RICERCA ITALIANA     

Indicatori di resistenza alla mastite per la selezione con approccio genomico e quantitativo nei bovini e negli ovi-caprini da latte

Università degli Studi di Milano

Abstract

Abstract Italiano

Il presente progetto riguarda la ricerca di QTL (Quantitative Trait loci) e geni candidati per caratteri legati ad un aspetto della qualità del latte: la resistenza alla mastite, correlata al carattere conta delle cellule somatiche nel latte (SCC).

Il miglioramento genetico per diminuire la SCC nel latte è importante per l'industria, per i produttori che applicano sistemi di allevamento tradizionali e non (es. "biologici") e per i consumatori, che richiedono produzioni sane e a basso livello di residui.

Numerosi Paesi hanno già intrapreso ricerche per l'identificazione di QTL nei bovini e ovi-caprini e la conseguente applicazione di selezione assistita da marcatori (MAS) e da geni (GAS).

I geni responsabili della variabilità fenotipica possono essere mappati mediante studi di genome scan e, successivamente, identificati mediante l’approccio del gene candidato (GC), ovvero mediante lo studio di geni che fanno parte di processi metabolici o di traduzione del segnale che sono coinvolti nel meccanismo di espressione di un carattere.

Il progetto svilupperà conoscenza sulle basi genetiche della resistenza alla mastite nei bovini e negli ovi-caprini da latte
I QTL e i geni identificati potranno essere utilizzati nei programmi di selezione che le associazioni di razza attuano. Per i bovini sono considerate diverse popolazioni sia cosmopolite che autoctone: Frisona, Bruna, Pezzata Rossa Italiana, Reggiana, Valdostana Pezzata Rossa e Castana, Modenese, Rendena, Grigio Alpina, Burlina. La razza ovina presa in considerazione è la Valle del Belice mentre la caprina la Girgentana. Oltre a conoscenze genomiche il progetto si pone come obiettivo il rilascio di procedure per la valutazione genetica degli individui delle popolazioni autoctone con Animal Model

In particolare gli obiettivi saranno:

1) Mappare ad alta risoluzione regioni QTL che influenzano la conta di cellule somatiche (SCC) con metodologia Fractionated Pooling Desing nelle razze Frisona e Bruna Italiana e nella Pezzata Rossa Italiana.
2) Valutare le relazioni tra il contenuto in cellule somatiche (SCC) e i caratteri della produzione quanti-qualitativa del latte nelle razze Valle del Belice e Girgentana;
3) Identificare in silico geni candidati per la resistenza alla mastite preferenzialmente che mappino nelle regioni QTL già verificate nelle popolazioni risorsa di questo studio.
4) testare l’accuratezza del SCC del latte come strumento di diagnosi delle mastititi e stabilire un valore soglia da curve ROC per stimare un valore di SCC che consenta di differenziare le mammelle infette da quelle sane nella razza Valle del Belice e nella Girgentana.
5) Effettuare la stima del valore riproduttivo (EBV) per la SCC nelle razze Valdostane, Modenese Reggiana, Rendena, Grigio Alpina, Burlina, Valle del Belice e Girgentana.
6) Analisi di associazione tra aplotipi nelle regioni dei geni candidati identificati e SCC nelle razze Frisona Bruna, Pezzata Rossa Italiana, Valdostana pezzata Rossa, Castana, Reggiana, Modenese, Rendena, Grigio Alpina, Burlina, Valle del Belice e Girgentana.
7) Risequenziamento in regioni confermate dall'analisi di associazione. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Alessandro Bagnato Università degli Studi di MILANO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il progetto intende sviluppare conoscenza sulle basi genetiche della resistenza alla mastite sia nei bovini da latte che negli ovicaprini. I QTL e i geni identificati potranno essere utilizzati nei programmi di selezione che le associazioni di razza attuano. Per i bovini sono considerate diverse popolazioni sia cosmopolite che autoctone: Frisona, Bruna, Pezzata Rossa Italiana, Reggiana, Valdostana Pezzata Rossa e Castana, Modenese, Rendena, Grigio Alpina, Burlina. La razza ovina presa in considerazione è la Valle del Belice mentre la caprina la Girgentana.
Oltre a conoscenze genomiche il progetto si pone come obiettivo il rilascio alle popolazioni autoctone di procedure per la valutazione genetica degli individui con Animal Model.

Gli obiettivi particolari sono:

1) Mappare ad alta risoluzione regioni QTL che influenzano la conta di cellule somatiche (SCC) con metodologia Fractionated Pooling Desing nelle razze Frisona e Bruna Italiana e nella Pezzata Rossa Italiana.
2) Valutare le relazioni tra il contenuto in cellule somatiche (SCC) e i caratteri della produzione quanti-qualitativa del latte nelle razze Valle del Belice e Girgentana;
3) Identificare in silico geni candidati per la resistenza alla mastite preferenzialmente che mappino nelle regioni QTL già verificate nelle popolazioni risorsa di questo studio.
4) testare l’accuratezza del SCC del latte come strumento di diagnosi delle mastititi e stabilire un valore soglia da curve ROC per stimare un valore di SCC che consenta di differenziare le mammelle infette da quelle sane nella razza Valle del Belice e nella Girgentana.
5) Effettuare la stima del valore riproduttivo (EBV) per la SCC nelle razze Valdostane, Modenese Reggiana, Rendena, Grigio Alpina, Burlina, Valle del Belice e Girgentana.
6) Analisi di associazione tra aplotipi nelle regioni dei geni candidati identificati e SCC nelle razze Frisona Bruna, Pezzata Rossa Italiana, Valdostana Pezzata Rossa, Castana, Reggiana, Modenese, Rendena, Grigio Alpina, Burlina, Valle del Belice e Girgentana.
7) Risequenziamento in regioni confermate dall'analisi di associazione. <<<

Risultati parziali attesi

I risultati attesi della ricerca sono qui di seguito sinteticamente elencati con riferimento ai WP precedentemente descritti

D1.1 Una mappa ad alta risoluzione per SCC in Regioni QTL nelle razze Frisona Bruna e Pezzata Rossa Italiana. (Mese 6)
D2.1 - Una lista di geni candidati e aplotipi da testare in tutte le popolazioni risorsa. (Mese 12)
D3.1 EBV per SCC per tutti i soggetti delle popolazioni Valdostane, Modenese, Reggiana, Rendena, Grigio Alpina, Burlina, Girgentana, Valle del Belice. (Mese 6)
D3.2 Correlazioni tra SCC e caratteri produttivi negli ovi-caprini. (Mese 24)
D3.3 Validazione curve ROC come strumento di diagnosi della mastite. (Mese 24)
D4.1 Integrazione della banca di materiale biologico per le popolazioni risorsa (Mese 12)
D5.1 - Aplotipi per tutte le popolazioni nelle regioni geni candiati (Mese 16)
D6.1 - Lista di aplotipi associati a SCC e ad altri caratteri (Mese 18)
D7.1 - Identificazione di mutazioni razza-specifiche nelle regioni target (Mese 24)

I risultati sono di sicuro interesse per le popolazioni italiane dove la ricerca di geni e QTL è limitata. Un ampio avanzamento della conoscenza è garantito dalla pluralità delle popolazioni considerate e dall’approccio proposto che permette di evidenziare geni e QTL in diverse popolazioni in tempi ridotti e con risorse limitate.
Interessati e beneficiari dei risultati di questo progetto sono tutti i componenti della catena di produzione del latte: allevatori, industria del miglioramento genetico, aziende di trasformazione del latte, consumatori, e tutta la società nella sua globalità:
Le associazioni allevatori potranno veicolare ai loro associati informazioni relative ai genotipi degli animali di interesse per la selezione; gli allevatori avranno nuovi strumenti a disposizione per la selezione in azienda.
L’industria del miglioramento genetico potrà aumentare l’efficienza nella scelta dei riproduttori e diversificarne la produzione con linee genetiche dedicate al miglioramento di caratteri sanitari e nutrizionali.
Il beneficio per gli allevatori è l'accresciuta resistenza alle mastiti da parte degli animali che ha come conseguenza diretta la riduzione dei casi di mastite clinica con grande beneficio economico legato a ridotti costi veterinari, accresciuta qualità del latte prodotto e crescita della produttività in allevamento. Inoltre, conoscendo il genotipo dei loro tori rispetto alla resistenza alla mastite potranno disporre di riproduttori in grado di garantire figlie che eccellano in resistenza alla mastite clinica e sub-clinica.
L’industria di trasformazione potrà godere dei benefici che il miglioramento genetico produce nella popolazione offrendo prodotti altrimenti non disponibili. Il beneficio per le aziende di trasformazione del latte sarà la possibilità di conferire prodotti di elevata accettazione da parte del consumatore grazie al ridotto contenuto di residui antibiotici. Ciò può rendere i prodotti lattiero caseari più attraenti per il consumatore e accrescere la quota di mercato di latte e derivati rispetto agli altri prodotti alimentari. In aggiunta, la ridotta quantità di cellule somatiche nel latte ne aumenta le qualità di trasformazione, in modo particolare per i formaggi e i prodotti fermentati.
Il consumatore disporrà di prodotti (latte e derivati) a più alto valore nutrizionale e sanitario. In relazione alla riduzione dei casi di mastite attraverso il suo indicatore, conta di cellule somatiche, il beneficio per il consumatore sarà la disponibilità di prodotti lattiero caseari di gusto migliorato e durata elevata e con una ridotta probabilità di contenere residui antibiotici.

Il tempo richiesto per vedere in campo i frutti di ricerche come quella qui proposta sarà più breve quando sarà disponibile la conoscenza di un largo numero di geni associati a caratteri produttivi e funzionali: in questo caso sarà pensabile eliminare il passaggio delle prove di progenie nella selezione dei tori in inseminazione strumentale, ricaduta plausibile dato il grande sforzo della ricerca attualmente in atto. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il presente progetto riguarda la ricerca di QTL (Quantitative Trait loci) e geni candidati per caratteri legati ad un aspetto della qualità del latte: la resistenza alla mastite, correlata al carattere conta delle cellule somatiche nel latte (SCC).

-) SCC
Nell'ultimo decennio i programmi di selezione hanno aumentato in modo consistente la produzione di latte. Ciò tuttavia è stato accompagnato da un aumento di incidenza di mastiti e problemi sanitari (Kadarmideen e coll., 2000; Kelm e coll. 2000). L'SCC è un'importante parametro che viene utilizzato come indicatore della qualità del latte e dello stato sanitario della mammella (Harmon 1994): un basso SCC indica un latte di qualità, sia per l'alimentazione diretta sia per la trasformazione in formaggio (Mariani e coll. 1992); alti valori di SCC sono legati alla presenza di mastiti subcliniche o cliniche (Schutz 1994). La riduzione di SCC è un obiettivo primario poiché consente di ridurre l'incidenza di mastiti in allevamento con conseguente diminuzione dei costi di gestione per gli allevatori, di limitare i trattamenti antibiotici, i cui residui nel latte rappresentano un’importante preoccupazione per il settore industriale e l’opinione pubblica, e di accrescere la resa e la qualità dei prodotti dell'industria lattiero casearia. Gli antibiotici infatti interferiscono con i processi di trasformazione per molti prodotti lattiero caseari (formaggio e prodotti fermentati) e conferiscono a questi ultimi un sapore indesiderato riducendone il valore commerciale (es. ridotta “shelf life”).

Il miglioramento genetico per diminuire la SCC nel latte è perciò importante per l'industria, per i produttori che applicano sistemi di allevamento tradizionali e non (es. "biologici") e per i consumatori, che richiedono produzioni sane e a basso livello di residui.
Molti studi (Emanuelson e coll., 1988; Nash e coll., 2000; Nielsen e coll., 1997; Rogers e coll, 1998; Rupp eBoichard, 1999; Shook, 1989; Weller e coll., 1992) hanno esaminato la relazione tra conta delle cellule somatiche e suscettibilità alla mastite. La correlazione genetica tra questi due caratteri è circa .65/.70 nella maggior parte delle popolazioni prese in esame e l’ereditabilità per la conta di cellule somatiche tende a essere più alta di quella per la suscettibilità alla mastite clinica rendendo quindi più facile la selezione per il primo carattere.
Le moderne biotecnologie molecolari applicate alle produzioni animali nell’ultimo ventennio hanno contribuito all’acquisizione di nuove conoscenze sui meccanismi di difesa posti in essere dalla ghiandola mammaria nei confronti della penetrazione e presenza di patogeni al suo interno. In particolare è stato dimostrato che la risposta di tipo immunitario, da parte della ghiandola mammaria ad un processo infettivo, può essere determinata da meccanismi immunologici specifici e non specifici. Nelle fasi precedenti l’infezione, i meccanismi di difesa che la mammella pone in atto sono di tipo immunitario a-specifico e tra queste reazioni è stata evidenziata la produzione di peptidi ed altre proteine tra cui le defensine.
Le defensine sono dei peptidi cationici ricchi di residui di arginina e contenenti 6 residui di cisteina. Defensine sono state isolate nella ghiandola mammaria umana, bovina e ovina. I geni che codificano per le defensine possono essere potenziali marcatori della resistenza della mammella alla insorgenza di mastite.

-) Metodi di selezione
La selezione classica, basata sul modello infinitesimale, ha avuto notevole successo nel migliorare caratteri quantitativi, soprattutto nel lungo periodo e per caratteri ad ereditabilità medio-alta.
La scoperta del polimorfismo genetico a livello di DNA ha dato impulso nelle specie zootecniche a ricerche mirate ad identificare, attraverso analisi di linkage e di associazione, le regioni genomiche responsabili della variabilità genetica per caratteri quantitativi di interesse economico. La conoscenza di queste regioni cromosomiche denominate QTL (Quantitative Trait Loci) può essere utilizzata per accrescere il progresso genetico nelle popolazioni in selezione. In questo contesto, la scoperta di marcatori molto polimorfici (ed informativi) sul genoma, quali i microsatelliti, ha reso la selezione assistita da marcatori (MAS) più realistica. Mappe genetiche basate principalmente su microsatelliti sono state create nella maggior parte delle specie zootecniche. La disponibilità di mappe di linkage di media densità ha permesso di localizzare QTL in maniera sistematica (Barendse et al. 1994; Georges et al. 1995; Kappes et al. 1997), analizzando popolazioni di animali parenti con marcatori microsatelliti distribuiti ad intervalli di 10-20 cM. Oltre ai microsatelliti si può ricorrere a marcatori polimorfici più frequenti nel genoma, quali gli SNP (Single Nucleotidi Polymorphism) che sono presenti nel genoma dei mammiferi circa ogni 300-1000 nucleotidi. La recente pubblicazione della sequenza totale del genoma bovino ha messo a disposizione dei ricercatori numerosi marcatori polimorfici SNP e le relative informazioni di mappa utili in particolar modo per mappaggio di QTL e geni candidati ad alta risoluzione Negli ovini un consorzio internazionale sta sequenziando il genoma e rilascerà molto presto l’assemblaggio della sequenza. Sono già disponibili tuttavia alcuni SNP anche se l’approccio comparativo con altre specie è quello più facilmente applicabile nell’immediato.

-) Individuazione di QTL e geni nelle popolazioni di ruminanti
Numerosi Paesi hanno già intrapreso ricerche per l'identificazione di QTL nei bovini e ovi-caprini e la conseguente applicazione di selezione assistita da marcatori (MAS) e da geni (GAS). I risultati di queste ricerche riassunti in data base disponibili on-line (www.animalgenome.org) non sono utilizzabili in modo diretto nelle popolazioni italiane, perché in letteratura le famiglie con QTL interessanti vengono codificate in modo non riconoscibile e l'associazione marcatori-QTL è specifica per ogni famiglia. Nonostante ciò le informazioni disponibili possono essere utilizzate come base di partenza per verificare se gli stessi QTL sono presenti nelle popolazioni bovina e ovi-caprine italiane e identificare i geni responsabili degli effetti QTL osservati.

-) Identificazione di QTL e geni con mappaggio fine
Per procedere ad una analisi fine delle zone in cui un QTL è stato individuato è necessario ricorrere all'analisi di popolazioni con un basso livello di Linkage Disequilibrium (LD) (Lee &amp; Van Der Werf 2004). Le popolazioni zootecniche possiedono a questo riguardo caratteristiche interessanti. Infatti entro razza è presente un certo livello di LD anche tra individui con bassa parentela, dovuto all'uso di un numero ristretto di riproduttori. Persino tra individui non parenti il LD diminuisce, ma non scompare del tutto. L'analisi delle regione cromosomiche in individui imparentati e non imparentati della stessa razza può permettere la mappatura fine di un QTL e facilitare l'identificazione del gene responsabile.
Gli studi relativi al disequilibrio da linkage hanno fornito le basi per lo sviluppo di metodi di analisi finalizzati alla mappatura ad alta risoluzione di QTL e geni e alla riduzione dell’intervallo di confidenza della sua localizzazione. Tra questi sono inclusi la metodica Linkage Disequilibrium Linkage Analysis (LDLA) proposta da Meuwissen e Goddard (2000) o il Fractionated Pooling Design recentemente descritto da Korol e coll. (2007).

-) L’approccio del gene candidato
I geni responsabili della variabilità fenotipica possono essere mappati mediante studi di genome scan e, successivamente, identificati mediante l’approccio del gene candidato (GC), ovvero mediante lo studio di geni che fanno parte di processi metabolici o di traduzione del segnale che sono coinvolti nel meccanismo di espressione di un carattere.
Un GC è un gene che si suppone sia responsabile di una notevole parte della variazione genetica di un carattere. L'approccio del GC si basa sulla ricerca di polimorfismi in geni che ci si aspetta abbiano un'influenza su un carattere bersaglio, noto il loro ruolo fisiologico (anche in altre specie), la loro posizione nel genoma e il loro livello di espressione. Una volta ipotizzato il potenziale coinvolgimento di questi geni, essi vengono analizzati come pure le sequenze correlate (per esempio il promotore) per caratterizzare la struttura primaria del gene stesso e con lo scopo di trovare polimorfismi e di identificare diverse varianti o alleli.
Con questo approccio è possibile inoltre evidenziare eventuali differenze molecolari e correlarne la sequenza con il diverso fenotipo come recentemente realizzato da Khatib e coll. (2006, 2007a, 2007b). Questo approccio bene si adatta a popolazioni con effettivo numerico ridotto che possono essere portatrici di sequenze e alleli unici non identificabili nelle grandi popolazioni. Il fine è quello di identificare SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) funzionali nei geni candidati. Un sottoinsieme di SNPs potrebbe inoltre essere identificato al fine di individuare l'aplotipo più comune e di definire "blocchi di aplotipi" che possano poi essere testati nelle popolazioni di bovini e ovi-caprini da latte.


-) Associazioni tra marcatori e caratteri di interesse economico nelle Popolazioni Italiane

Nella Frisona Italiana gli studi che hanno evidenziato QTL per caratteri di interesse economico sono limitati. Recentemente Russo e coll (2004, 2005) hanno effettuato in questa razza un mappaggio completo di QTL per il carattere produzione di latte e proteina percentuale. Ad oggi in questa popolazione non è applicata selezione assistita da marcatori, tuttavia le dimensioni e la struttura di questa popolazione, che rappresenta circa i ¾ dei bovini da latte sul territorio nazionale, consentono di reperire famiglie adeguate a studi di associazione marcatori - QTL. Lo stoccaggio di materiale seminale dei riproduttori e l'applicazione di schemi di prove di progenie con un numero relativamente alto di figlie per ogni toro, fornisce un facile accesso a tutte le informazioni indispensabili per l'applicazione di Grand Daughter Design o Daughter Deisign.
Nella Bruna Italiana, gli unici risultati relativi ad associazioni tra QTL e caratteri di interesse economico sono quelli descritti e Bagnato e coll. (2007a, 2007b) e Khatib e coll (2007°). Associazioni tra QTL e caratteri produttivi (kg di latte prodotto e proteina percentuale) sono state rilevate in tre popolazioni di Bruna (Tedesca, Austriaca e Italiana) considerate come un’unica popolazione per garantire la numerosità adeguata all’applicazione dei disegni sperimentali (Daughter Deasing e Selective DNA pooling). Risultati preliminari sull’associazione con i caratteri funzionali (cellule somatiche, resistenza alla mastite) in questa razza hanno identificato diversi QTL su alcuni cromosomi.
Nella razza Pezzata Rossa Italiana un recente progetto ha considerato alcuni cromosomi per mappare QTL per il carattere MSCC e per i caratteri produttivi.
Negli ovi-caprini italiani, gli unici risultati disponibili relativi ad associazioni tra QTL e caratteri di interesse economico sono quelli riportati da Carta e coll. (2002), Barillet e coll. (2005) e Casu e coll. (2004). Alcuni QTL che influenzano sia i caratteri produttivi che i caratteri funzionali (per esempio, cellule somatiche e resistenza alle mastiti) sono stati identificati in un incrocio Sarda-Lacaune. Inoltre, associazioni tra QTL e morfologia della mammella, e tra QTL e l’emissione del latte sono state identificate. La bibliografia non riporta comunque risultati su altre razze ovi-caprine Italiane.

-Bagnato A., C. Romani, S. Fontana, S. Dubini, F. Schiavini, A. Rossoni, C. Maltecca, D. Vicario (2005). Identification of QTL for productive traits and milk somatic cell count in the Italian Simmental cattle. XVI Congresso Nazionale ASPA 2005. Abstract
-Bagnato A., F. Schiavini, A. Rossoni, C. Maltecca, M. Dolezal, I. Medugorac, J. Sölkner, V. Russo, A. Friedman, M. Soller, and E. Lipkin (2007a). A complete Genome Scan for Quantitative Trait Loci Affecting Milk Yield and Protein Percent in 3 Brown Swiss Dairy Cattle breeds. J. Dairy Sci. in press.
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