. Responsabili del trasporto di Ca2+ sono numerosi canali, trasportatori, sia ATP-dipendenti che non, localizzati nella membrana plasmatica, nel reticolo sarcoplasmatico e nei mitocondri (Brini and Carafoli, 2000). Il progresso nei metodi di misurazione del Ca2+ ha rivelato che cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Ca2+ avvengono in seguito a specifici schemi spaziali e temporali. I transienti di Ca2+ possono essere organizzati in oscillazioni regolari la cui frequenza può essere modulata finemente per codificare informazioni specifiche. Inoltre gli eventi di segnale di Ca2+ possono essere confinati in regioni della cellula generando microdomini di Ca2+ che controllano diversi processi intracellulari (Berridge, 2006).

Il segnale Ca2+ richiede specifiche proteine- sensore per essere codificato
1) La famiglia delle proteine “EF-hands”
Un aspetto importante del segnale Ca2+ è rappresentato da come l’organizzazione spaziale e temporale del segnale sono tradotti all’interno delle cellule. L’informazione del Ca2+ non è normalmente trasmessa direttamente ai bersagli, ma è prima processata da proteine-sensore. Alcune di queste partecipano alla regolazione di un solo processo Ca2+-dipendente, come la troponina C nella contrazione muscolare, mentre altre non hanno un bersaglio specifico. Sono state identificate numerose proteine che legano il Ca2+, ma la classe di proteine più importante dedicata a decodificare l’informazione portata dal Ca2+ e a trasmetterla ai bersagli è rappresentata da una famiglia di proteine nota come proteine “EF hands”, che comprende circa 600 membri. Esse possono funzionare come subunità dedicate di una singola proteina o come subunità che si associano reversibilmente a diverse proteine (come CaM). Possono anche rappresentare una porzione integrale di enzimi come per esempio la calpaina (Lewit-Bentley and Rety, 2000). Queste proteine sono basate sul motivo “EF hand” caratterizzato da una struttura elica-loop-elica nella quale i 12 o 14 aminoacidi del loop tra le eliche sono in grado di legare uno ione calcio. Il successo in natura del dominio “EF hand” è legato alla sua risposta strutturale in risposta al legame con il calcio. La maggior parte delle proteine “EF hands” subisce un riarrangiamento conformazionale nel passaggio dalla forma apo alla forma holo che permette il legame di altre proteine presenti a valle nel processo di trasduzione del segnale (Capozzi et al., 2006). La sequenza canonica del motivo “EF hand” è stata riscontrata in piccole proteine (come calmodulina o S100) e all’interno di domini di complessi proteici più grandi (come miosina o calpaina). Nella maggior parte dei casi noti, i motivi “EF hands” si presentano in paia adiacenti: parvalbumina e S100 rappresentano i motivi minimi. Le proteine che contengono quattro motivi “EF hands” hanno generalmente due domini, ciascuno formato da un paio di “EF hands”(per esempio calmodulina e troponina C). Calmodulina è l’archetipo delle proteine “EF hands”; è una proteina di 17 KDa con quattro siti di legame del Ca2+ e serve da sensore del calcio in quasi tutte le cellule eucariotiche. In assenza di calcio legato la calmodulina consiste di due domini, ognuno composto da un paio di motivi “EF hands” collegati da un’elica flessibile. In seguito al legame di uno ione Ca2+ a ciascun “EF hand” avviene un cambio di conformazione che porta residui idrofobici dall’interno all’esterno. Il complesso Ca2+-calmodulina stimola un’ampia gamma di enzimi, pompe ed altre proteine bersaglio, inclusa la proteina chinasi calmodulina dipendente (CaM chinasi) che, in seguito al legame con calmodulina, può fosforilare diverse proteine. Inoltre l’enzima attivato fosforila se stesso ed è quindi parzialmente attivo anche quando la concentrazione di Ca2+ diminuisce e la calmodulina viene rilasciata dalla chinasi (Berg et al., 2002).

2) La famiglia delle proteine “penta EF hand”
La famiglia delle proteine “penta EF hand” (PEF) comprende proteine che legano il Ca2+ che hanno cinque motivi “EF hand”. Oltre alle somiglianze strutturali nella regione “EF hand”, i membri della famiglia di proteine PEF presentano caratteristiche comuni: (i) dimerizzazione attraverso EF5s C-terminale non appaiato, (ii) possesso di domini idrofobici ricchi di GlyPro all’N-terminale, e (iii) traslocazione in membrana Ca2+-dipendente. Le proteine PEF di mammifero sono classificate in due gruppi sulla base della sequenza aminoacidica: proteine PEF del gruppo I (ALG-2 e peflina) e proteine PEF del gruppo II (membri della famiglia delle proteasi Ca2+-dipendenti calpaine, sorcina e grancalcina) (Maki et al. 2002). Nelle cellule T è stato scoperto che ALG-2 è coinvolta nell’induzione dell’apoptosi in un modo Ca2+-dipendente (Vito et al., 1996). Esperimenti d’ibridazione in situ in cervello di ratto hanno rivelato livelli elevati di mRNA di ALG-2 negli strati granuloso e piramidale dell’ippocampo, nel plesso coroideo, nell’area postrema e in molti nuclei del romboencefalo. Inoltre è stato riportato che i livelli d’espressione di ALG-2 nel cervello di ratto aumentano in seguito a ischemia cerebrale focale temporanea (Li et al., 2000). Una nuova proteina simile ad ALG-2 è stata clonata ed è stata chiamata peflina (proteina PEF con un lungo dominio idrofobico N-terminale) (Kitaura et al., 1999). Le calpaine comprendono una famiglia multigenica di cisteine proteasi Ca2+-dipendenti che mediano le digestioni regolatorie di substrati specifici coinvolti in molti processi durante il differenziamento, la vita e la morte della cellula (Goll et al., 2003). Sorcina (soluble resistance-related calcium-binding protein) è una proteina di 22 KDa inizialmente scoperta come un gene amplificato nelle cellule tumorali con resistenza multipla a farmaci (van der Bliek et al., 1986). Sorcina è espressa in una grande varietà di cellule e sembra essere coinvolta nell’omeostasi del Ca2+ modulando i canali del Ca2+ (Valdivia, 1998). Infine è stato riportato che granalcina, una proteina di 28 KDa, mostra una traslocazione Ca2+-dipendente nei granuli e nella membrana plasmatica dei neutrofili, suggerendo un ruolo nei processi di fusione granulo-membrana e di degranulazione (Boyhan et al., 1992).

3) Sorcina, una proteina penta EF hand che interagisce con diverse proteine bersaglio intracellulari
Tra le proteine PEF, sorcina rappresenta il punto d’incontro degli interessi di ricerca dei tre gruppi che propongono questo progetto. Sorcina ha 5 domini di legame al calcio e può legare due ioni calcio con elevata affinità nell’ordine di ?M. Questo legame innesca cambiamenti conformazionali da una configurazione “chiusa” ad una “aperta” portando all’esposizione di una superficie idrofobica. Questo promuove la traslocazione Ca2+-mediata di sorcina da solubile (stato in assenza di calcio) a siti di membrana (stato legato al calcio) e ad interazioni bersaglio. Sorcina, oltre che per opera del calcio, sembra essere regolata anche dalla fosforilazione. Nella sequenza primaria di sorcina sono infatti presenti due siti potenziali bersaglio della PKA (S149 e S178). Tuttavia si pensa che S178 sia il sito preferenziale di fosforilazione della sorcina poichè, in esperimenti di espressione della proteina di fusione GST-sorcina in batteri, S178 è il principale sito fosforilato da PKA e defosforilato dalla proteina fosfatasi 1 (Matsumoto et al., 2005). In aggiunta alla PKA ci sono anche evidenze che suggeriscono una possibile fosforilazione di sorcina da parte della proteina chinasi CK2; recentemente sorcina è stata infatti identificata come un interattore della subunità regolatoria ? di CK2 (Arrigoni et al., submitted); inoltre, a giudicare dai siti di consenso ben noti della CK2, la sequenza primaria di sorcina contiene potenziali siti bersaglio per CK2 (Pinna and Ruzzene, 1996), che permettono di ipotizzare che avvenga una fosforilazione. Sorcina è stata originariamente identificata in cellule di mammifero selezionate per la resistenza ad un gruppo di prodotti naturali con attività antitumorale, inclusi vincristina e adriamicina (Hamada et al., 1988; Meyers and Biedler, 1981; Wang et al., 1995). Sorcina è sovraespressa in molte linee di cellule con resistenza multipla a farmaci (MDR), in alcuni casi come risultato di un’amplificazione del gene della sorcina e co-amplificazione della glicoproteina P, il marcatore di MDR (Van der Bliek et al., 1986). Sebbene non sia noto il ruolo della sorcina nello sviluppare o mantenere la resistenza a farmaci, è stato dimostrato che l’aumento d’espressione di sorcina avviene nei tumori resistenti a farmaci, suggerendo un’associazione tra sorcina e MDR (Zhou et al., 2006; Tan et al., 2003; Pareck et al., 2002; Kawakami et al., 2007). E’ stato inoltre riscontrato che sorcina partecipa a diverse vie di segnale del calcio poiché sono state identificate numerose proteine bersaglio. Effettivamente è in grado di interagire con il recettore della rianodina (RyR) (Meyers et al., 1995), con la subunità ?1 del canale del calcio di tipo L (Meyers et al., 1998), con SERCA nelle cellule muscolari (Matsumoto et al., 2005), con presenilina-2 nel cervello (Pack-Chung et al., 2000), con annessina VII (sinexina) nella midollare del surrene (Brownawell and Creuz, 1997) e nei globuli rossi (Salzer et al., 2002). Nell’insieme il muscolo cardiaco rappresenta uno degli ambienti cellulari più studiati per la regolazione e l’attività di sorcina. Sorcina si lega a RyR2 con elevata affinità ed inibisce completamente sia l’attività di canale spontanea sia quella provocata da ICa. Questi effetti possono essere alleviati dalla fosforilazione di sorcina PKA-dipendente (Farrell et al., 2003; Lokuta et al., 1997). Inoltre è stato dimostrato che sorcina può essere fosforilata anche dall’isoforma ?C di CamKII (CalciumCalmodulin-dependent protein kinase II). In modo simile a quanto osservato per la fosforilazione mediata da PKA, anche la fosforilazione mediata da CamKII abolisce l’effetto inibitorio di sorcina sul recettore della rianodina (Anthony et al., 2007). Recentemente è stata dimostrata anche un’interazione tra sorcina e la subunità ? della caseina chinasi II (Unità Ruzzene).
La sovraespressione in vivo di sorcina ha tuttavia portato a risultati contraddittori. Meyers et al. 1995 e Seidler et al., 2003 hanno riscontrato transienti di Ca2+ e contrazione inferiori (con una sovraespressione del transgene di 20 volte), mentre Suarez et al. 2004 hanno riscontrato un aumento dei transienti di Ca2+, di carico del SR e di contrattilità. E’ interessante notare che una mutazione in sorcina (F112L, una mutazione all’interno dell’elica D di sorcina) è stata proposta essere associata ad una forma ereditaria di cardiomiopatia ipertrofica e ipertensione (Valdivia et al., 2004). I miociti cardiaci ottenuti da topi transgenici che sovraesprimono la sorcina-L112 mostrano complesse alterazioni nella regolazione del Ca2+ e nella contrattilità, inclusa un rallentamento nell’inattivazione della corrente di Ca2+ di tipo L, un aumento d’ampiezza, durata e frequenza degli “sparks” di Ca2+, sebbene alterazioni significative nella funzione ventricolare e nella pressione sanguigna non siano state osservate, suggerendo che anche altri fattori potrebbero essere responsabili nell’uomo dello sviluppo di ipertrofia cardiaca e di ipertensione (Collis et al., 2007).


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